Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Methoden für den Einsatz Alphavirus transduzierenden Systeme fluoreszierenden Reporter in vitro und in der Erwachsenenbildung Mücken Ausdruck beschrieben werden. Diese Technik kann an jede Protein von Interesse anstelle oder zusätzlich zu einem Reporter zu äußern.

Alphavirus transduzierenden Systeme (ATS) sind wichtige Werkzeuge zur Expression von Genen von Interesse (GOI) während der Infektion. ATS aus cDNA-Klone von Moskitos übertragene RNA-Viren (; Familie Togaviridae Gattung Alphavirus) abgeleitet. Die Alphavirus Gattung enthält etwa 30 verschiedene Moskitos übertragene Virusarten. Alphaviren sind umhüllte Viren und enthalten einsträngige RNA-Genome (~ 11,7 Kb). Alphaviren transkribieren ein subgenomische mRNA, dass die strukturellen Proteine ​​des Virus für die Enkapsidierung des Genoms und die Reifung des Virus erforderlich kodiert. Alphaviren sind in der Regel hoch lytische in Zellen von Wirbeltieren, aber beharrlich zu infizieren anfällig Stechmückenzellen mit minimalem Zytopathologie. Diese Eigenschaften machen sie zu ausgezeichneten Werkzeugen für die Genexpression in Moskito-Vektoren. Die häufigsten ATS in Verwendung sind aus Sindbis-Virus (SINV) abgeleitet. Die breite Arten Tropismus SINV ermöglicht Infektion von Insekten-, Vogel-und Säugetier-cells8. Allerdings haben ATS aus anderen Alphaviren sowie ^9,10,20 abgeleitet. Ausländische Genexpression wird durch die Einfügung eines zusätzlichen viralen RNA subgenomische Initiationsstelle oder Promotor. ATS, in denen eine exogene Gen-Sequenz 5 'positioniert ist, um das virale Strukturgene ist für einen stabilen Protein-Expression in Insekten eingesetzt. ATS, in denen eine Gensequenz 3 'positioniert ist, um die strukturellen Gene, wird verwendet, um RNAi und Stille Expression dieses Gens in das Insekt auslösen.

ATS haben sich als wertvolle Instrumente für das Verständnis der Vektor-Pathogen-Interaktionen, molekularen Details der viralen Replikation und Wartung infektiösen Zyklen ^3,4,11,19,21 werden. Insbesondere hat der Ausdruck Fluoreszenz-und Biolumineszenz Reporter maßgeblich die Verfolgung der Virusinfektion in den Vektor und eine Übertragung des Virus ^5,14-16,18. Darüber hinaus hat der Vektor Immunantwort beschrieben worden mit zwei Stämme von SINV entwickelt, um GFP ^2,9 auszudrücken.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Herstellung von SINV mit einem fluoreszierenden Reporter (GFP) aus der cDNA-infektiösen Klon. Infektiöse, full-length-RNA wird aus den linearisierten cDNA-Klon transkribiert. Infektiöse RNA in permissive Zielzellen durch Elektroporation eingeführt. Transfizierten Zellen zu generieren infektiöse Viruspartikel Ausdruck der indischen Regierung. Geerntet Virus wird von Stechmücken, wie hier beschrieben, oder einem anderen Host Spezies (hier nicht dargestellt) zu infizieren. Vector Kompetenz wird durch den Nachweis Fluoreszenz außerhalb der Mitteldarm oder durch Überwachung Virusübertragung ⁷ bewertet. Die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter als die indische Regierung ermöglicht eine komfortable Bestimmung des Virus verbreitete sich in einer Zellkultur, zur Bestimmung der Ausbreitung der Infektion, Verbreitung in exponierten Mücken, eine Übertragung des Virus von der Mücke und bietet eine schnelle Spur von Vektor-Kompetenz.

Das folgende Protokoll ist für die Produktion und Verwendung eines ATS auf der Sindbisvirus MRE16 Basis geschrieben. Die ATS ist für GFP in der Mücke Aedes aegypti auszudrücken. cDNA-Klone Infectious einer Reihe von Alphaviren (Sindbis Virus, Chikungunya-Virus, O'nyong-nyong Virus, West-Pferde-Enzephalitis-Virus) sind derzeit zur Verfügung, die als ATS (Tabelle 1) konzipiert. Für beste Ergebnisse Plasmid-DNA in Bakterien wie SURE kompetente Bakterien (Stratagene / Agilent Technologies), um unerwünschte Rekombination und Verlust der viralen cDNA vermeiden verstärkt. Alle infektiösen Klon Plasmide haben einen Bakteriophagen T7 oder SP6-Promotor in der unmittelbaren 5'-Ende des viralen cDNA für die Transkription von full-length genomischen RNA und einem einzigartigen Restriktionsendonuklease am 3 'Ende für Abfluss-Transkription. Für jeden ATS, müssen die Benutzer den entsprechenden Bakteriophagen-DNA abhängigen RNA-Polymerase und einzigartigen Restriktionsendonuklease für in vitro-Transkription der viralen RNA-Genom.

1. Generation of Infectious RNA aus cDNA Klonen.

1. Linearisieren der 5μg der infektiösen Klon Plasmid (p5'dsMRE16 / GFP) mit 20 Einheiten Restriktionsenzym XhoI in einer 100 ul-Reaktion. Inkubieren für 2-3h bei 37 ° C
2. Purify linearisierte DNA mittels Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternative Aufreinigungsprotokolls, eluting DNA aus Spin-Säule mit 50 ul RNase-freiem Wasser. Plasmid-Konzentration sollte etwa 1,0 ug / ul werden.
3. In ein RNase-freies 0,2 ml PCR-Röhrchen, Set-up mit 50 ul Transkriptionsreaktion mit Ambion MAXIscript Kit pro Protokoll wie folgt.
   
   • 22,5 ul RNase-freies dH ₂ O
     • 5,0 ul linearisierte DNA-Template (1,0 ug / ul)
     • 2,5 ul 10 mM ATP
     • 2,5 ul 10 mM CTP
     • 2,5 ul 10 mM UTP
     • 2,5 ul 1 mM GTP
     • 2,5 ul 10 mM Kappe analog (m ⁷ G (5 ') ppp (5') G)
     • 5,0 ul 10x Transkriptionspuffer
     • 5,0 ul T7-oder SP6-Polymerase-Mix
   • 50,0 ul insgesamt
4. Inkubieren Sie die Transkription für 1 Stunde bei 37 ° C. Nach der Inkubation sollte die Reaktion sofort für die Elektroporation von BHK-21 Zellen verwendet werden. Vorbereitung der BHK-21-Zellen für die Elektroporation sollte während der Inkubation Transkriptionsreaktion beginnen.

2. Erzeugung von Virus aus Infectious RNA

1. Trypsinize zwei 70-80% konfluente 150 cm ² (T-150) Kolben BHK-21 Zellen pro ATS.
2. Übertragen Sie alle Zellen in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen.
3. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2000 rpm, 10 min, 4 ° C in einer herkömmlichen Tischzentrifuge.
4. Die Zellen in sterilem PBS ohne Mg + + und Ca + +. Wiederholen Sie die Schritte 2,3 und 2,4, bis die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen.
5. Resuspendieren der pelletierten Zellen 0,5 ml MEM mit 10% FBS.
6. Verdünnen Sie 10 l-Zellen mit 90 ul MEM mit 10% FBS und zählen auf einem Hämacytometer. Falls notwendig, verdünnen Zellen 2,5-12,5 x 10 ⁷ Zellen / ml mit MEM mit 10% FBS.
7. Um ein eiskaltes 0,2 cm Elektroporationsküvette, fügen Sie 400 ul Zellsuspension und 20 ul Transkriptionsreaktion. Wischen Kondensation von Küvette.
8. Pulse die Küvette zweimal: 450V, 1200Ω, 150 uF. Wir verwenden ein Electro Zellmanipulators, Harvard Apparatus Modell ECM630.
9. Platzieren Sie den gesamten Inhalt der Küvette in eine 25 cm ² Zellkulturflasche mit 5 ml MEM mit 10% FBS.
10. Inkubieren Kolben (s) bei 37 ° C mit 5% CO _2.
11. Überwachen Sie die Infektion täglich mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filter-Set (zB GFP-Filter: Anregungswellenlänge = 460-490 nm, Emissionswellenlänge = 510-550 nm; oder dsRed Filter: Anregungswellenlänge = 460-560 nm, Emissionswellenlänge => 590 nm).
12. Als Fluoreszenz schlägt Infektion ist konfluent und / oder CPE ist sichtbar in den Kolben, sammeln die Inhalte der aufgefangen und mit 30% FBS, Aliquot wie nötig, und bei -80 ° C. Falls gewünscht, kann Zelllysate durch Zentrifugation geklärt werden (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) vor der Zugabe von FBS.
13. Passage-Virus mindestens einmal durch eine neue Flasche von Zellen, die Virustiter für nachfolgende Blut Fütterung Assays zu erhöhen.

3. Per os Infektion der Mücken

1. Mischen Blut (in der Regel gekauft de-fibrinated Schafblut) und Zellkultur-abgeleitete Virus Suspension aus Schritt 2.13. Finale Virustiter in der Blutmahlzeit in der Regel sollte ~ 1x10 ⁷ Plaque-bildenden Einheiten (pfu) / mL für eine effiziente Infektion Mitteldarm der Mücke werden. Zur Stimulierung Mücken engorge, Adenosin-5'-Triphosphat (ATP) kann bis zu einer Endkonzentration von 0,02 M hinzugefügt werden.
2. Mücken könnenhaben, um aus Wasser und Zucker entzogen werden vor der Infektion, um sie effizient Blut ernähren stimulieren aus einer künstlichen einlegen. Dauer des Entzugs sollte vorher festgelegt werden, um die Sterblichkeit zu minimieren. Die Zeiten werden auf Mückenarten, Feuchtigkeit der Insektarium etc. Als Ausgangspunkt ab, entfernen Sie Zucker und Wasser 24 Stunden 12h vor dem zu ernähren. Dieses Protokoll verwendet Wassermantel Glas feeders17 mit umlaufendem 37 ° C Wasser. Ein Schweine-Darm-Membran (dh gründlich gewaschen Wursthülle in den meisten Lebensmittelgeschäften) wird über den Mund des Zubringers und das Essen wird in die Kammer pipettiert platziert. Verschiedene Ausführungen, Membranen und Protokolle für verschiedene Vektor-Typen zur Verfügung.
3. Moskitos sind sortiert, um nur die Mücken mit Blut gefüllt wählen. Engorged Mücken sind ein Karton mit Organza auf der Spitze übertragen und die Mücken sind bei 28 ° C, 75-80% relative Luftfeuchtigkeit bis auf GFP-Expression verarbeitet.

4. Intrathorakale Inokulation von Mücken

Intrathorakale Impfung ist eine alternative Methode zur Infektion der Arthropoden. Diese Methode wird verwendet, wenn die Verbreitung durch den Mitteldarm nicht erforderlich ist. (Methode beschrieben, aber die Technik ist noch nicht in diesem visuelles Experiment gezeigt).

1. Eine kleine Anzahl von Mücken (5-10) ist aus dem Betrieb Käfige in Kunststoff Holding Rohre angesaugt. Die versiegelten hält Röhrchen bei 4 ° C für 15 min die Moskitos Chill auf.
2. 2 5 Moskitos aus der Tube auf eine Glas-Petrischale ruht auf Eis verschüttet werden. Setzen Sie den Deckel auf die Petrischale, wenn nicht in Gebrauch ist oder wenn Mücken zu bewegen beginnen. Während der Handhabung von Mücken, muss darauf geachtet werden, zu zählen und zu verfolgen die Zahl der Mücken manipuliert werden. Wie Mücken auf der Chill Tisch verschüttet werden, wird die Gesamtzahl auf dem Labortisch aufgezeichnet werden.
3. Die Nadel wird durch Schmelzen Kapillarrohr mit Nanoject spezifische Glas-und einer Nadel puller vorbereitet.
4. Richten Sie die Nanoject II Mikroinjektor pro Anweisungen des Herstellers für die Lieferung von 69 nL Inokulum. Vorsicht ist bei der Erstellung des Inokulums in die Nadel so, dass die Nadel nicht beschädigt wird.
5. Mit einem Binokular die Nadel in den Brustkorb von der Mücke und aktivieren Sie die Nanoject zur Impfung. Vorsicht ist bei der Impfung Mücken, so dass die Nadel nicht vollständig durchdringen die Mücke und Ausfahrt der anderen Seite, was in der anschließenden Tod der Mücke werden. Prüfen Sie jede Mücke sicher sein, dass das Inokulum, bevor es aus der Nadel eingetragen.
6. Nach der Impfung während der Mücke ist noch auf der Nadel aufgespießt, legen Sie es in einem Papier Holding Karton durch ein kleines Loch in die Seite, die mit Watte oder einem Korken zu allen anderen Zeiten angeschlossen ist.
7. Wenn die Mücken haben geimpft und in den Karton (bis zu ca. 50 pro Karton), sorgfältig Band der Korken in Ort, um ein unbeabsichtigtes Lösen der Mücken zu verhindern platziert. Legen Sie die Kartons in einen sicheren Halt bin vor einer weiteren Inkubation im Insektarium bei 28 ° C und 80% relativer Luftfeuchtigkeit.

5. Überwachung der Infektion der Mücken

1. Legen Sie das Papier hält Karton bei 4 ° C für ca. 15 Minuten, um Mücken zu immobilisieren.
2. Übertragen einer kleinen Anzahl von Mücken (5-10 auf einmal) zu einem Chill-Tabelle für den Einsatz auf einem Fluoreszenz-Mikroskop angepasst.
3. Untersuchen und sortieren Mücken auf Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz. Darüber hinaus kann Fluoreszenzintensität als Proxy quantitative Messung der Infektion verwendet werden. Mosquito Geweben wie Mitteldärmen, Speicheldrüsen, können fetten Körper seziert und für die Fluoreszenz beobachtet werden.
4. Gegebenenfalls wieder gewählt Mücken auf Papier Karton zur Inkubation von infizierten Mücken weiter.

6. Transmission Assay (Forced Speichelfluss auf eine Übertragung des Virus zu demonstrieren)

1. Entziehen Sie Mücken Zucker Quelle für 24 h vor zu füttern.
2. Entfernen Sie Beine und Flügel
3. Um eine 50 ul Kapillare, die erhitzt wurde, zog und schnitt an einem Ende, fügen Sie 3-5 ul der Cargille Typ B Immersionsöl oder 10% Serum-Saccharose-Lösung.
4. Legen Sie den Rüssel in die Röhre. Bei der Verwendung von Öl, wird Tröpfchen Speichel gesehen vom Rüssel ausstrahlen werden. Ein ul einer 1% igen pilocarbine Lösung in PBS und 0,1% Tween 80 kann auf den Thorax zu stimulieren angewendet werden.
5. Nach 60-90 Minuten, entfernen Mücken und speichern für die Virusisolierung, falls erforderlich.
6. Entfernen Sie aus dem Glas durch Zentrifugation in ein Röhrchen mit 100 ul 20% FBS-PBS.
7. Sterilfilter das Inokulum durch einen 0,2 um Spritzenfilter und verwenden Sie dann das gefilterte das Inokulum zu kultivierten Zellen zu infizieren.

Biosafety Hinweis: Dieses Protokoll beschreibtein Verfahren zur Erzeugung, Identifizierung und Überwachung von infizierten Mücken. Basierend auf Ihren Einrichtungen (dh eine Chill-Tabelle, Containment-Anlage, etc.) und IBC Genehmigung, können Sie auf deren Prüfung erst nach Entfernen Flügel und Beine, um eine Flucht zu verhindern begrenzt werden. SINV-basierte ATS erzeugt und verwendet werden in einem BSL2 Umwelt. Der Einsatz von ATS ist auf anderen Alphaviren wie Chikungunya-Virus oder westlichen Pferdeenzephalitis-Viren basieren erfordert BSL3 Einrichtungen.

7. Repräsentative Ergebnisse

Eine Übersicht der Expression eines Marker-Gen (GFP) mit dem ATS 5'dsMRE16 / GFP ist in Abbildung 1 dargestellt. Expression von GFP in BHK-21 und C6/36 (Aedes albopictus)-Zellen ist in Abbildung 2 zu bestimmten Zeiten nach der Infektion von Zellen mit 5'dsMRE16 / GFP-Virus bei 0,01 Multiplizität der Infektion gezeigt. Abbildung 3 gibt einen Überblick über Alphavirus und ATS-Virus-Infektion in der Mücke, wenn das Virus durch einen infektiösen Blutmahlzeit geliefert wird. Abbildung 4 zeigt die Herstellung einer Blutmahlzeit mit ~ 10 ⁷ pfu / ml ATS-Virus durch orale Infektion von Aedes aegypti gefolgt. Ganzkörper-Ansicht von infizierten Mücken und ausgewählte Körperteile bei 10 Tagen nach der Infektion mit dem Epifluoreszenzmikroskop (Abbildung 5). Detektion von GFP und DsRed in Mitteldärmen von infizierten Mücken nach Infektion mit ATS 5'dsMRE16 Viren Ausdruck jedes fluoreszierenden Markergen (Abbildung 6). Transmission Test unter Verwendung von Moskitos mit 5'dsMRE16 / GFP ATS-Virus (Abbildung 7) infiziert.

Tabelle 1. ATS ist derzeit für die Genexpression in Mücken entwickelt.

Tabelle 2. Vorteile / Nachteile der Verwendung von ATS ist für die Genexpression in Mücken.

Abbildung 1: Übersicht über ATS Virus-Produktion in BHK-21 Zellen mit p5'dsMRE / GFP SINV, die GFP. Nach in-vitro-Transkription ist die genomische ATS-RNA in BHK-21 Zellen, in denen Virus ist gerettet elektroporiert. Die ATS-Virus kann dann verwendet werden, um Mücken zu infizieren. SGP = subgenomische Promotor. Drei ATS RNA-Spezies sind in die cel transkribiertls, die genomische, subgenomische 1 und 2 subgenomische RNAs. C (Kapsid), E2-und E1-Glykoproteine ​​mit ATS Genom versammelt, um infektiöse Viren zu generieren.

Abbildung 2: Expression von GFP in Mücke (C6/36) Zellen nach Infektion mit SINV 5'dsMRE16 / GFP-Virus.

Abbildung 3: Übersicht der ATS-Virus-Infektion in Mücken was zu Virusübertragung.

Abbildung 4: ATS SINV 5'dsMRE16 Infektion durch Aussetzen Mücken zu einer infektiösen Blutmahlzeit.

Abbildung 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP-Infektion bei 10 Tagen nach der Infektion. Die Ganzkörper-Detektion von GFP zeigt, dass Virus hat den Mitteldarm entkommen und verbreitet, um sekundäre Gewebe. Abbildung zeigt auch die GFP-Expression in ausgewählten Körperteile, die auch ein Hinweis auf eine disseminierte Infektion.

Abbildung 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP und 5'dsMRE16 / dsRED Infektion Mitteldärmen zu bestimmten Zeiten nach der Infektion. Mitteldärmen haben in der Regel deutliche Infektionsherde früh nach Einnahme einer Blutmahlzeit mit Viren, die in den hinteren Mitteldarm zu späteren Zeitpunkten nach der Infektion ausbreitet.

Abbildung 7: Erkennung von ATS 5'dsMRE16 / GFP in Mücke Speichel bereits nach 8 Tagen nach der Infektion. Assay wurde entwickelt, um die Übertragung der ATS-Virus und zeigt, dass die 5'dsMRE16 / GFP-Virus stabil exprimieren können GFP während der extrinsischen Inkubationszeit in der Mücke zu zeigen. Die linke Tafel zeigt eine Mücke salivating in ein Kapillarrohr, zeigt das Zentrum Panel C6/36 Zellen mit Speichel an 1 Tag und rechte Tafel 3 Tage nach der Infektion infiziert.

Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen es den Forschern, um die Infektion eines Alphavirus in Mücke Zellkultur und die erwachsenen weiblichen Mücken folgen. Die Vor-und Nachteile der Verwendung von ATS-Viren sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Ein ATS infektiösen Klon kann genetisch manipuliert werden, um jede israelische Regierung zum Ausdruck bringen und wurden verwendet, um single chain Antikörper, Suppressoren von RNAi, Antisense-RNAs Targeting endogenen Gene und pro-apoptotische Proteine ​​zu exprimieren. Wenn ein Reporter nicht verwendet wird, dann ist die Bildgebung Teil dieser Methode ist nicht relevant. Allerdings sind viele der gleichen Protokolle, die für ATS-Virus zu retten, die Ausbreitung und Moskito-Infektion. Es gibt Einschränkungen in der maximalen Größe des Transgens, wenn sie in ein Alphavirus transduzierenden System eingefügt. Die Größenangaben variieren je nach der elterlichen Stammes verwendet, um die ATS zu generieren, sind aber in der Regel etwa 1kb obwohl größere Reportergene wie Glühwürmchen-Luciferase in Bau ATS für den Einsatz in Mücken verwendet worden sein. Forschungslabors mit einem bescheidenen Betrag der Virologie Hintergrund sollte in der Lage sein ATS folgenden Protokolle verwenden. Eine Reihe von Forschungslabors haben bereits so mit SINV-basierte ATS getan hat.

Diese Arbeit wird durch die National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) und die RMRCE (NIH AI065357) unterstützt.