Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Métodos para usar os sistemas de alfavírus transdução de expressar repórteres fluorescentes in vitro e em mosquitos adultos são descritos. Esta técnica pode ser adaptada para expressar toda a proteína de interesse em vez de ou em adição a um repórter.

Sistemas de transdução Alphavirus (ATS) são ferramentas importantes para expressar genes de interesse (GOI) durante a infecção. ATS são derivados de clones de cDNA do vírus transmitidas por mosquitos RNA (gênero Alphavirus, família Togaviridae). O gênero Alphavirus contém cerca de 30 diferentes espécies de mosquito-borne vírus. Alfavírus são vírus envelopados e contêm genomas single-stranded RNA (~ 11,7 Kb). Alfavírus transcrever um mRNA subgenomic que codifica as proteínas estruturais do vírus necessários para encapsidação do genoma e maturação do vírus. Alfavírus são geralmente muito lítica em células de vertebrados, mas persistentemente infectar as células de mosquitos suscetíveis, com citopatologia mínimo. Esses atributos tornam excelentes ferramentas para expressão de genes em mosquitos vetores. A ATS mais comum em uso são derivados de Sindbis vírus (SINV). O tropismo vasta espécie de SINV permite a infecção de cells8 insetos, aves e mamíferos. No entanto, ATS foram derivados de alfavírus também outros ^9,10,20. Expressão de genes estranhos é possível pela inserção de um viral do site subgenomic adicionais iniciação RNA ou promotor. ATS em que uma seqüência do gene exógeno é posicionado 5 'para os genes virais estruturais é usado para a expressão da proteína estável em insetos. ATS, em que uma sequência genética é posicionado 3 'dos ​​genes estruturais, é usado para disparar RNAi e silêncio expressão desse gene no inseto.

ATS provaram ser ferramentas valiosas para a compreensão do vetor-patógeno interações, os detalhes moleculares da replicação viral e ciclos de manutenção infecciosas ^{3,4,11,19,21.} Em particular, a expressão de repórteres fluorescentes e bioluminescentes tem sido instrumental de monitoramento da infecção viral na transmissão vetorial e do vírus ^5,14-16,18. Além disso, a resposta imune do vetor tem sido descrito utilizando duas linhagens de SINV projetadas para expressar GFP ^2,9.

Aqui, apresentamos um método para a produção de SINV contendo um repórter fluorescente (GFP) a partir do clone de cDNA infeccioso. Infecciosas, full-length RNA é transcrito a partir do clone linearizada cDNA. Infecciosas RNA é introduzido em células-alvo permissiva por eletroporação. Células transfectadas gerar partículas de vírus infecciosos expressar o Governo indiano. Vírus colhido é usado para infectar os mosquitos, como descrito aqui, ou outras espécies hospedeiras (não mostrado aqui). Competência vetorial é avaliada através da detecção de fluorescência fora do intestino ou por transmissão de monitoramento do vírus ^7. Uso de um repórter fluorescente como o Governo indiano uma estimativa conveniente de disseminação do vírus através de uma cultura de células, para determinação da taxa de disseminação da infecção, em mosquitos expostos, a transmissão do vírus do mosquito e fornece uma medida rápida da competência vetorial.

O protocolo a seguir foi escrito para produção e utilização de uma ATS baseado no vírus Sindbis MRE16. A ATS é projetado para expressar GFP no vetor mosquito Aedes aegypti. cDNA clones infecciosos de uma série de alfavírus (Sindbis vírus, Chikungunya vírus, O'nyong-Nyong vírus, vírus da encefalite eqüina ocidental) estão atualmente disponíveis que foram concebidos como ATS (Tabela 1). Para melhores resultados DNA plasmídeo é amplificado em bactérias, tais como bactérias CERTEZA competente (Stratagene / Agilent Technologies) para evitar a recombinação indesejada e perda do cDNA viral. Todos os plasmídeos clone infecciosas têm um bacteriófago T7 SP6 ou promotor na 5 imediato "fim do cDNA viral para a transcrição do RNA genômico de comprimento total e uma endonuclease de restrição única na extremidade 3 'para a transcrição escoamento. Para cada ATS, os usuários devem usar o apropriado bacteriófago DNA polimerase RNA dependente e endonuclease de restrição único para transcrição in vitro do genoma RNA viral.

1. Geração de RNA Infecciosas da Clone de cDNA.

1. Linearizar a 5μg do clone infeccioso plasmídeo (p5'dsMRE16 / GFP), com 20 unidades de XhoI enzima de restrição em uma reação de 100 L. Incubar por 2-3h a 37 ° C
2. Purificar DNA linearizado usando Qiagen QIAprep rotação Miniprep Kit protocolo de purificação alternativo, eluição do DNA da coluna de spin usando 50 água RNase mL. Plasmídeo de concentração deve ser de aproximadamente 1,0 mcg / mL.
3. Em um 0,2 mL RNase tubo PCR, set-up de 50 mL de reação de transcrição usando Ambion Kit MAXIscript por protocolo a seguir.
   
   • 22,5 mL RNase dH ₂ O
     • 5,0 mL modelo de DNA linearizada (1,0 mcg / mL)
     • 2,5 mL 10mM ATP
     • 2,5 mL 10mM CTP
     • 2,5 mL 10mM UTP
     • 2,5 mL GTP 1mM
     • 2,5 mL tampão 10mM analógico ⁽⁷ G m (5 ') ppp (5') G)
     • 5,0 mL tampão de transcrição 10X
     • 5,0 mL ou T7 SP6 mix polimerase
   • Total de 50,0 mL
4. Incubar a reação de transcrição para 1 hora a 37 ° C. Após a incubação, a reação deve ser utilizado imediatamente para eletroporação de células BHK-21. Preparação das células BHK-21 para o eletroporação deve começar durante a reação de transcrição de incubação.

2. Geração de vírus de RNA Infecciosas

1. Trypsinize dois 70-80% 150 cm confluentes ² (T-150) frasco de células BHK-21 por ATS.
2. Transferência de todas as células para um tubo de centrífuga de 15 mL cônico.
3. Agregar as células por centrifugação a 2000 rpm, 10 min, 4 ° C em uma centrífuga de mesa convencional.
4. Ressuspender as células em PBS estéril e sem Mg + + e Ca + +. Repita os passos 2.3 e 2.4 até que as células foram lavadas três vezes com PBS.
5. Ressuspender o pellet células 0,5 mL de MEM contendo 10% FBS.
6. Diluir 10 mL de células com 90 mL de MEM com 10% de FBS e contar com um hemocitômetro. Se necessário, diluir para células 2,5-12,5 x 10 ⁷ células / mL com MEM contendo 10% FBS.
7. Para uma cuvete gelada eletroporação 0,2 centímetros, adicione 400 mL de suspensão celular e 20 mL de reação de transcrição. Limpe a condensação da cuvete.
8. O pulso da cuvete duas vezes: 450V, 1200Ω, 150 mF. Usamos uma Manipulator celular Electro, Harvard Apparatus Modelo ECM630.
9. Coloque todo o conteúdo da cubeta em um frasco de 25 centímetros de cultura de tecidos ² contendo 5 mL de MEM com 10% de FBS.
10. Incubar frasco (s) em 37C com 5% de CO _2.
11. Monitorar a infecção diariamente em microscópio invertido fluorescentes com o conjunto filtro apropriado (por exemplo, GFP filtro: comprimento de onda de excitação = 460-490 nm, comprimento de onda de emissão = 510-550 nm; ou dsRed filtro: comprimento de onda de excitação = 460-560 nm, comprimento de onda de emissão => 590 nm).
12. Fluorescência quando sugere infecção é confluente e / ou CPE é visível em todo o frasco, recolher o conteúdo do frasco, adicionar 30% FBS, alíquota, conforme necessário, e armazenar a -80 ° C. Se desejar, lisados ​​celulares pode ser eliminado por centrifugação (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) antes da adição de FBS.
13. Passagem do vírus pelo menos uma vez através de um frasco novo de células para aumentar a título de vírus para os ensaios de alimentação posterior sangue.

3. Per os Infecção de Mosquitos

1. Misture sangue (normalmente adquiridos de-fibrinated sangue de carneiro) e de cultura de células-suspensão de vírus derivados a partir do passo 2.13. Título de vírus final na refeição de sangue normalmente deve ser ~ 1x10 ⁷ unidades formadoras de placa (UFP) / mL para a infecção do intestino médio eficiente do mosquito. Para estimular mosquitos para engorge, adenosina 5'-trifosfato (ATP) pode ser adicionado a uma concentração final de 0,02.
2. Os mosquitos podemtem que ser privado de água e açúcar antes da infecção para estimulá-los para alimentar de forma eficiente o sangue de um alimentador artificial. Duração de privação deve ser previamente estabelecido para minimizar a mortalidade. Vezes vai depender de espécies de mosquitos, a umidade do insetário etc Como ponto de partida, remova 24h e 12h de açúcar água antes da alimentação. Este protocolo usa jaqueta de água de vidro feeders17 com circulação de água 37 ° C. Uma membrana intestinal suína (ou seja, muito bem lavados salsicha caixa disponível na maioria dos supermercados) é colocado sobre a boca do alimentador e da refeição é pipetado para dentro da câmara. Vários projetos, membranas e protocolos estão disponíveis para os tipos de vetores diferentes.
3. Os mosquitos são classificados para selecionar apenas os mosquitos ingurgitados com sangue. Mosquitos ingurgitados são transferidos para uma caixa de papelão com organdi na parte superior e os mosquitos são incubados a 28 ° C, 75-80% de umidade relativa até ser transformado para a expressão GFP.

4. Inoculação intratorácica de mosquitos

Inoculação intratorácica é um método alternativo para infectar o artrópodes. Este método é utilizado quando a divulgação através do intestino médio não é necessário. (Método descrito abaixo, mas a técnica não é mostrado neste experimento visual).

1. Um pequeno número de mosquitos (5-10) é aspirada das gaiolas segurando em plástico tubos de exploração. Os tubos selados exploração, que será colocado a 4 ° C por 15 min para relaxar os mosquitos.
2. 2 5 mosquitos será derramado do tubo para uma placa de Petri de vidro descansando sobre o gelo. Coloque a tampa sobre a placa de Petri quando não em uso ou se os mosquitos começam a se mover. Durante o manuseio dos mosquitos, os cuidados devem ser tomados para contar e acompanhar o número de mosquitos sendo manipulado. Como os mosquitos são derramados sobre a mesa frio, o número total será registrado em um contador de laboratório.
3. A agulha é preparado pela fusão tubos capilares de vidro usando Nanoject específico e um extrator de agulhas.
4. Configurar o Nanoject II microinjetor acordo com as instruções do fabricante para entrega de 69 nL inóculo. Cuidado deve ser exercitado quando o inóculo de desenho para dentro da agulha de modo que a agulha não está danificado.
5. Usando um microscópio de dissecação, inserir a agulha no tórax do mosquito e ativar o Nanoject para inoculação. Cuidado deve ser exercido quando inocular os mosquitos para que a agulha não penetra completamente o mosquito e sair do outro lado, resultando na morte subseqüente do mosquito. Verifique cada mosquito ter certeza de que o inóculo entrou antes de a retirar a agulha.
6. Após a inoculação, enquanto o mosquito ainda é empalado com a agulha, coloque-o em uma caixa de papel de participação através de um pequeno orifício no lado que está conectado com algodão ou uma rolha de cortiça em todas as outras.
7. Quando os mosquitos têm inoculadas e colocadas na caixa (até cerca de 50 por caixa), fita com cuidado a rolha no lugar para impedir a liberação acidental do mosquito. Coloque as caixas em uma holding bin segura antes de incubação mais no insetário a 28 ° C% de umidade relativa e 80.

5. Infecção monitoramento de mosquitos

1. Coloque a caixa de papel segurando a 4 ° C por aproximadamente 15 minutos para imobilizar mosquitos.
2. Transferência de um pequeno número de mosquitos (10/05 de cada vez) a uma tabela frio adaptadas para uso em um microscópio fluorescente.
3. Examinar e classificar os mosquitos com base na presença ou ausência de fluorescência. Além disso, a intensidade fluorescente pode ser usado como uma medida quantitativa da infecção de proxy. Tecidos, como intestino médio do mosquito, glândulas salivares, de gordura corporal pode ser dissecada e monitorados para fluorescência.
4. Se for o caso, o retorno mosquitos selecionados para caixa de papel para continuar a incubação de mosquitos infectados.

6. Ensaio de transmissão (salivação forçado a demonstrar transmissão do vírus)

1. Privar os mosquitos da fonte de açúcar por 24 h antes da alimentação.
2. Remover pernas e asas
3. A um tubo de 50 mL capilar que tenha sido aquecido, puxado e cortou em uma extremidade, adicionar 3-5 mL de óleo de imersão Cargille Tipo B ou 10% de sacarose, soro solução.
4. Inserir a tromba para dentro do tubo. Se usar óleo, gotículas de saliva será visto a exalam da tromba. Um mL de uma solução pilocarbine 1% em PBS e 0,1% Tween 80 pode ser aplicada ao tórax para estimular.
5. Depois de 60-90 minutos, remover e armazenar os mosquitos para isolamento do vírus, se necessário.
6. Remoção da solução do tubo por centrifugação em um tubo contendo 100 mL de 20% FBS-PBS.
7. Filtro estéril do inóculo através de um filtro de seringa 0,2 mm e, em seguida, usar o filtrado do inóculo para infectar as células em cultura.

NOTA DE BIOSSEGURANÇA: Este protocolo descreveum método para gerar, identificação e monitoramento de mosquitos infectados. Com base em suas instalações (ou seja, uma tabela frio, instalação de confinamento, etc) e aprovação IBC, você pode ser limitada a examiná-los somente após a remoção de asas e pernas para evitar fugas. SINV baseado em ATS pode ser gerado e utilizado em um ambiente BSL2. O uso de ATS é baseado em outros, tais como alfavírus Chikungunya vírus ou vírus da encefalite eqüina ocidental exigirá BSL3 instalações.

7. Resultados representante

Uma visão geral de expressão de um gene marcador (GFP) usando a 5'dsMRE16 ATS / GFP é mostrado na Figura 1. Expressão da GFP em BHK-21 e C6/36 (Aedes albopictus) células é mostrado na Figura 2 em horários específicos após a infecção de células com 5'dsMRE16 / GFP vírus de 0,01 multiplicidade de infecção. Figura 3 é uma visão geral de alfavírus e ATS infecção pelo vírus no mosquito quando o vírus é entregue através de uma refeição de sangue infecciosa. A Figura 4 mostra a preparação de uma refeição de sangue com ~ 10 ⁷ PFU / mL de vírus ATS seguido por infecção oral de Aedes aegypti. Ver o corpo inteiro de mosquito infectado e partes do corpo selecionados em 10 dias após a infecção utilizando um microscópio de epifluorescência (Figura 5). Detecção de GFP e dsRED em intestino médio de mosquitos infectados após a infecção com o vírus ATS 5'dsMRE16 expressando cada gene marcador fluorescente (Figura 6). Ensaio de transmissão usando mosquitos infectados com o vírus da ATS 5'dsMRE16 / GFP (Figura 7).

Tabela 1. ATS atualmente projetados para expressão de genes em mosquitos.

Tabela 2. Vantagens / desvantagens de usar ATS para a expressão de genes em mosquitos.

Figura 1: Visão geral da ATS produção de vírus em células BHK-21 usando p5'dsMRE / GFP GFP SINV expressar. Seguinte transcrição in vitro, genômica ATS RNA é electroporated em células BHK-21, onde o vírus é resgatado. O vírus da ATS pode então ser usada para infectar mosquitos. PEC = subgenomic promotor. Três espécies ATS RNA são transcritos no cells, a genômica, subgenomic 1 e 2 subgenomic RNAs. C (capsídeo), glicoproteínas E2 e E1 são montados com ATS genoma para gerar vírus infeccioso.

Figura 2: Expressão de GFP em mosquito (C6/36) células após a infecção com o vírus SINV 5'dsMRE16 / GFP.

Figura 3: Visão Geral de uma infecção de vírus em mosquitos ATS levando à transmissão do vírus.

Figura 4: ATS SINV 5'dsMRE16 infecção, expondo os mosquitos para uma refeição de sangue infecciosa.

Figura 5: ATS SINV infecção 5'dsMRE16 / GFP em 10 dias após a infecção. Detecção de corpo inteiro de GFP mostra que o vírus escapou do intestino médio e divulgados aos tecidos secundários. Figura também mostra expressão GFP em partes selecionadas do corpo que também é indicativo de uma infecção disseminada.

Figura 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP e 5'dsMRE16 / infecção do intestino médio dsRED em horários específicos pós-infecção. Intestinos, normalmente têm focos distintos de infecção logo após a ingestão de uma refeição de sangue contendo vírus que se espalha por todo o intestino médio posterior, às vezes mais tarde após a infecção.

Figura 7: Detecção de ATS 5'dsMRE16 / GFP na saliva do mosquito, já em 8 dias após a infecção. Ensaio é projetado para mostrar a transmissão do vírus ATS e mostra que o vírus 5'dsMRE16 / GFP pode expressar estavelmente GFP ao longo do período de incubação extrínseco no mosquito. O painel esquerdo mostra um mosquito salivando em um tubo capilar, o painel central mostra células C6/36 infectadas com saliva em um dia e no painel direito três dias após a infecção.

Os métodos aqui apresentados permitem que os pesquisadores seguem a infecção de um alfavírus em cultura de células de mosquito eo mosquito adulto fêmea. As vantagens e desvantagens do uso de vírus ATS estão resumidos na Tabela 2. Um clone ATS infecciosas podem ser manipulados geneticamente para expressar qualquer Governo da Índia e foram usadas para expressar anticorpos de cadeia única, supressores de RNAi, RNAs antisense alvo genes endógenos e proteínas pró-apoptóticas. Se um repórter não é usado, então a parte de imagem deste método não é relevante. No entanto, muitos dos mesmos protocolos são necessários para ATS resgate de vírus, propagação e infecção do mosquito. Existem limitações no tamanho máximo do transgene quando inseridos em um sistema de transdução de alfavírus. As restrições de tamanho variam de acordo com a cepa parental usado para gerar o ATS, mas são geralmente cerca de 1kb embora genes maiores repórter, como vaga-lume luciferase tem sido usada na construção de ATS para uso em mosquitos. Laboratórios de pesquisa com uma quantidade modesta de fundo virologia deve ser capaz de usar ATS na sequência destes protocolos. Um número de laboratórios de pesquisa já feito usando SINV baseado ATS.

Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) eo RMRCE (NIH AI065357).