Ensaios de viabilidade para células em cultura

Os compostos terapêuticos são muitas vezes primeiro analisou in vitro com ensaios de viabilidade. Contagem de células cegos por um observador humano pode ser altamente sensível a pequenas alterações no número de células, mas não avaliar a função. Ensaios de viabilidade computadorizados, como descrito aqui, pode avaliar a estrutura e função de uma forma objectiva.

Contagens de células do manual sobre um microscópio são um meio sensível de avaliar a viabilidade celular, mas são consumidoras de tempo e, por conseguinte, caros. Ensaios de viabilidade computadorizados são caros em termos de equipamento, mas pode ser mais rápido e mais objetivo do que a contagem de células manuais. O presente relatório descreve o uso de três desses ensaios de viabilidade. Dois destes ensaios são infravermelhos e um é luminescente. Ambos os ensaios infravermelhos dependem de um Imager 16 bits Odyssey. Um ensaio de infravermelho usa a mancha DRAQ5 para núcleos combinados com a mancha Sapphire para citosol e é visualizado no canal 700 nm. O outro ensaio de infravermelhos, uma In-Cell Ocidental, utiliza anticorpos contra as proteínas do citoesqueleto (α-tubulina ou do microtúbulo associado à proteína 2) e rotula no canal de 800 nm. O terceiro ensaio de viabilidade é um ensaio luminescente utilizada para o ATP, mas que utilizam um quarto do volume recomendado para economizar no custo. Estas medições são todos linear e correlacionam-se com o número de cells chapeado, mas variam em sensibilidade. Todos os três ensaios de contornar microscopia demorado e amostrar todo o bem, reduzindo assim o erro de amostragem. Finalmente, todos os ensaios facilmente pode ser completada dentro de um dia do final da experiência, o que permite um maior número de experiências para ser executadas dentro de intervalos de tempo curtos. No entanto, todos eles contam com a suposição de que o número de células permanecem em proporção à intensidade do sinal depois de tratamentos, uma suposição de que, por vezes, não é cumprida, especialmente para ATP celular. Além disso, se as células de aumentar ou diminuir de tamanho após o tratamento, esta pode afectar a potência do sinal, sem afectar o número de células. Conclui-se que todos os ensaios de viabilidade, incluindo as contagens manuais, sofrem de uma série de ressalvas, mas que testes computadorizados de viabilidade são bem vale o investimento inicial. Usando todos os três ensaios em conjunto produz uma visão abrangente da estrutura e função celular.

O ensaio de viabilidade mais comum nas ciências biológicas envolve a contagem de células. Isto é evidenciado por uma análise das principais (mais recentes) 200 publicações que apareceram no PubMed com qualquer uma das palavras-chave "in vitro" ou "cultura" em 2013/04/29 e 2013/04/30. Dessas publicações, 23,5% usaram ensaios de contagem de células, incluindo a contagem de número de células manuais, o número de células automatizado conta com software de imagem, e azul exclusão Trypan. O ensaio vivo / morto foi utilizada em 1% destas publicações. O número de publicações com o MTT (brometo de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) para ensaio de viabilidade metabólica foi de 11%. Esta pesquisa da literatura também mostra que o número de publicações, utilizando ensaios tais como o MTT em conjunto com os ensaios de contagem de células foi de 3,5%. Apesar da tendência de usar um teste de viabilidade, por si só, avaliar a função celular em combinação com o número de células parece ser a melhor escolha para avaliar i celularntegrity. A contagem celular por si só não é suficiente, porque as células remanescentes poderão não ser funcional ou saudável, embora eles estejam presentes no poço ^1,2. Por outro lado, as medidas funcionais, tais como o ATP pode aumentar ou diminuir, na ausência de mudanças paralelas no número de células. O desacoplamento de leituras metabólicas a partir do número de células sugere que o ATP e ensaios MTT nunca deve ser usada como o único ensaio de viabilidade. No presente relatório, três ensaios de viabilidade que pesquisamos ambas as estruturas celulares e função metabólica são descritos, para uma visão mais abrangente da integridade celular de um ensaio por si só, qualquer pode pagar.

Dois dos nossos ensaios requerem um imageador infravermelho que mede a fluorescência em 700 nm e 800 canais. O ruído é baixo nos comprimentos de onda infravermelhos, levando ao aumento de sinal-para-ruído relações ^3. O gerador de imagens Odyssey que usamos tem uma gama dinâmica 4,5 log e uma profundidade de bits de 16, Translating a 2 ¹⁶ ou 65.536 tons de infravermelho. Isto pode ser contrastado de imagens a cores de 8 bits, que só oferece 2 ⁸ ou 256 tons de cor para cada comprimento de onda. Assim, a imagem de 16 bits tem resolução mais fina. Deve notar-se que as imagens de infravermelhos originais são frequentemente pseudocolored verde (800 nm) e vermelha (700 nm) em relatórios publicados para apresentação. Imageadores Odyssey são comumente usados ​​tanto para Western blot e In-Cell Westerns ^4-7. Em-Cell Westerns em células fixadas em formaldeído usar anticorpos primários contra qualquer proteína de interesse e classificá-los por sua vez, com anticorpos secundários fluorescentes infravermelhos. Esta técnica é conhecida por ser particularmente útil para terminais de fosforilação ^6. Na nossa No celular Westerns, que corar as células fixas para as proteínas do citoesqueleto α-tubulina ou a microtúbulos neuronal proteína associada 2 (MAP2) no canal de 800 nm. Estas proteínas são suficientemente abundante para originar elevadas relações sinal-para-ruído. Também manchar nossos pratos no 700nm canal para núcleos com a mancha DRAQ5 e para o citoplasma com a mancha Sapphire. Ambas as proteínas do citoesqueleto e os DRAQ5 + safira manchas assim reflectir estruturas celulares.

O ensaio terceiro viabilidade mede a função metabólica e é chamado de "celular Titer Glo." Neste ensaio baseado luciferase, os valores de luminescência estão em proporção direta com os níveis de ATP. Os ensaios de ATP são comumente usados ​​para quantificar as células viáveis ^​​8-12. No entanto, a inclusão da palavra "título" no nome do ensaio é um tanto inapropriado porque saída ATP por célula pode mudar como uma função do tratamento a toxina e é, por conseguinte, não é sempre, em proporção ao número de células ^8. Níveis de ATP também pode ser afetada por ritmos circadianos ¹³ e ¹⁴ por divisão celular e diferenciação celular ^15. No entanto, o ensaio de ATP mostrado aqui é simples de executar e útil porque o ATP é uma medida robusta de metabólicaviabilidade ^16-21, se não o número de células em si. Usando este ensaio para complementar o infravermelho no celular Westerns, portanto, produz uma visão mais abrangente da integridade celular do que qualquer um ensaio sozinha.

Um esquema dos protocolos está ilustrada na Figura 1.

1. Celular chapeamento

Células da placa em placas de 96 poços com diferentes densidades de plaqueamento (Figura 2). Para verificações de linearidade na linha de células do neuroblastoma N2a, placa 2.5k, 5k, 10k, 15k e células por poço em 3 ou 6 poços / grupo. Para verificações de linearidade em neurônios de rato primários corticais, placa de 25k, 50k, 100k e 200k células por poço em 3 ou 6 poços / grupo. Se as linhas de células primárias ou células de interesse aparência saudável em diferentes densidades de plaqueamento, a placa e cerca de a densidade celular óptima para esse tipo de célula.

Nota: No presente estudo, as células N2a foram semeadas em 100 ul de mídia e neurônios corticais primárias em 200 mL de mídia em placas que são projetados para menor evaporação. Para obter informações detalhadas sobre manipulação de células, a mídia, os soros, antibióticos e tratamentos de toxinas, consulte Unnithan et al. para N2a cells ⁸ e Posimo et al. de culturas primárias do córtex ^22.

1. 1. Repetir o chapeamento sobre uma segunda placa de 96 poços. Uma placa será ensaiada para o ATP (Figura 2A) e a outra com os ensaios de infravermelho (Figura 2B). Não se pode usar o mesmo prato para o ATP e ensaios de infravermelhos, porque as células devem ser lisadas aberto para medições de ATP intracelular.
   2. Certifique-se para a chapa, pelo menos, três poços adicionais para subtracção do fundo em ensaios de infravermelhos na densidade de revestimento óptima (coluna 2, a Figura 2B).
2. Adicionar meio sem células ou, mais barata, de água estéril para as cavidades exteriores em filas A e H e, nas colunas 1 e 12. Evite confiar em dados de poços ao longo das bordas, como viabilidade é muitas vezes menor aqui de efeitos da evaporação e temperatura media gradientes. Tais problemas com microplacas são comumente chamados efeitos de borda ^23,24. Não manter esses poços vazioporque então as linhas B e G e as colunas 2 e 11 sofrem com o efeito de borda.
   Os efeitos de borda podem ser reduzidas através da incubação de uma placa recentemente semeado à temperatura ambiente em condições ambientais antes da transferência para a incubadora de CO ₂ ^24. Além disso, um estudo recente da Carralot descreve um método de correção de matemática para microplacas utilizando uma única coluna de controle ^23. Oliver e seus colegas usaram um especialmente projetado forçado microtitulação ar placa incubadora para reduzir gradientes térmicos ^25. Se o efeito de borda é uma preocupação significativa, câmaras de estabilidade da microplaca (BT & C Incorporated) podem ser adquiridos para criar um microambiente homogêneo, com alta umidade e até mesmo gradientes de temperatura.
3. Se forem necessários mais poços do que mostrado na Figura 1, pois diluições de reagentes adicionais ou mais densidades chapeamento será testado, use os poços de ponta para o fundo subtração.
4. Espere durante a noite para fixaçãode células e ensaio da manhã seguinte, como descrito abaixo.

2. Luminescentes ATP Assay

1. Seguir as recomendações do fabricante celular Titer Glo o para a reconstituição do substrato com o tampão e para os tempos de incubação.
   1. Remover 50 ou 150 mL de mídia a partir dos 100 ou 200 mL de mídia chapeamento, respectivamente. Um pouco menos de 50 uL irá permanecer para trás no poço. Adicionar 25 ul dos reagentes (substracto mais tampão) para colunas 2-6 (Figura 2A), numa diluição de 1:2.
      Nota: Diferentes volumes de material deixado para trás após a remoção poderia diluir ou concentrar os reagentes do ensaio ATP diferencialmente através de poços. Tome cuidado para assegurar que o nível de líquido em todas as pontas de pipeta multicanal é equivalente. Medir o líquido restante em alguns poços em toda a placa com uma pipeta imediatamente antes da adição dos reagentes de ensaio do ATP para assegurar a precisão. Se existe alta variabilidade das taxas diferenciais de Evapor mídiação ao longo da superfície da placa, remover todos os meios antigos e adicionar o mesmo volume de meio fresco ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) a todos os poços imediatamente antes da adição de reagentes para o ensaio do ATP. Se as placas sofrem de níveis variáveis ​​de evaporação, tente mudar para as placas de baixa evaporação de Costar Corning. Nos últimos placas, os 60 poços interiores mostradas na Figura 2 apenas sofrem de uma média de 0,995 ± 0,41% mídia evaporação durante a noite. Existe, portanto, uma variabilidade negligenciável em volume de suporte, no momento da análise.
   2. Nas colunas 7 a 11, as linhas de B a D, ao remover a mídia o suficiente para deixar 50 ul trás, conforme detalhado acima, e adicionar 50 mL de reagentes em uma diluição de 1:1.
   3. Nas colunas 7 a 11, as linhas de E a G, deixa as células em 100 ul de meio e adicionar 100 ul de reagentes, de novo em uma diluição de 1:1. A empresa recomenda que 100 ul de reagentes devem ser diluídas 1:1 em 100 ul de meio.
      Nota: A fimpara economizar em custos, é possível cortar estas recomendações, tanto em volume quanto em diluição. No entanto, antes de fazer isso, assegurar que não reduzir a linearidade e sensibilidade do ensaio.
   4. Uma vez que um volume específico e fator de diluição dos reagentes são considerados satisfatórios, ficar com eles em todos os experimentos posteriores. Os critérios para os dados satisfatórios são descritos na secção Resultados.
   5. Reagentes reconstituídos não utilizados podem ser novamente congelados e utilizados em uma data posterior para economizar em custos. De acordo com o fabricante, os reagentes podem ser reconstituídos armazenada a -20 ° C durante 21 semanas, com a perda de ~ 3% de actividade.
2. Colocar a placa num agitador orbital durante 2 min ou um agitador de nutação durante 10 minutos. Se uma parte da placa está a ser ensaiado para uma medição diferente e não pode ser agitado, agitar o meio com simples pipetagem para cima e para baixo apenas nos poços de interesse. No entanto, as bolhas excessivas geradas durante esta etapa irá interferir com lumisaída NESCent.
   1. 10 minutos após a adição dos reagentes, transferir 60 ul de o conteúdo do poço em placas de 96 poços brancos. Valores de luminescência são mais elevados em placas brancas do que em placas claras ou pretas, porque eles refletem a luz para cima em direção ao detector.
      Nota: Em nossa experiência, as células sobrevivem melhor na baixa evaporação, placas Costar claras do que outras placas. Estas placas específicas não são vendidos com paredes brancas. Em segundo lugar, as placas opacas de paredes claras e de fundo são mais caros do que as placas completamente claros. Se alguém transfere o líquido luminescente para placas brancas, as placas brancas podem ser lavados e reutilizados, economizando o custo de usar novas placas brancas para cada experimento. Transferência de líquido é, portanto, a opção mais barata no longo prazo.
   2. Pop quaisquer bolhas de ar antes da leitura da placa com uma agulha ou, preferencialmente, com ar forçado a partir de uma lâmpada de pipeta de transferência de plástico. Ler a placa num luminómetro com um tempo de integração de 1 segundo (o recome empresands 0,25-1 seg tempo de integração como suficiente). Ler a placa de 10-12 minutos após a adição dos reagentes de ensaio do ATP. O tempo é crítico para a comparação entre os diferentes blocos, porque o sinal luminescente é transiente, com uma taxa de decomposição rápida, como mostrado por Gilbert e colegas ^26.
3. Calcule a média dos valores de luminescência das 3 ou 6 poços em cada grupo e trama como uma função do número de células em um gráfico de dispersão (ver Figura 3). Primeiro fundo subtrair valores médios de luminescência dos poços vazios apropriadas (poços 2B - 2G, poços 11B - 11D, 11E e poços - 11G) a partir de cada ponto de dados correspondente. Haverá três grupos diferentes para cada densidade de revestimento nesta experiência inicial (Figura 2A). Os níveis de ATP pode ser correlacionada linearmente com densidades celulares em um ou todos esses grupos. Prossiga com a maior diluição de reagentes que ainda dá resultados satisfatórios para economizar em custos. Os critérios para os resultados satisfatórios são descritos in seção Resultados.
   Nota: Com os meios de comunicação utilizados no presente estudo, os valores de fundo com este ensaio não são altos e é possível ignorar os poços branco. No entanto, o fabricante Promega relata diferenças de luminescência com diferentes meios de cultura. O presente estudo utiliza Hyclone Fetal Clone III, uma versão sintética do soro fetal bovino para células N2a e soro de vitelo para culturas corticais primárias. De acordo com o fabricante, o soro de vitelo diminui os valores de luminescência, mas não diminuem a sensibilidade do ensaio. No entanto, se esta é de grande preocupação, diluir os reagentes de ensaio de ATP em PBS em vez de meios de comunicação, no momento do ensaio.
   1. Se as células parecem crescer de forma desigual em colunas durante a noite, tente testando-os dentro de 6 horas de chapeamento. No entanto, ter em mente que a densidade no tempo habitual de ensaio (por exemplo, 24 horas após o tratamento) é a densidade a qual deve ser conseguida linearidade.

3. Infrared Ensaios

1. Na manhã após o plaqueamento, fixar as células na segunda placa à temperatura ambiente numa hotte. Certifique-se de usar luvas para esta etapa e dispor do fixador como lixo químico porque o formaldeído é uma substância cancerígena. Adiciona-se 4% de formaldeído e 4% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M para os meios de comunicação existente em uma diluição de 1:01. A mídia também pode ser lavado com PBS antes de fixar em full-força fixador. Qualquer técnica funciona bem.
   1. Incubar em fixador por 20 minutos e depois retire o fixador e lavar 3x em 200 mL PBS.
2. Armazenar a placa em PBS com azida de sódio a 0,2% a 4 ° C, se o teste não terá lugar no mesmo dia. Caso contrário, prosseguir com o ensaio e colocar as células em solução de bloqueio para minimizar a ligação não específica de anticorpos.
   1. Diluir o soro Odyssey bloco 01:01 peixe em PBS e adicionar 0,3% de Triton X-100 como um permeabilizador célula. Adicione solução de bloqueio suficiente, bem como Antibo primário e secundáriody soluções de modo que 35 ul pode ser pipetado para cada poço. No entanto, se uma grande quantidade de bolhas são observadas durante a pipetagem, fazer> 50 ul de cada poço, de outra forma as bolhas descem para dentro das células e anticorpos bloco de ligação. Bolhas de sabão excessivas aparecerá como uma mancha circular imaculada no meio do poço. Tente ajustar a pipeta se isso ocorrer.
   2. Incubar nesta solução de bloqueio durante 30-60 minutos à temperatura ambiente.
      Nota: 5% de albumina de soro bovino ou soro normal das mesmas espécies como o anticorpo secundário também pode ser utilizado como o bloqueio de soluções para economizar no custo do bloco de soro de peixe. Bloqueio de soluções pode afetar o desempenho do anticorpo. Assim, o bloco óptimo para cada anticorpo é melhor determinado empiricamente.
      Nota: Alguns pesquisadores colocam na célula placas ocidentais em shakers durante incubações. No entanto, isso não é necessário.
3. Faça os anticorpos primários: 1:10.000 diluição de anti-α-tubulina(Monoclonal mouse, Tabela 1) e 1:2.000 diluição para anti-MAP2 (mouse monoclonal, Tabela 1). Estes anticorpos são específicos para as proteínas de interesse nestes modelos celulares; especificidade é essencial para qualquer mancha imunocitoquímica.
   Nota: MAPA 2 é um marcador de neurônios e é apropriado para culturas neuronais / glial mistos. As culturas pós-natal mostrados aqui também contêm alguns glia (~ 25%), porque os astrócitos aparecem em primeiro lugar no dia embrionário 18, com seus números de pico no período neonatal precoce ^27,28. Não se pode distinguir entre astrócitos e neurônios na ATP e DRAQ5 + Safira ensaios. A fim de medir os neurônios e astrócitos separadamente, use MAP2 simultânea e coloração GFAP nos 800 e 700 canais nm, como descrito por Mullett e colegas ^4,29, deixando de fora DRAQ5 + Sapphire. No entanto, se todas as células na cultura desejar ser avaliada, usar um marcador pan-celular, tais como α-tubulina, β-actina, ou GAPDH.
   Nota: Estas diluições foram otimizados para o N2a e células corticais primárias e não pode generalizar para todos os modelos. Portanto, experimentar, pelo menos duas diluições de anticorpo primário, um no lado esquerdo da placa e uma no lado direito (ver Figura 2B). Alternativamente, tente 3-4 diluições de anticorpos primários em três cavidades cada. Por exemplo, a diluição recomendada na folha de inserção de anticorpo pode ser conjugada com alterações duplas. Em outras palavras, se a diluição recomendada para imunocitoquímica é 1:500, também tentar 1:250 e 1:1.000 fatores de diluição.
   1. Diluir anticorpos em 1:1 bloco Odyssey: PBS e adicionar 0,3% de Triton-X. Para poupar no custo, tentar fazer os anticorpos na solução de bloqueio, que foi aplicada às células, no passo 3.2.1, removendo esta solução no final do período de incubação. Manter as células em PBS ao fazer isto, não deve secar.
   2. Incubar em anticorpos primários ou 1-2 horas, à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Para fracamente binding anticorpos e proteínas que não são abundantes, incubações durante a noite pode ajudar a aumentar o sinal.
      Nota: Deixar, pelo menos, três poços em solução para subtracção do fundo de bloqueio a cada concentração de anticorpo secundário (poços 2B-2E e poços 2E-2G na Figura 2B). Não exponha esses poços a qualquer anticorpo primário que seja. Eles revelam a extensão da ligação não específica por o anticorpo secundário e são úteis para o cálculo de razões de sinal-para-ruído. Se existe uma preocupação de que os anticorpos secundários irão levar a elevados níveis de ligação não específica, também incluem os poços de controlo que não são expostas ao anticorpo primário ou secundário, mas recebem o mesmo número de lavagens. A diferença entre estes poços e os poços "secundário" só revelará a extensão da ligação não específica causada pelo anticorpo secundário sozinho. Em nosso teste em células de rato N2a, a intensidade do sinal com o anticorpo secundário anti-mouse sozinho foi 0,557 ± 0,032, sinal com anti-coelhoanticorpo secundário sozinho foi de 0,533 ± 0,041, o sinal sem anticorpo secundário foi 0,357 ± 0,003, e o sinal com os anticorpos primário e secundário foi de 11.867 ± 0.911. Nós, portanto, não têm observado altos níveis de ligação não específica, mesmo quando se utiliza anticorpos secundários anti-rato em células de camundongo. Existem vários fabricantes de para anticorpos secundários infravermelhos; recomendamos comprar apenas os altamente cross-adsorvidos. Note-se que a concentração de anticorpos IgG secundários podem variar, dependendo da fonte.
4. Lavar os anticorpos primários com três lavagens de 200 ul de PBS por poço, de 10 minutos cada. Os anticorpos primários podem ser salvas a 4 ° C por algumas semanas em azida de sódio a 0,2% e reutilizado até pequenas partículas ou fragmentos tornam-se aparentes quando as soluções são mantidos até a luz. Isso só é feito para economizar em custos. Se o custo não é um problema, produzir anticorpos frescas para cada uso.
5. Diluir o anticorpo secundário por 1:1.000 ou 1:2.000 em 1:1 bloco Odyssey: PBS com 0,3% de Triton X (Figura 2B). Adicionar a diluição 1:1000 para a metade superior da placa e 1:2000 para a metade inferior da placa. Estas concentrações podem ser ainda mais reduzidos para economizar em custos, mas verificar se há linearidade antes de cometer a isso.
   Nota: Certifique-se de adicionar a solução de anticorpo secundário apropriado para o fundo de poços de subtração (coluna 2 na Figura 2B).
   1. Se uma segunda proteína vai ser ensaiada em lugar de DRAQ5 + safira, células de etiquetas para α-tubulina ou MAP2 com 700 nm de cabra anti-IgG de ratinho e a segunda proteína no canal de 800 nm, com anticorpos primários a partir de outras espécies de rato. O canal 800 nm tem menos fundo do que o canal 700 nm e deve ser reservado para a proteína mais crítico de interesse.
   2. Incubar em anticorpos secundários durante 1 hora à temperatura ambiente numa gaveta, longe da luz.
6. Lavar anticorpos secundários com 3 lavagens de 200 mL PBS por poço, 10 min cada.
7. Faça as soluções DRAQ5 + Sapphire. Para o lado esquerdo da placa, diluir DRAQ5 1:10.000 (0,5 pM concentração final) e safira 1:1000 em PBS com 0,3% de Triton-X (colunas 3-6, Figura 2B). Para a metade direita do prato, diluir DRAQ5 1:20.000 (0,25 mM) e Sapphire 1:2000 (colunas 7-10; Figura 2B).
   Nota: DRAQ5 usado para ser vendido a um estoque de 1 mM em vez de um estoque de 5 mM. Alguns relatórios publicados anteriormente, portanto, utilizados 1:4000 ou 1:2.000 diluições de DRAQ5 ^8.
   1. Para poupar no custo, se duas placas estão sendo testadas simultaneamente, a mesma solução de safira DRAQ5 + pode ser utilizado em duas placas em sequência, pipetando-o para fora da primeira placa e adicionando-o à segunda. Se as mesmas soluções serão usados ​​duas vezes desta maneira, utilizar-se no prazo de um dia. Soluções DRAQ5 Diluído + Safira não pode ser salvo a 4 ° C ou congelado para uso posterior.
   2. Incubar nestas soluções durante 30 minutos à temperatura ambiente, longe fluz rom. Se o tempo é curto e os DRAQ5 + soluções Safira não pode ser reutilizado em outras placas com diferentes secundários, adicione essas manchas para as soluções de anticorpos secundários no passo 3.5 e incubar por 1 hora.
      Nota: Não adicione DRAQ5 + solução Sapphire para o fundo de poços de subtração (coluna 2 na Figura 2B) como esses poços não deve ser manchado no canal 700 nm.
8. Lavar as 3x placa com 200 ul de PBS por poço durante 10 minutos cada. Coloque azida de sódio a 0,2% em PBS, a lavagem final, se o prato vai ser coradas com outros anticorpos secundários visíveis alcance quando a imagem de infravermelhos é completa.
9. Digitalizar a placa em um Odyssey Imager. Comece a digitalizar as placas a intensidade 5 e resolução de 169 milímetros. Ou "qualidade média" ou configurações de "baixa qualidade" são suficientes. A empresa não divulga informações detalhadas filtro de excitação / emissão. No entanto, os filtros de emissão são aproximadamente 20 nm de largura e estão centradas em torno de 720 e 820 nm, de acordo com o fabricante.
   Nota: É possível digitalizar placas enquanto ainda molhado como pesquisadores podem querer continuar a manchá-las com outros marcadores. No entanto, a empresa sugere em seu protocolo on-line que placas secas resultam em menos bem-bem propagação do sinal. Se você digitalizar os dois molhada e depois seca para comparar os dados, certifique-se de remover todo o PBS do bem, porque sais remanescentes após a evaporação pode levar a alta fluorescência de fundo ao longo das bordas.
   1. A Odyssey Imager verifica-se e através da parte inferior da placa. As placas de diferentes fabricantes podem exigir diferentes deslocamentos de foco porque o fundo das cavidades pode variar na sua espessura e profundidade na placa. Tente digitalizar em deslocamentos diferentes de foco e ver onde a maior relação sinal-ruído e mais nítida (a maioria em foco) sinal é alcançado: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 milímetros. Tentar também para medir a profundidade do poço a partir do fundo de uma placa com uma régua para confirmar a findings no Odyssey. Lembrar que o plástico na parte inferior do poço, pode adicionar a altura adicional para as medidas da régua. As placas Costar utilizados no presente estudo exigir um deslocamento de 4,0 milímetros foco.
   2. Use a função Ocidental Em-Cell no software para colocar a grade do tamanho certo para a imagem da placa e exportar os dados para o Microsoft Excel. Examine os valores "integrados intensidade" dos mesmos poços em diferentes deslocamentos de foco para encontrar os mais altos valores de fluorescência. O deslocamento de foco que produz a maior relação sinal-ruído (sinal em poços imunoistoquímica versus "não controlo negativo primárias" poços) é o único a escolher a seguir.
   3. Uma vez que se deslocar o foco é decidido, digitalize novamente em incrementos menores. Por exemplo, se o sinal mais brilhantes era de 3,5 e 4,0 mm, tente digitalizar a 3,6, 3,7, 3,8, e 3,9 mm e ver se há qualquer melhoria adicional na intensidade do sinal. Se o deslocamento foco está errado, intensidades de sinal através das 12 colunas em uma pl vazioComeram (quando todas as colunas devem ter sinal de igual) aparece como uma curva em forma de U, em vez de uma linha plana. Se isto continua a ser um problema com placas de plástico, tente placas com fundo de vidro.
10. Subtrair a média das intensidades integradas nas subtração de fundo de poços (Figura 2B; poços 2B - 2D ou poços 2E - 2G) de cada ponto de dados correspondente nos 700 e 800 nm canais. Em seguida, calcule a média das intensidades de sinal integrados para cada grupo de poços. Plotar os dados como um gráfico de dispersão contra densidade celular (veja a Figura 3).
    1. Comparar os resultados das duas diferentes diluições de anticorpos primários e secundários e os resultados das duas diluições diferentes de DRAQ5 + safira para resolver em uma diluição de cada para as experiências subsequentes. Se linearidade não é alcançado, tente digitalizar em uma intensidade diferente. Digitalize novamente com intensidades 3 e 7 em vez de 5 e reanalisar os dados. Se os dados melhorar em uma dessas intensidades masainda não são satisfatórios, examinar novamente em incrementos em torno dessa intensidade.
    2. Tenha cuidado para não analisar as imagens onde o software mostra manchas brancas nos poços; esses pontos significam sinal saturado para fora do alcance do gerador de imagens. Digitalizar em uma intensidade menor se isso ocorrer.
    3. Se linearidade não é alcançado, tente também para fixar as células dentro de 6 horas de chapeamento, pois eles podem crescer ou morrer de forma desigual em diferentes colunas durante a noite. Além disso, tente diferentes densidades de revestimento, diferentes intensidades de digitalização, otimizações adicionais de fatores de diluição de reagentes, placas com fundo de vidro, DRAQ5 por si só como uma mancha só de núcleo, ou diferentes do que outros anti-α-tubulina ou anti-MAP2 anticorpos.

O factor limitante da velocidade nestas experiências é a coloração de infravermelhos, como o ensaio de ATP é relativamente curta duração. Para os ensaios de infravermelhos, prevemos que oito placas de 96 poços pode ser corada e digitalizado no prazo de um dia após escalonamento dois lotes de quatro placas de cada (ver Figura 1). Esta estimativa assume 20 min de fixação, 30 min de lavagem, 30 min de bloqueio, 2 horas de incubação do anticorpo primário seguido por 30 min de lavagens, 1 hora de incubação anticorpo secundário seguido por 30 min de lavagens, 30 min DRAQ5 + Sapphire seguido por 30 min de lavagens, e 34 min de tempo de varredura para 4 placas. Quinze minutos adicionais são tidos em conta a Figura 1 para lavagens, a fim de explicar a pipetagem escalonada em quatro pratos individuais. Tempo para análises de dados não está incluído nesta estimativa. Se as medições de ensaio ATP irá ocorrer em paralelo para cada placa de infravermelho, doze placas podem ser testados em um dia - seis para a mancha de infravermelhos e seis para os níveis de ATP.

Critérios de dados satisfatórios nas análises de regressão (Figura 3), como indicado na secção de protocolo, incluem uma correlação significativa entre a densidade do revestimento e a intensidade do sinal (dois p atado ≤ 0,05). O tamanho das mudanças na luminescência ou sinal infravermelho também devem estar em proporção com as mudanças no número de células. Idealmente, as células 5k deve ter cerca de metade da luminescência ou níveis de ATP de células 10k, 15k e células devem ter cerca de 50% maiores valores de 10K células, etc. Esta proporcionalidade reflecte a sensibilidade do ensaio e é distinta do valor de R ² ou coeficiente de determinação. R ² apenas medidas quão bem a linha de regressão aproxima os verdadeiros pontos de dados. Mesmo que os dados são lineares, as alterações relativas na intensidade do sinal não pode ser proporcional ao tamanho das alterações no número de células. Isto pode acontecer wuando a linha de regressão tem um elevado ^R2 mas uma inclinação baixa, sugerindo que o teste não é muito sensível. Assim, os critérios de correlação significativa e da proporcionalidade dos dados deve ser satisfeita tanto. Finalmente, alterações na intensidade do sinal em torno da densidade de revestimento ideal deverá cair dentro da gama dinâmica do instrumento e do ensaio. A faixa dinâmica é a relação entre os maiores e os menores valores possíveis. O gerador de imagens Odyssey tem um alcance dinâmico 4,5 log e sinal saturado mostra-se como uma cor branca brilhante no lugar da imagem vermelha ou verde de costume, a fim de alertar o pesquisador que os resultados não são quantificáveis. A faixa dinâmica durante o próprio ensaio é mais estreito por causa de questões como a máxima e densidade de revestimento mínima para qualquer tipo de célula dada. Se um placas em aumento da densidade de células, a curva de saturação para estes ensaios irão revelar as densidades de revestimento acima do qual há outras diferenças podem ser resolvidas, ou porque eles estão fora degama do gerador de imagens ou porque as células não sobrevivem a aglomeração durante a noite. Da mesma forma, se uma placas diminuindo densidades celulares, pode-se medir as densidades celulares mínimas, abaixo do qual não há mais alterações no sinal. A gama dinâmica do ensaio inclui apenas as densidades de plaqueamento entre o número máximo de células / cavidade que pode ser resolvido e mínimo. Nós não medimos o intervalo dinâmico para estes ensaios particulares porque nossas células não sobrevivem bem em densidades além daqueles que são relatados.

Após optimização, que agora corar as células de neuroblastoma de rato N2a com anti-α-tubulina, a uma diluição de 1:10.000, com IgG anti-rato a uma diluição de 1:2000, e com soluções de DRAQ5 + safira em 1:20.000 e 1:2.000, respectivamente. Nós também utilizar 25 ul dos reagentes para o ensaio de ATP, em 50 ul mídia. Os resultados sob estas condições são ilustrados nas Figuras 3A, B, e C e foram publicadas antes da suae ^8. A intensidade do sinal em todos os três ensaios foi significativamente correlacionada com o número de células por poço. Embora todos os três ensaios foram altamente linear, eles não foram equivalentes em sensibilidade. Por exemplo, as células 5k por poço não têm exactamente metade da quantidade de coloração de infravermelhos como 10k células por poço. Em contraste com os ensaios de infravermelhos, o ensaio do ATP foi mais sensível a alterações na densidade do revestimento. Em outras palavras, luminescência caiu por cerca de metade de 10k a 5k e de 5k para 2.5k células por poço. Apesar destas conclusões sobre a maior sensibilidade do ensaio ATP, é melhor para realizar todos os três ensaios para a viabilidade de obter um quadro mais amplo de saúde celular.

Nós agora manchar as culturas neuronais primárias de ratos com anti-MAP2 a uma diluição de 1:2000, com anticorpo anti-IgG de rato a uma diluição de 1:1000, e com soluções de DRAQ5 + safira em 1:10.000 e 1:1.000, respectivamente, e utilizam 25 ul dos reagentes de ensaio de ATP em 50 ul mídia (Figuras3D, E e F). A intensidade do sinal no DRAQ5 + ensaio Sapphire foi o menos linear de todos os três ensaios, porque havia pouca diferença entre 100k e 200k células por poço no canal 700 nm. No entanto, a força do sinal em 700 nm foi bem em proporção ao número de células abaixo 100k células por poço e nós sempre placa culturas neuronais em 100k células por poço de qualquer maneira. Todavia, também observamos que o DRAQ5 + ensaio de safira não é tão sensível à toxina tratamentos como os dois outros ensaios (ver abaixo). Em contraste com DRAQ5 + Sapphire, a força do sinal estava em melhor proporção com densidades de revestimento, tanto para o MAP2 e ensaios de ATP. Deve notar-se que um maior volume dos reagentes de ensaio de ATP pode melhorar os resultados em 200k células por poço. Em outras palavras, a saída luminescente pode ser levantada para exactamente 200% dos valores em 100k células por poço, porque há mais reagente. No entanto, nunca chapa culturas corticais em que uma alta densidade de revestimento para experiments. Nós também descobrimos que os níveis de ATP e MAP2 são sensíveis a 20% mudanças na densidade do revestimento neocortical neuronal, que variam a partir de células por poço 20k 120k a ²² células por poço. No entanto, outros pesquisadores devem testar estes ensaios em seu próprio laboratório em vez de usar as condições ideais de nossos experimentos devido à variabilidade inter-laboratório em tecido e manipulação celular.

A fim de ilustrar a utilidade destes ensaios seguintes tratamentos com toxinas, que mostram as curvas de dose-resposta de células N2a tratados com MG132, um inibidor de proteassoma (Figura 4). MG132 foi aplicado, na presença ou ausência da glutationa precursor N-acetil-cisteína. Esses dados também podem ser encontrados em nossa recente publicação sobre os efeitos protetores da N-acetilcisteína ^30. As células foram analisadas 48 horas após os tratamentos MG132. MG132 dependente da dose diminuiu o sinal de DRAQ5 + Safira (Figuras 4A, D) e o sinal da tubulina-α ( Figuras 4B, E). Foi realizada uma análise de regressão não-linear para extrair os valores de _IC50 na ausência ou na presença de N-acetil-cisteína. A equação utilizada foi Y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((lógica _50-X) * hillslope))). O valor de IC ₅₀ para o DRAQ5 + safira foi de 1,64 uM MG132 (lógica ₅₀ = 0,22 ± 0,03, R ² = 0,9477, Colina declive = -1,26) e para os níveis de tubulina-α foi de 1,96 uM MG132 (lógica ₅₀ = 0,29 ± 0,04, P ² = 0,9296, Encosta encosta = -1,349). N-acetil-cisteína deslocou as curvas para a direita, o que sugere que mais MG132 foi necessária para matar as células na presença deste composto protector. Na presença de N-acetil-cisteína, o valor de IC ₅₀ para o DRAQ5 + safira foi 4,64 uM MG132 (lógica ₅₀ = 0,67 ± 0,05, R ² = 0,8732, Colina declive = -1,06) e para α-tubulina foi de 6,35 uM MG132 ( Lógica ₅₀ = 0,80 ± 0,04, R ² = 0,8802, Encosta encosta = -1.382). Um estudo de células N2a de Madeira e colegas relataram perda de aproximadamente 50% de viabilidade em 10 mM MG132, como medido pelo ensaio de MTT ^31. Fioriti relataram perda de 60% ​​da viabilidade de 4 horas após o tratamento com 50 uM MG132, novamente com o ensaio MTT ^{de 32.} Finalmente, Zhang e seus colegas relataram perda de 60% ​​de viabilidade em 10 mM MG132, através da contagem de núcleos Hoechst corados ^33. Esses IC ₅₀ valores são maiores do que a nossa. No entanto, nós ensaio para a viabilidade de 48 horas após o início do tratamento, ao contrário destes estudos anteriores.

De acordo com o ensaio celular Titer Glo, os níveis de ATP foram levantadas em baixas concentrações de MG132 (Figura 4C), o que demonstra que os níveis de ATP não estão necessariamente na proporção título celular após tratamento. Os dados de ATP, no entanto, são úteis na medida em que ilustram que o N-acetil-cisteína, também protege a função metabólica, quando as células são tratadas com N2a MG132. Isto é evidenciado em tele deslocar no valor de IC ₅₀ de MG132 com N-acetil-cisteína. O valor de IC ₅₀ para o ATP foi de 3,05 uM MG132 (lógica ₅₀ = 0,48 ± 0,07, R ² = 0,8616, Colina declive = -1,0) com veículo e 9,12 uM MG132 com N-acetil cisteína (lógica ₅₀ = 0,96 ± 0,04, R ² = 0,9261, Encosta encosta = -1,0). Note-se que as concentrações que levaram a aumentos na ATP, foram excluídos desta análise. Incluindo todos os valores da análise de reduzido coeficiente de determinação e aumentou os valores de IC ₅₀ para 4,03 uM MG132 (lógica ₅₀ = 0,61 ± 0,09, R ² = 0,7224, Colina Inclinação = -1,4) na presença de veículo e 9,24 uM MG132 (lógica ₅₀ = 0,96 ± 0,07, R ² = 0,6607, Colina Inclinação = -2,1) na presença de N-acetil-cisteína (contraste com a Figura 4C).

Um segundo exemplo destes três ensaios é ilustrada por culturas primárias na Figure 5. O tecido foi microdissecado do neocórtex de rato e allocortex, dissociados, plaqueadas a 100 mil células por poço, e tratado em paralelo com H ₂ O _2. Nós testamos a hipótese de que estas duas regiões do cérebro que diferem em sua movimentação de estresse oxidativo como são diferencialmente vulneráveis ​​a doenças neurodegenerativas ^34-39. Alguns destes dados foram publicados antes e os resultados são discutidos no estudo que ^22. Os valores de _IC50 para o DRAQ5 + safira eram 22,84 uM _de H ₂ O ₂ em neocórtex (lógica ₅₀ = 1,36 ± 0,07, R ² = 0,7552, Colina declive = -0,95) e 24,63 uM _de H ₂ O ₂ em allocortex (lógica ₅₀ = 1,39 ± 0,03, R ² = 0,9379, encosta = -1,74). Os valores de IC ₅₀ para MAP2 eram 11,66 uM _de H ₂ O ₂ em neocórtex (lógica ₅₀ = 1,07 ± 0,04, R ² = 0,9332, Colina declive = -2,13) ​​e 29,76 mM H ₂ O ₂ em allocortex (Lógica ₅₀ = 1,47 ± 0,04, R ² = 0,8934, Encosta inclinação = -4,45). Os valores de _IC50 para o ATP era 23,82 uM _de H ₂ O ₂ em neocórtex (lógica ₅₀ = 1,38 ± 0,03, R ² = 0,8907, Colina declive = -2,56) e 44,5 ^ M _de H ₂ O ₂ em allocortex (lógica ₅₀ = 1,65 ± 0,03 , R ² = 0,9204, Encosta inclinação = -2,71). Allocortex foi significativamente mais resistentes ao stress oxidativo que neocórtex, em concentrações de H ₂ O ₂ abaixo de 50 uM, mas o DRAQ5 + ensaio de safira foi o menos sensível no que ilustra esta diferença. Isso pode refletir que este ensaio não pode distinguir glia de neurônios, ao contrário do MAPA 2. Como mencionado anteriormente, as culturas contêm alguns glia, como eles são colhidas a partir de cérebro pós-natal ^22. Surpreendentemente, a altas concentrações de H ₂ O ₂ (75 ^ M e acima), quando todos MAP2 ^{+ Neurônios parecia estar morto, o DRAQ5 + ensaio Sapphire revelou que allocortex era menos resistente do que o neocórtex. Com base em nossos resultados preliminares que GFAP + astrócitos nestas culturas mais resistentes à H ₂ O ₂ de MAP2 + neurônios (não mostrado), é possível hipotetizar que os astrócitos neocorticais são menos vulneráveis ​​a danos oxidativos do que os astrócitos allocortical. Este padrão pode ser refletida no + ensaio Sapphire DRAQ5 mas não o ensaio de ATP, porque os astrócitos oxidativa danificados não são metabolicamente viáveis. Seja qual for a razão para esses padrões impressionantes, estes dados cultura primária são ilustradas aqui apenas para revelar que os ensaios não são sempre de acordo.}

Finalmente, a fim de ilustrar a variabilidade intraplaca com todos os três ensaios, nos traçados de pontos de dados em bruto dos segundo e terceiro dos poços a partir das curvas de resposta de dose acima mencionados nas Figuras 6A-C e I-6G >. De igual modo, a fim de ilustrar a variabilidade Interplate, foram plotados a média de pontos de dados em bruto (a média dos poços em triplicado) a partir de duas placas nas Figuras 6E e F-6J-L. A intensidade do sinal em poços replicar e através experimentos independentes exibiu correlações significativas para todas as medidas. Houve alguma variabilidade em valores brutos em todo experimentos independentes em culturas primárias de neurônios, talvez porque reutilizar anticorpo velho e soluções DRAQ5 + Safira e recongelar ensaio ATP não utilizados reagentes um par de vezes. Outra razão para a variabilidade Interplate maior em culturas primárias podem ser a própria qualidade da cultura. Diferentes intervalos pós-morte e manipulação de tecidos em diferentes dias experimentais podem contribuir para a variância.

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Ilustra a Figura 1. Esquemático de todos os três ensaios de viabilidade de (A) e linha de tempo para os ensaios de infravermelhos (B). Mostram-se os procedimentos recomendados para células N2a. Se a solução de DRAQ5 + safira não vão ser reutilizada em outras placas que são coradas com anticorpos secundários diferentes, eles podem ser combinados com a solução de anticorpo secundário anti-rato para um final de 1 hr de incubação, reduzindo o procedimento em um passo. clique aqui para ver a imagem maior.

Formato de placa Figura 2. De ensaio de ATP (A) e os ensaios de infravermelhos (B) que estão descritos na secção de procedimentos. EmboraPlaca de 96 poços é ilustrado, estes ensaios podem ser adaptados para outros formatos, como por exemplo placas de 384 poços, para economizar em reagentes e células. clique aqui para ampliar.

Figura 3. Regressões lineares para os três ensaios de viabilidade de células de neuroblastoma de ratinho (N2a A, B, C) ​​ou de ratos pós-natais neurónios neocorticais primárias (D, E, F). A intensidade do sinal para cada ensaio são representados como uma função de densidade de revestimento. Inserções mostram imagens representativas de infravermelhos do DRAQ5 + Safira (A, D), α-tubulina (B), ou MAP2 (E) mancha. Os valores de intensidade primas estão listados abaixo de cada imagem. Note que os valores brutos emuma cavidade individual pode ser diferente a partir da média de 3 cavidades para que a experiência e a partir da média de 3-4 experiências independentes. As imagens infravermelhas originais foram pseudocolored vermelho (700 nm) ou verde (800 nm). Cada experimento foi realizado em poços triplicados e repetiu 3x para DRAQ5 + Sapphire em ambas as células N2a e neurônios primários, 3x por α-tubulina, 4x para MAP2, 3x por ATP em células N2a, e 4x de ATP nos neurônios. Os dados a partir de poços em triplicado foram ponderadas para um valor final de cada um de 3-4 experiências. A média e SEM de 3-4 estes valores finais é mostrado no gráfico. Observe que os valores DRAQ5 + Sapphire apresentam desvios baixo padrão para que bares SEM não são visíveis. O coeficiente de determinação e dois valor p cauda avaliar a significância da correlação R ² também são ilustradas para cada medida. Os dados foram analisados ​​em GraphPad Prism (versão 5.0). Reproduzido de Neuroquímica Internacional, 61, por Unnithum et al: "Rescue a partir de um modelo de alto rendimento dois hit da neurodegeneração com N-acetilcisteína", p 356-368, com permissão de Elsevier. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4. Protecção das células N2a contra toxicidade MG132. Células N2a foram tratados com as concentrações indicadas do inibidor do proteassoma MG132, na presença ou ausência do antioxidante N-acetil-cisteína (NAC, 3 mM). Todos os três ensaios de viabilidade foram realizados 48 horas mais tarde. Note-se a elevação dos níveis de ATP em baixas concentrações de MG132 (C). Sem aumento paralelo DRAQ5 + Sapphire coloração (A) or α-tubulina (B) era aparente. Imagens infravermelhas representativas do DRAQ5 + Sapphire e manchas tubulina-α foram pseudocolored vermelho e verde em D e E, respectivamente. Cada experimento foi realizado em poços triplicados e repetiu 4x para DRAQ5 + Sapphire, 4x para α-tubulina, e 3x para ATP. Os dados a partir de poços em triplicado foram ponderadas para um valor final de cada um de 3-4 experiências. A média e SEM de 3-4 estes valores finais é mostrado. * P ≤ 0,05 para a comparação de N-acetilcisteína contra água, correção de Bonferroni seguinte ANOVA de duas vias. Os dados foram analisados ​​em GraphPad Prism (versão 5.0). Reproduzido da Neurociência, 255, por Jiang et al: "N-acetilcisteína atenua proteotoxicity em um choque maneira dependente da proteína calor", p 19-32, com a permissão de Elsevier. Clamber aqui para ver imagem ampliada.

Figura 5. Vulnerabilidade diferencial das culturas neocortical e allocortical à toxicidade peróxido de hidrogênio. Microdissecações de motor primário e pós-natal neocortex sensorial e de allocortex entorrinal e piriforme foram dissociadas e semeadas a 100k células por poço. No dia 2 in vitro, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de H ₂ O _2. As placas foram analisadas 48 horas mais tarde. Note-se que allocortex sobrevive estas condições de cultura melhor do que neocórtex e tem o número de células mais elevadas na linha de base. Cada experimento foi realizado em poços triplicados e repetiu 4x para DRAQ5 + Sapphire, 3x para MAP2 e 6x de ATP. Os dados a partir de poços em triplicado foram ponderadospara um valor final para cada um de 3-6 experimentos. A média e SEM de 3-6 estes valores finais é mostrado. * P ≤ 0,05 para a comparação dos neo-versus allocortex, correção de Bonferroni seguinte ANOVA de duas vias. Os dados foram analisados ​​em GraphPad Prism (versão 5.0). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 6. Correlações Intraplate e Interplate para MG132 e H ₂ O ₂ curvas de resposta de dose em células N2a e neurônios corticais. Todas as experiências individuais foram realizadas em poços em triplicado. Os dados brutos a partir do segundo dois poços dentro de cada grupo foram plotados como replica 1 e 2 para medir a reprodutibilidade no interior das placas (A, B e C para as células N2a e G, H, I e para o córtex). Os dados dos mesmos grupos em dois experimentos independentes (a média dos poços triplicados) foram plotados como chapa 1 e chapa 2 para medir a reprodutibilidade através de placas (D, E, e F para as células N2a e J, K, L para o córtex). O coeficiente de determinação e dois valor p cauda avaliar a significância da correlação R ² também são ilustradas para cada medida. Os dados foram analisados ​​em GraphPad Prism (versão 5.0). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Verificou-se que a intensidade do sinal em todos os três ensaios de viabilidade é linear e correlacionada com a densidade do revestimento. No entanto, nem todos os ensaios são igualmente sensíveis a 2 vezes ou alterações de 1,5 vezes na densidade de revestimento. Para células N2a, os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis do que o ensaio de ATP, particularmente a densidades mais baixas do chapeamento. Embora os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis que o ATP, os DRAQ5 + Safira ensaios e ensaios α-tubulina estão de acordo em que eles revelam o impacto altamente protetor de N-acetilcisteína. Houve perda da dose de resposta do sinal infravermelho, com ambos os ensaios e todas as três curvas de viabilidade foi deslocado para a direita com a N-acetil-cisteína. Esta sobreposição não é sempre observada para todos os tipos de tratamentos de células N2a, como os α-tubulina e ensaios de ATP parece ser mais sensível a compostos tais como o cloreto de amónio do que o ensaio de safira + DRAQ5 (ver Figura 4 em Unnithan et al. ⁸ ). Assim, a viabilidade phenotypes nem sempre são igualmente representados por todos os três ensaios. Embora o ensaio ATP estava em melhor proporção ao número de células N2a banhados do que a α-tubulina e DRAQ5 + ensaios Sapphire, a suposição de que a força do sinal reflete o número de células nem sempre foi cumprida após tratamento com toxina. Os níveis de ATP aumentou a concentrações de toxina que não provocam um aumento semelhante no sinal em ensaios de infravermelhos. Estes dados revelam mudanças metabólicas compensatórias em células N2a em resposta à inibição do proteassoma e são úteis em seu próprio direito. O ATP curva de dose-resposta em forma de U é característica do fenómeno chamado hormesis. Hormese é definida como reações biológicas favoráveis ​​para exposições de baixo nível para as toxinas e outros estressores ^40-42.

Para os neurônios, o DRAQ5 + Sapphire mancha foi menos sensível do que o MAP2 e ensaios de ATP em altas densidades de revestimento. No entanto, o DRAQ5 + safira, MAP2, e ensaios de ATP são bem na proporção cenúmero ll em neurônios corticais primárias igual ou inferior a 100k células por poço. Nós placa neurônios em 100 mil células por poço. Os neurônios de córtex não são conhecidos para replicar e, portanto, estávamos mais preocupados com a linearidade em 100k ou mais baixas densidades de revestimento. O ensaio + safira DRAQ5 foi menos sensível às diferenças entre neocórtex e allocortex que qualquer MAP2 ou ATP em concentrações inferiores a 50 uM _de H ₂ O _2. Além disso, os níveis de ATP não caiu tão dramaticamente sobre H ₂ O ₂ tratamento como sinal infravermelho nos outros dois ensaios, talvez novamente sugerindo aumentos compensatórios na produção de ATP. As discrepâncias entre os três ensaios em células N2a e neurônios primários podem refletir que as funções celulares pode mudar antes de estruturas anatômicas bruta são afetados, e que as estruturas celulares, incluindo proteínas do citoesqueleto, pode ser afetado muito antes de as células estão se perderam. Dados recentes sobre ensaios de viabilidade multiplex por Gilbert e colegas convincenteilustrar que as diferentes medidas de viabilidade, como coloração nuclear Hoechst e medições ATP produzir informações sobre as características celulares específicos que apenas parcialmente e, indiretamente, refletem viabilidade como um todo ^26. Recomendamos, portanto, realizando todos os três ensaios ao mesmo tempo e não depender de um único ensaio para a viabilidade metabólica como muitas publicações fazem. Para mais informações sobre qualquer uma destas medidas, recomendamos contagem de células individuais e, em seguida, avaliar a expressão da proteína do citoesqueleto e os níveis de ATP, em função do número de células.

Embora haja outros ensaios de viabilidade metabólica, tal como o MTT, a vantagem do ensaio de ATP reside na sua sensibilidade e gama dinâmica. O ensaio de MTT pode subestimar o número de células viáveis ​​em comparação com medições de ATP e exibe um IC ₅₀ que é duas vezes mais elevada ^43. Além disso, Petty e colegas relataram que o ensaio poderia ATPdetectar o limite inferior de 1563 células por poço, enquanto que o ensaio de MTT não podia detectar menos de 25k células / poço ^12. A razão sinal-para-ruído (o sinal a partir de poços com células vivas contra os poços sem células) é de apenas 7 para MTT mas 230 para o ATP ^44. Outra vantagem de ensaios luminescentes de ATP mais MTT é que o tempo de incubação é muito mais curto. Além disso, o ensaio de MTT da Promega custa 0,28 centavos de dólar por bem enquanto o celular ensaio Titer Glo do mesmo fabricante custa 0,09 centavos de dólar por bem em nossos diluições recomendadas. No entanto, existem limitações para todos os ensaios metabólicos; actividade metabólica pode ser desacoplada da sobrevivência, especialmente durante a necrose. Se esta é uma preocupação, os ensaios do presente relatório podem ser combinados com medições de libertação de lactato-desidrogenase para determinar a perda de integridade da membrana. Isso não envolve quaisquer placas adicionais, como medições de lactato desidrogenase são feitos simplesmente no meio extracelular.

Embora apresenta-se nestes ensaios como alternativas à contagem manual sobre o microscópio, este último pode ser um meio muito sensíveis e precisos do número de células de amostragem, se realizado correctamente. Na verdade, espera-se que a contagem de núcleos Hoechst-manchadas seria mais sensível a pequenas alterações no número de células N2a que o DRAQ5 + ensaio Sapphire. Quando todos os ensaios de falha do teste de linearidade, contagens manuais são essenciais. Um bom exemplo disso é o nosso modelo de astrócitos primários cultivados, em que realizamos o manual mais trabalhoso conta ^45. No entanto, os preconceitos inerentes de contagem manuais devem ser tidos em conta na interpretação dos dados de contagem de células, assim como as falhas inerentes de ensaios computadorizados não deve ser posto de lado. Uma série de pontos fortes e fracos de ensaios de viabilidade são, portanto, descritas a seguir.

Primeiro, se DAPI ou Hoechst manchas são empregados, os núcleos encolhidas e condensados ​​são muitas vezes designados comoapoptótica ^1. No entanto, o tamanho da célula e condensação de núcleos se encontram ao longo de um continuum homogêneo. Em contraste, a vida ea morte são fenômenos mutuamente excludentes, binários. A menos que sejam observados dois grupos muito distintos de células vivas ou morrendo, parece melhor para contar todas as células abaixo um diâmetro nuclear limiar como apoptose com software de imagem como MetaMorph ou ImageJ em vez de olho. Claro, a escolha de um diâmetro limite é arbitrária porque não sabemos em que ponto uma cascata apoptótica irreversível é iniciada. Além disso, por definição, até mesmo células com caspase 3 ativado não são necessariamente a caminho de morte e talvez devesse ser contado como ainda vivo, no momento da fixação ^46. Nossos ensaios infravermelhos evitar tais preocupações, tratando todas as células que estão ligados à placa no momento da fixação como ainda vivem. Apenas células que flutuou para longe são contados como mortos. Isto coloca as células em qualquer uma das duas categorias distintas e evita as armadilhas do uso de um complex, função contínua como diâmetro nuclear.

Em segundo lugar, as contagens manuais tipicamente provar uma pequena fração de todo o bem. Isso pode levar a um viés de amostragem e, na ocasião, altos erros padrão da média. Com os nossos ensaios de viabilidade, todo o bem é amostrado para ATP e perto de todo o bem é amostrado com os ensaios de infravermelho. Este padrão de amostragem aumenta o tamanho da amostra e evita a decisão, por vezes arbitrária de onde no poço para tirar uma fotografia para contagens manuais. Se as fotos são tiradas do centro do poço, deve-se ter em mente que esta região é onde o off-lavar a maioria das células ocorre, levando a potenciais superestimativa de toxicidade. Em contraste, os ensaios de infravermelhos lançar uma grade sobre a imagem da placa de 96 poços que exclui apenas os cantos extremos dos poços. Se assim for desejado, os cantos dos poços pode ser incluído, aumentando o diâmetro dos círculos na grade.

Em terceiro lugar, o fotógrafo eo contador de células ambos devem ficar cego durante as contagens manuais. No entanto, uma vez que as células são tratadas com as toxinas, que muitas vezes assumem alterações morfológicas que são bastante óbvio até mesmo para um olho destreinado. Isso torna muito mais difícil de se manter imparcial. Cegueira não é um requisito para os ensaios.

Em quarto lugar, as contagens manuais são demorados e custam o investigador principal mais no salário. Os salários são um dos mais altos custos de realização de pesquisas. O tempo de varredura de uma placa na Odyssey é de apenas 8 min muito tempo sobre a "qualidade média" configuração e pode ser baixado ainda mais na configuração de "baixa qualidade". Deve notar-se que a Odyssey Imager é caro, mesmo quando se compra uma versão de demonstração usado, mas é um custo fixo de uma só vez. Por outro lado, também é preciso investir em microscópios de epifluorescência relativamente caros para a contagem de células manuais de DAPI-ou Hnúcleos oechst manchada. Apesar do custo inicial, o Odyssey Imager é uma máquina multiuso que também mede immunoblots ocidentais de forma quantitativa ^47,48. Nós adaptamos uso da Odyssey para quantificações de imunocoloração em estruturas cerebrais macroscópicas, como o rato ou mouse ou córtex estriado telencefálico. Esta abordagem também tem sido utilizado pelos outros ^49. Uma fraqueza do Odyssey Imager para imagens de tecidos é que a maior resolução é de apenas 21 m. Portanto, não pode contar células individuais e não se destina a visualizar pequenos detalhes anatômicos.

Finalmente, os ensaios de infravermelhos não podem ser tão sensíveis a pequenas alterações no número de células como as contagens manuais. Os valores de IC _50, por conseguinte, não pode ser considerado como apresentando a concentração que provoca a perda de precisão de 50% do número de células, mas apenas como a concentração que provoca a perda de 50% do sinal de infravermelhos. Esta ressalva provavelmente se aplica atodos os ensaios de viabilidade que burlam a contagem de células individuais por microscopia e provar todo o bem ao mesmo tempo. A imprecisão associada com tais ensaios pode ser uma função de hipertrofia, atrofia, ou outras alterações na aparência que afectam a intensidade do sinal. Por exemplo, com algumas toxinas, α-tubulina imunorreactividade em cada célula pode subir como uma função de toxicidade. Temos observado este fenômeno em células N2a tratados com concentrações muito elevadas de MG132 ^8. Se esta é uma preocupação, outras proteínas marcadoras do citoesqueleto, tal como β-actina ou GAPDH pode ser usado. Além disso, salientou células N2a tendem a formar processos bipolares ^8,50,51. Com as mudanças no tamanho das células, saída de sinal fluorescente por célula também será diferente entre os grupos de tratamento. Recomenda-se que as células tratadas com toxina ser examinada por microscopia de alta resolução padrão seguinte imunocitoquímica para os mesmos marcadores, como utilizados no No celular Ocidental. Se o citoplasma muda bastante em tamanho após tratamento, mas onúcleo não, recomendamos o uso da mancha DRAQ5 sem Sapphire apenas quantificar núcleos. Futuros estudos com diferentes corantes e com outras proteínas do citoesqueleto abundantes ou outros são garantidos para superar esses obstáculos.

Conclui-se que todos os ensaios sofrem com ressalvas e levantaram preocupações sobre a sensibilidade, linearidade, erro de amostragem, a relação sinal-ruído, viés humano ou subjetividade, tempo e custo. Além disso, todos os ensaios se baseiam em pressupostos que nem sempre são cumpridas. Portanto, recomenda-se que, pelo menos, dois ensaios ser utilizados para descrever os efeitos do tratamento sobre as culturas celulares, que mede a saúde metabólica e um que se baseia na viabilidade anatómica. Desta forma, pode-se determinar de forma mais eficaz se os compostos terapêuticos proteger tanto a estrutura e função.

Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de divulgar.

Reconhecemos Juliann Jaumotte para a idéia de poupar nos volumes de reagentes no ensaio ATP. Estamos profundamente gratos pelo apoio administrativo soberba de Maria Caruso, Deb Willson, e Jackie Farrer e para a Escola de Farmácia Mylan para a prestação de apoio financeiro para estes estudos. Agradecimentos também são devidos às Doenças Hunkele temido Fundação eo Parkinson e Distúrbios do Movimento da Fundação pelo apoio financeiro dos estudos neuronais primários.