Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.  Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

A aplicação de corrente eléctrica para uma célula provoca a formação de poros na membrana da célula, por um processo denominado electroporação. Os poros permitem a passagem de uma variedade de moléculas nonpermeant através da membrana. O campo eléctrico pode ser controlada com precisão, de modo a que os poros que se formam são muito pequenas e religar-se rapidamente, com uma perturbação mínima para a fisiologia celular. Interessantemente, as células aderentes podem ser cultivadas numa lâmina de vidro revestido com óxido de índio-estanho condutora e transparente (ITO) e electroporado in situ, isto é sobre a superfície de onde elas crescem, sem ser retirado para ser electroporada em suspensão. As células podem crescer muito bem nesta superfície, e como eles estão ligados e ampliado, a observação microscópica detalhada é possível. Utilizando esta técnica, as pequenas moléculas nonpermeant pode ser introduzido imediatamente e essencialmente em 100% das células, o que faz com que esta técnica especialmente adequado para estudos sobre a activação do components de um caminho a seguir a estimulação do ligando de um receptor (revisto em ^1).

A electroporação foi usado principalmente para a introdução de ADN (também chamada electrotransfection). No entanto, a electroporação in situ pode ser valiosa para a introdução de uma grande variedade de moléculas, tais como péptidos ^2-4, oligonucleótidos, tais como ARN anti-sentido, oligonucleótidos de cadeia dupla de DNA de engodo para inibir a ligação do factor de transcrição, ou siRNA ^{3,5, 6,} nucleotídeos radioativos ^7-10, proteínas ^{11 12} ou pró-drogas ^13. Após a electroporação, as células podem ser lisadas para análise bioquímica ou fixadas e coradas com anticorpos.

O revestimento condutor de ITO é muito fina, 800-1,000Å, de modo que o crescimento celular não é perturbado pela diferença em altura das duas superfícies, como as células crescem em toda a borda do revestimento condutor. Isto oferece a vantagem de que não electropAs células podem ser cultivadas orated lado a lado com os electroporadas, para servir como controlos. A mesma abordagem pode ser usada para o exame de junções de hiato, a comunicação intercelular (CIJH), como descrito no vídeo.

Junções comunicantes são canais que ligam o interior das células adjacentes ^14. Das junções de hiato, a comunicação intercelular desempenha um papel importante na formação de tumores e metástases, enquanto que os oncogenes tais como Src suprimir CIJH ^15,16. Para examinar a CIJH um corante fluorescente, tal como amarelo Lucifer (LY) é muitas vezes introduzido em células cultivadas através de microinjecção ou raspar-carregamento ¹⁷ e a difusão do corante para as células vizinhas é observada microscopicamente sob luz de fluorescência. Estas técnicas contudo invariavelmente causar dano celular. Descreve-se agora uma técnica em que as células são cultivadas sobre uma lâmina de vidro, que é parcialmente revestida com ITO ^18. Um impulso eléctrico foi aplicada na presença de LY (ou outros corantes) cautilizando a sua penetração nas células que crescem na parte condutora da lâmina, enquanto que a migração do corante para as células adjacentes, não electroporadas foi observada microscopicamente através de iluminação de fluorescência. Para evitar as células sensíveis perturbadores que possam tender a separar da monocamada, foi concebido um conjunto que não requerem um eléctrodo a ser colocado no topo das células para aplicar a corrente eléctrica ^19. Esta abordagem oferece a possibilidade de quantificar a CIJH em ​​um grande número de células, sem qualquer perturbação detectável para o metabolismo celular, como indicado pela ausência de um efeito sobre a duração da fase G1 seguindo estimulação sérica ^12, em aumentar os níveis de fos proteína proto-oncogene (Raptis, não publicado) ou duas quinases associadas ao estresse celular, o ^porco p38 ou JNK / SAPK quinase ^1. Esta abordagem possibilitou a análise da relação entre os níveis de oncogene expressão, transformação e GJIC ^18, bem como o efeito da Src e Stat3 sobre CIJH em ​​uma variedade de tipos de células, incluindo as células cultivadas de fresco a partir de espécimes de tumor de pulmão ^{de 20-23.} Além disso, em electroporação in situ com a configuração descrita, a qual não tem um eléctrodo de topo tem sido empregue com sucesso para a demonstração de fecho das junções de hiato na diferenciação dos adipócitos, embora a adesão celular ao substrato é reduzido, nessa fase, ^19,24.

1. plaqueamento das células do Eletroporação Chambers

1. Numa capela de fluxo laminar, as células trypsinize usando uma técnica estéril, como de costume.
   NOTA: É muito importante para eliminar por centrifugação todos os vestígios de tripsina, porque eles podem prejudicar propagação das células no vidro, daí a formação de adherens e junções comunicantes.
2. Pipetar 1 mL da suspensão de células nas câmaras de electroporação estéril fornecido com o electroporador em situ (Figura 1), e em lugar de um de 37 ^o C, incubadora de CO _2.
   NOTA: A adesão celular pode ser melhorada através de plaqueamento em fibronectina, colagénio, poli-lisina ou de células e tecido adesivo (ver Tabela Materiais).
3. Quando as células formaram uma camada confluente eles estão prontos para análise CIJH.

2. Eletroporação Procedimento

Eletroporação para exame GJIC pode ser realizada fora de uma capela de fluxo laminar,uma vez que leva apenas alguns minutos. Se forem necessários tempos de incubação mais longos para uma experiência específica, em seguida, pode ser realizado inteiramente num exaustor de fluxo laminar. Em todos os casos, as câmaras onde são cultivadas as células têm de ser estéreis.

1. Prepara-se uma / ml solução amarelo Lucifer 5 mg: Dissolver 10 mg de pó de LY (fornecida com o electroporador) em 2 ml de meio de crescimento isento de cálcio. Para os experimentos que requerem tempos de incubação mais longos, filtro de esterilizar a solução e armazenar a ⁴ ° C.
2. Aspirar o meio de crescimento e lavar as células com meio livre de cálcio, tendo o cuidado para não arranhar a monocamada ou secar as células. Se as células são secas têm geralmente núcleos mais escuras e pegar LY sem electroporação. O efeito é mais pronunciado no meio do slide que está mais exposto a correntes de ar (Figura 4F).
3. Com uma pipeta de Eppendorf, pipetar a solução corante para as células (400 ul para o conjunto da câmara), na extremidade da câmara, being cuidado para não tocar a camada de células.
4. Coloque a câmara no suporte fornecido com o electroporador e aplicar um impulso de força adequada (ver discussão).
5. Aspirar cuidadosamente um pouco da solução LY. Ele pode ser reutilizada uma segunda vez para experiências menos importantes.
6. Adicionar DMEM livre de cálcio com 10% de soro dialisado.
7. Incubar as células durante 3-5 minutos na incubadora para permitir a transferência de corante através de junções de hiato.
   NOTA: A inclusão de soro dialisado, neste ponto ajuda encerramento dos poros.
8. Lavar o corante não incorporado com DMEM isento de cálcio para a observação de células vivas. Alternativamente, as células podem ser fixadas nesta fase, por meio da adição de 4% de formaldeído para o bem, em seguida, lavadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato). Em todos os casos, a lavagem deve remover todo o fundo.
   NOTA: Em experimentos preliminares para determinar as condições ideais, se a tensão é muito baixa, então é possível para permitir que as células se recuperar no incubator durante alguns minutos e electroporate mesma lâmina uma segunda vez, para economizar no custo de lâminas.

3. exame microscópico

1. Observar as células sob iluminação de fluorescência, utilizando um microscópio invertido equipado com o filtro apropriado para o corante a ser utilizado. Para Lúcifer amarelo, excitação é 423nm, emissão de 555nm, filtro VCI para um microscópio Nikon IX70.
2. Eliminar efeitos de menisco, colocando uma lamela de vidro na parte superior do poço de plástico, depois do enchimento ele para o topo com o líquido, para examinar a morfologia das células sob contraste de fase. Para melhores imagens, o poço pode ser isolada a partir da lâmina, e a lamela colocada sobre a moldura. Para as células fixas, o poço pode ser preenchido com glicerol para observação microscópica, enquanto para as células vivas, deve ser preenchido com o meio de crescimento.
   NOTA: Lavagem e fotografando é mais fácil se as células são fixadas com formaldeído após a transferência do corante (passo 2.7 acima). Se as células não sãot fixo, a fluorescência é eliminada das células dentro de aproximadamente 60 min, dependendo do tipo de célula, da tensão e da quantidade de LY introduzido enquanto em células fixas fluorescência é mantida durante várias horas. No entanto, a fluorescência ou dissipa após se desvanece O / N a incubação, até mesmo em células fixadas. Por esta razão, deve ser feita fotografias logo após a electroporação (Figura 2).

4. quantificação de comunicação intercelular

1. Fotografar as células com uma objectiva de 20x sob contraste de fase e fluorescência (Figura 3).
2. Identificar e marcar com uma estrela as células eletroporados na fronteira com a área não-electroporados (Figura 2, seta, borda eletroporação).
3. Identificar e marcar com um ponto de células fluorescentes no lado não-electroporado, em que o corante foi transferida através de junções de hiato (Figuras 3A e 3B).
4. Dividir o número total decélulas fluorescentes na área de não-electroporado pelo número de células electroporadas ao longo da borda (Figuras 3A e 3B).
   NOTA: A transferência de, pelo menos, 200 células de fronteira electroporadas contíguos é calculado para cada experiência. O valor obtido é o valor CIJH.

A Figura 2 mostra as células epiteliais de fígado de rato ²² T51B, electroporadas com LY e fotografadas sob fluorescência (painel A e B) ou de contraste de fase (C), na sequência de fixação de iluminação e de lavar roupa. No painel A, a borda da área de electroporação é marcado a vermelho. O gradiente de fluorescência para a direita da linha vermelha indica a transferência através de junções de hiato. Na Figura 3A e 3B, a quantificação da comunicação por junções de hiato é mostrado: As células na borda da área electroporadas foram identificados e marcados com uma estrela, enquanto que as células em que o corante tinha transferidas foram marcadas com um ponto. A relação mostra o número médio de células que o corante transferidos para, por célula fronteira electroporado. Neste exemplo, existem 57 pontos e 10 estrelas, ou seja, a CIJH = 5,7.

Em C e D, o transdutor de sinal e ativador de transcrição-3 (STAT3) tem sido reprimidos nas células T51B tsiRNA expressão estável través com um vector lentiviral, e isto causa uma redução na CIJH, como mostrado pela absense de transferência ^22.

Figura 1 eléctrodo electroporação e montagem deslizante. (A) Vista superior: As células são cultivadas em uma lâmina de vidro, revestido com óxido de índio-estanho condutora e transparente (ITO). Uma câmara de plástico é colada sobre a lâmina, de modo a formar um contentor para as células e LY. O revestimento é em uma linha reta no meio, formando essencialmente dois eletrodos gravadas a laser. A barragem é usado para desviar a corrente ascendente, criando assim uma transição brusca na intensidade do campo eléctrico. Para fornecer áreas não-condutores, o ITO também é gravado em dois retângulos. Atuais (setas vermelhas) do gerador de pulso flui de cada ponto de contato para o outro, através de uma estrada entre os condutores de retângulos, espalhando-se de forma diretaião paralela ao meio de barreira, em seguida, através da barragem, através do meio para o outro lado, as células electroporating em zonas paralelas à barragem. Para maior clareza, a parte da frente da câmara é removida (B) vista lateral.: A lâmina com as células que crescem no ITO revestido (verde claro) e, regiões de vidro jateado nuas são mostradas. Quando o meio de electroporação contendo LY é adicionado à câmara a um nível acima da altura da barragem, em seguida, um caminho eléctrico entre os eléctrodos (+) e (-), e as células em crescimento neste domínio, é formado. Note-se que a camada de ITO é mostrada com uma espessura exagerada para maior clareza, embora a sua espessura real (800 A) é muito menos do que a espessura das células. (C) A área de células electroporadas electroporadas e não está representada ampliada. O corante é denso perto da represa em que todas as células foram electroporadas e desaparece através da borda electroporadas, tal como a concentração enfraquece através de múltiplas junções de hiato transfers. Grandes setas mostram a direção da transferência de corante através de junções. Note-se que o tamanho ea espessura das células são exagerados para maior clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 A electroporação de T51B, células epiteliais de fígado de rato. LY foi electroporados em células de fígado de rato T51B epiteliais (leve, 12 volts). Após a 5 min. de incubação, as células foram fotografadas sob fluorescência (A, B) ou de contraste de fase (C) de iluminação. Note-se a extensa transferência através de junções, mostrado pelo gradiente de fluorescência, que se estende desde a borda da área electroporados (setas, linha vermelha em A). Ao mesmo tempo, não há dano visível para as células, uma é visto sob contraste de fase (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 A quantificação de transferência de junções de hiato. As células na borda da área electroporadas que pegou LY por electroporação (doadores de LY para as células não-electroporado) foram marcados com uma estrela. Células onde LY transferidos para junções comunicantes através foram marcadas com um ponto. Em (A) e (B), existem 57 pontos e 10 estrelas, ou seja, a CIJH = 5,7. As células em (C) e (D) não têm as junções de hiato, como mostrado pela ausência de um gradiente de fluorescência. As setas apontam para a borda da área de electroporação. Barra = 100 um.es / ftp_upload / 51710 / "target =" 51710fig3highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 células (A) T51B que foram danificadas por raspagem durante a manipulação. Estas células podem pegar LY mesmo sem electroporação e pode transferi-lo para os seus vizinhos através de junções de hiato. (B) e (C) As células danificadas por um impulso que é demasiado forte. (B) fígado de rato T51B células epiteliais foram electroporadas a configuração discreta , 20 volts. As células do lado esquerdo da linha gravada (seta) foram danificadas por electroporação. Neste caso, as células não se destacar, no entanto, um olhar mais atento sobre a fotografia de contraste de fase (painel do meio, seta branca) mostra que as células têm núcleos escuros, enquanto eles fluorescência muito fraca, se em tudo (painel superior). No entanto, a transferência ªjunções de hiato em bruto é evidente, para as células do lado direito, que não são electroporadas. A fotografia de fundo foi efectuada através da combinação de UV e iluminação de contraste de fase, a fim de facilitar a visualização do bordo de electroporação. Células epiteliais do fígado (C) T51B rato electroporadas na definição média, 30 volts. As células do lado esquerdo da linha gravada têm sido severamente danificado pelo pulso. Observe como as células têm de sair e não fluorescente. Alguns sobreviventes em torno da borda ter pego LY e parecem estar passando-o para os seus vizinhos para a direita através de junções comunicantes. Células (D) T51B eletroporados com 10 ng / ml de iodeto de propídio. Note-se a coloração intensa do núcleo (E). Domes de células epiteliais. Células T51B electroporados no ajuste leve, 15 Volts. Note-se a electroporação de células até à esquerda. No entanto, quando confluentes, as células T51B formar cúpulas que possam se soltar durante a manipulação e lavagem, e as células circundantes podem take se LY. Note-se a grande transferência de corantes. (F) Células que tenham secado pode pegar LY sem electroporation.The meio de crescimento foi removido das células e T51B células foram deixadas numa campânula de fluxo laminar, durante 30 min. LY foi posteriormente adicionada às células durante 1 min e as células foram fixadas, lavadas e fotografados em fluorescência (painel superior) ou de contraste de fase (painel inferior) iluminação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 O péptido de bloqueio de Grb2-SH2 inibe a activação mediada por EGF-Erk, em células vivas intactas. Combinação de CIJH e estudos de transdução de sinal. Seguir à ligação do ligando, um número de receptores de factor de crescimento, tais como o Factor de Crescimento Epidérmico Receptor (EGFR) são trans-fosforilada em resíduos de tirosina específicos. Estes constituem locais de ancoragem para as Src-homologia-2 domínios de transdutores de sinais, tais como Grb2, que é ligado aos GTP / PIB sos fator câmbio, que é, assim, trouxe para a membrana e ativa Ras. Isto resulta na activação da cascata de Raf / Mek / Erk e fosforilação de Erk numa sequência ^P Y ^P TE. Portanto, sondagem com anticorpos fosfo-Erk específicos pode ser uma medida de ativação do receptor de EGF. Após a fixação, as células são sondadas com um anticorpo anti-pERK (Cell Signalling), seguido por um anticorpo secundário acoplado a biotina, estreptavidina-peroxidase de cavalo-raddish e o substrato diaminobenzidina, o que dá uma cor castanho ^29. Neste experimento, a fosfopeptídea bloqueando o domínio Grb2-SH2 (PVPE ^p Y INQS) foi introduzido por eletroporação em situ into células NIH 3T3 crescimento em câmaras de eletroporação e crescimento preso em meio gasto. 5 minutos após a aplicação de impulsos, as células foram estimuladas com o EGF durante 5 min, fixa, sondadas quanto activado fosfo-ERK1 / 2 em células stainingand imunoperoxidase, a partir do mesmo campo fotografado sob campo claro (em cima) ou de contraste de fase (inferior) de iluminação. Note-se que o péptido de bloqueio de Grb2-SH2 reduziu dramaticamente o sinal de EGF, isto é, Erk fosforilação (uma área). A inibição do sinal se estende até ~ 3-4 fileiras de células adjacentes na área não-electroporados (embaralhada suporte), provavelmente devido ao movimento do Da peptídeo 1123 através de junções. Esta descoberta constitui uma prova convincente de que a inibição observada deve ser devido ao péptido, em vez de um artefacto de electroporação, uma vez que as células nesta área não receber qualquer corrente, mas adquiriu o péptido dos seus vizinhos. Ao mesmo tempo, não há nenhum efeito detectável sobre a morfologia celular comomostrado por contraste de fase. Seta aponta para a borda da área electroporado. Ampliação: 240x. Para mais detalhes e controles ver referência ^29. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As etapas críticas no protocolo

Material de electroporados
A pureza do material a ser electroporada é muito importante. Se as células são muito plana, então as concentrações mais elevadas do corante de rastreio devem ser usados ​​(até 20 mg / ml para LY) e em tais casos, a pureza é mais importante do que em células com uma forma mais esférica ^1. Além LY uma grande variedade de outros corantes ou moléculas nonpermeant têm sido empregues, tais como uma série de corantes Alexa para utilizar como sondas para canais constituídos por diferentes conexinas ^25. No entanto, os corantes, tais como brometo de etídio ou iodeto de propídio são intercalados no DNA de modo que os núcleos de fluorescência muito forte, o que faz com que a transferência de corante de quantificação mais difícil (Figura 4D). Os corantes de rastreamento deve ser preparado e lavagens realizadas em meio de crescimento isento de cálcio, por um influxo de cálcio pode interromper a comunicação por junções, bem como reduzir cell viabilidade. Todas as soluções têm de ser mantidas a ^{37 °} C antes da electroporação, o que facilita o encerramento dos poros e ^uma viabilidade.

A determinação da tensão e da capacitância óptima
A intensidade do campo eléctrico é um parâmetro crítico para a permeação celular, bem como a viabilidade. A aplicação de pulsos múltiplos tem sido demonstrado que oferecem os melhores resultados em termos de permeação e a viabilidade celular do que um único pulso. O aparelho InSitu Porator de projetos de células tem três configurações de capacidade e número de pulsos: leve (10 pulsos, 10 mS intervalo, 0,1 segundos entre os pulsos), médio (20 pulsos, 80 mS intervalo, 0,2 s entre os pulsos) e forte (50 pulsos , 120 mS separados, 0,5 s entre os pulsos), enquanto que a tensão pode ser finamente controlado de forma independente (2-45V). Na verdade, as células planas requerem tensões mais baixas do que as células transformadas, ou de um aglomerado de células com uma pequena área de adesão para o substrato (por exemplo, células de insecto Sf9), Possivelmente devido às grandes quantidades de corrente que passa através de uma célula estendida que está em contato com a área condutora maior. Para mais detalhes sobre este assunto, consulte ^1.

Potenciais problemas e solução de problemas

Se as células foram raspadas durante as manipulações, podem escolher-se o corante e sem fluorescência electroporação (Figura 4A). A quantidade de energia fornecida às células afecta a eficiência da electroporação. Se o impulso for muito fraco (isto é, muito baixa tensão e configurações de impulsos), em seguida, as células parecem normais sob contraste de fase, mas que não apresentam fluorescência, excepto, talvez, para certas células que podem ser mortos ou foram raspados durante a manipulação (Figura 4A) . Se o impulso for muito forte, em contraste de fase de células parecem ter núcleos muito escuro (Figura 4B), mas podem reter algum LY, e ainda permitir que alguma transferência de corante para as células vizinhas. Na vésperan impulsos mais elevados, as células são destruídas (Figura 4C). Tais células são lisadas, por conseguinte, eles não retêm LY e fluoresce muito pouco, se algum. Determinadas linhas de células epiteliais como estruturas forma de cúpula T51B que possam se soltar durante as mudanças de meio. As células circundantes podem então fluorescência que a tinta poderá ser transferido através de junções (Figura 4E). Exemplos de condições óptimas para a electroporação de linhas representativas são mostrados na Tabela 1.

Vantagens sobre outras técnicas e significado

Introdução de DNA
Há um grande número de protocolos de transfecção, tais como fosfato de cálcio co-precipitação ou ²⁶ diferentes tipos de lipossomas. No entanto, eles podem afetar a célula de maneiras sutis que podem ser muito importante, especialmente para estudos de transdução de sinal. Por exemplo, a fosforilação Tyr-705 do transdutor e activador de transcrição de sinaisião-3 (STAT3), que se correlaciona com a sua actividade de transcrição é dramaticamente aumentada pelo procedimento de transfecção com fosfato de cálcio, mesmo na ausência de ADN. Isto pode ser devido ao facto de o precipitado celular altera a adesão celular da caderina e acoplamento, um activador conhecido Stat3 ^27. Certos lipossomas teve um efeito semelhante, mas menos pronunciada, enquanto eletroporação ou infecção retroviral não afetou os níveis de STAT3 ^6.

A introdução de péptidos
Um método comum é a construção de um péptido de fusão com sequências que atravessam a membrana celular, tais como derivados do gene do HIV-tat. No entanto, a transferência através da membrana é um processo relativamente lento e a inibição do sinal não é tão eficaz. Para o estudo da sequência de acontecimentos que ocorrem a seguir a activação do receptor por um ligando, a capacidade para a introdução imediata de um péptido, o composto peptidomimético ou outro oferece uma importante advantage. A electroporação de um péptido de células-permeável para acelerar a sua absorção não é possível, provavelmente porque o péptido lipofílico é incorporada na membrana celular, como revelado com péptidos acoplada com FITC (Raptis, não publicado). É interessante notar que a inibição da activação de Erk por EGF, através da utilização de um péptido permeável celular bloqueando o domínio Grb2-SH2, por exemplo, é de apenas ²⁸ parcial, enquanto que a electroporação do mesmo péptido conseguida uma inibição completa do sinal ²⁹ ( Figura 5). Outras técnicas, com base em lipossomas, também existem. No entanto, eles não permitem a análise das células não tratadas lado a lado com os tratados, em conjunto com estudos de junções de hiato, que pode oferecer a manifestação mais forte possível que a inibição do sinal deve ser devido ao material a ser introduzido (Figura 5, faixa ondulada , c).

Estudos de junção Gap
Microinjeçãode corantes ou raspar-carga são geralmente empregues, mas invariavelmente introduzir danos celulares. Outra técnica, recuperação de fluorescência após a fotodegradação não é invasivo, mas requer equipamento caro e poucas células podem ser examinados de cada vez, enquanto a formação de substâncias fototóxicas pode ser um problema. O ensaio de pára-quedas é constituído por células de pré-carga com o corante de calceína AM (verde), em seguida, deixando que as células aderir sobre uma camada de células, como as junções de hiato dentro de formar 15 min-3 h. Um grande número de células podem ser tratadas desta maneira, mas a capacidade das células para formar as junções de hiato neste ensaio varia enormemente com o tipo de célula ^30.

Limitações

A voltagem requerida é mais elevado para a introdução de moléculas de maior dimensão e cargas eléctricas. Às altas tensões necessárias para a introdução de plasmídeos grandes, pode haver alguma morte celular. As tensões relativas necessárias para diferentes moléculasForam descritos anteriormente ^9,12. Apesar de descrever a eletroporação usando um aparelho de eletroporação específico, é possível que alguém com experiência com aparelhos eléctricos para torná-lo usando a descrição detalhada em ^19, ou fazer uma configuração mais simples, com um eletrodo superior acima das células, e gravar com ácidos ^1.

Direções futuras

Software foi desenvolvido para quantificar com precisão GJIC ^31. Um melhoramento adicional é o desenvolvimento de pontos quânticos que apresentam fluorescência só uma vez que estão na célula, de modo que não há necessidade de lavar o corante não incorporado. Isto evita o esforço de lavagem, enquanto que o processo pode ser observada em células vivas, não fixos, em tempo real. A introdução de peptídeos para interromper as vias de sinalização é uma abordagem poderosa para a avaliação in vivo da importância da interação identificados utilizando componentes purificados. O exame da panelacial de diferentes péptidos para inibir uma via específica é o primeiro passo importante no desenvolvimento de medicamentos peptídicos, para o tratamento de neoplasia racional.

Outros comentários

As lâminas podem ser lavadas com solução Extran®-1000 utilizando um pequeno pincel de atingir a superfície de ITO no poço, e enxaguado com água. Se as células foram fixadas sobre a lâmina, que pode ser necessária para remover os vestígios de proteínas com tripsina ou outras enzimas proteolíticas primeiro. Sulfato Dodecil de Sódio contendo detergentes deve ser evitado. Lâminas lavadas podem ser esterilizados com peróxido de gás. No entanto, é muito importante para evitar quebrar o selo do bem para o slide, porque se algum vazamento de solução LY no suporte que pode causar um curto-circuito.

The corresponding author is the inventor in a patent held by Queen’s University, which has been licensed to Cell Projects Inc. The company or the University had no influence upon the contents of the paper.

We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.