A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

Um guia passo-a-passo para a geração de embriões alvo zebrafish quimérico de transplante em fase de blástula ou gástrula.

Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para obter insights sobre os complexos processos de desenvolvimento é a análise de embriões quiméricos. Uma quimera é definida como um organismo que contém células de mais de um animal; mosaicos são um tipo de quimera em que as células de mais de um genótipo são misturados, geralmente do tipo selvagem e mutante. No peixe-zebra, quimeras podem ser facilmente feitas por transplante de células de um embrião de doador em um embrião hospedeiro no estágio apropriado embrionárias. Células do doador rotulados são geradas pela injeção de um marcador de linhagem, tal como um corante fluorescente, no embrião estágio de uma célula. Células do doador rotulados são removidos a partir de embriões de doadores e introduzidas em embriões de anfitrião unlabeled usando um óleo controlado pipeta de vidro montada em cada um composto ou um microscópio de dissecação. Células do doador pode, em alguns casos, ser direcionados a uma região específica ou tecido do embrião hospedeiro desenvolvimento blástula ou gástrula palco por escolher um site de transplante no embrião host com base em mapas bem estabelecida destino.

Um guia passo-a-passo para a geração de embriões alvo zebrafish quimérico de transplante em fase de blástula ou gástrula.

Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para obter insights sobre os complexos processos de desenvolvimento é a análise de embriões quiméricos. Uma quimera é definida como um organismo que contém células de mais de um animal; mosaicos são um tipo de quimera em que as células de mais de um genótipo são misturados, geralmente do tipo selvagem e mutante. No peixe-zebra, quimeras podem ser facilmente feitas por transplante de células de um embrião de doador em um embrião hospedeiro no estágio apropriado embrionárias. Células do doador rotulados são geradas pela injeção de um marcador de linhagem, tal como um corante fluorescente, no embrião estágio de uma célula. Células do doador rotulados são removidos a partir de embriões de doadores e introduzidas em embriões de anfitrião unlabeled usando um óleo controlado pipeta de vidro montada em cada um composto ou um microscópio de dissecação. Células do doador pode, em alguns casos, ser direcionados a uma região específica ou tecido do embrião hospedeiro desenvolvimento blástula ou gástrula palco por escolher um site de transplante no embrião host com base em mapas bem estabelecida destino.

Parte 1: injeção de Embriões Zebrafish na fase 1-célula.

1. Dechorionation enzimática de embriões uma célula palco.
   
   Aos embriões proteoliticamente dechorionate, incubar na fase 1-célula para 1-5 ~ 'em uma solução pronase 0,5 mg / ml, conforme descrito no Livro Zebrafish 1. Embriões Moniter dechorionation perto e submergir em Medium Embrião (EM) com Pen / Strep 1, logo a começar a córions visivelmente colapso. Uma vez liberados de suas córions, embriões estágio blástula e gástrula são frágeis e vai ficar com plástico ou desintegrar-se, se exposta ao ar. Portanto, manter embriões dechorionated submerso em Pen / Strep EM, transferência entre pratos usando um fogo-polido wide-bore pipeta de vidro, e manter em qualquer pratos agar revestidas de plástico (1,2% agarose em Pen / Strep EM) ou autoclavado pratos de vidro petri.
   
2. Injetando embriões dechorionated com marcador de linhagem.
   
   Prepare um prato de injeção através da inserção de uma lâmina de vidro em um ângulo de 45 graus na maior parte de uma placa de Petri de três quartos cheios de agarose 1,2% feita em Pen / Strep EM. Remoção do slide após solidificação agarose deixa uma calha chanfrada. Transferência de embriões dechorionated na calha de um prato cheio de injeção Pen / Strep EM. Injetar volumes 1nl de marcador de linhagem usando um precisamente calibrados fogo puxado pipeta de vidro de injeção e um equipamento de injeção de pressão, como descrito no Livro Zebrafish 1. Injetar corantes e de baixo peso molecular, traçadores linhagem diretamente na gema de embriões dechorionated entre a 1 - e 4-cell etapas. Uma solução de 3% do fluorescentes dextran é suficiente para permitir a detecção de células do doador-derivadas de embriões quiméricos através de vários dias de desenvolvimento. Quando o marcador de linhagem é um mRNA que codifica uma proteína fluorescente (por exemplo, ou GFP RFP), injetar diretamente na célula do início dos anos uma célula do embrião palco.
   
3. Injetando não dechorionated embriões com marcador de linhagem.
   
   Prepare pratos bem multi-injeção solidificando 1,2% agarose em torno de um EM molde com poços mais ou menos a mesma largura que o diâmetro do córion. Transferência de embriões não-dechorionated em um prato de injecção multi-bem half-filled com Pen / Strep EM. Retire o excesso de fluido. Assim imobilizado, os embriões podem ser injetados com volumes 1nl do marcador de linhagem, como descrito acima.
   
4. Raising embriões injetados para transplante.
   
   Raise embriões em baixa densidade (40-50 embriões por prato) em Pen fresco / Strep EM. Stage-match os embriões de doadores e host usado para transplante bem de perto. Para transplantes de estágio escudo, apontar para os doadores a ligeiramente atrás dos anfitriões; nota que os embriões injetados tendem a ser ligeiramente atrasado. Incubar os embriões em diferentes temperaturas, 25 ° C, 28 ° C e 31 ° C, para escalonar o seu desenvolvimento e maximizar a janela de tempo durante o qual os transplantes podem ser realizados.
   

Parte 2: Making embriões quiméricos zebrafish de transplante.

1. Transplante em estágios blástula no estereomicroscópio

1. Descrição do dispositivo de transplante de blástula
   
   O aparelho utilizado para transplante de células no zebrafish blástula consiste de um micrômetro drive-controlados seringa Hamilton (10 l-50 l), presa por uma torneira de três vias para um reservatório de óleo mineral e ao titular de uma micropipeta através de um comprimento de tubulação flexível . Depois de montar o equipamento de transplante, é preenchido com óleo mineral, tendo o cuidado de eliminar todas as bolhas de ar do sistema. A presença de uma bolha de ar terá um impacto negativo a sua capacidade de controlar ªsucção e e pressão. Use um estereomicroscópio com aumento bastante elevado e ótica boa (de preferência, pelo menos, a ampliação 80x). O posicionamento do titular micropipeta e agulha pode ser controlado por um micromanipulador manual de Narishige, como por injeções, no entanto, se a base do estereoscópio é muito grande para permitir o acesso fácil com o micromanipulador, em seguida, um adaptador que se liga ao corpo do estereomicroscópio também pode ser comprado de Narishige. A montagem do micromanipulador deve ser muito estável, a fim de evitar a transferência de vibrações para a agulha de transplante; uma base magnética funciona bem para esta finalidade.
   
2. Preparando a pipeta transplante
   
   Agulhas transplante são feitos de pipetas de vidro capilar (ver duas opções em reagentes tabela abaixo), que são atraídos para uma vela suave em um extrator do eletrodo. Quebre a ponta da agulha sob off um microscópio de dissecação usando uma navalha borda reta no ponto onde o diâmetro interno da agulha é um pouco maior do que as células a serem transplantadas. Segure a lâmina de barbear em um leve ângulo para criar um chanfro e fazer a pausa tão suave quanto possível, sem bordas serrilhadas. Para transplantes de estágio blástula o diâmetro externo da agulha deve medir aproximadamente 50-60 mm.
   
3. Embriões de montagem para o transplante em moldes de agar
   
   Preparar pratos de injeção por um molde de plástico flutuando com filas de saliências em forma de cunha em uma placa de Petri que é half-filled com derretido agarose 1,2% em EM. Uma vez que a agarose solidificou, remover o modelo, deixando um molde agar que contém linhas de poços em forma triangular cada grande o suficiente para manter um embrião. Encher o molde com transplante Pen / Strep EM e carregar embriões em estágio blástula individualmente em cada poço com uma pipeta de vidro polido fogo, para que os embriões de doadores são colocados para baixo uma coluna e os embriões são colocados anfitrião para baixo na coluna adjacente.
   
4. Transplante de células
   
   Embriões posição no transplante de poços em seus lados; reposicionar com a pipeta de transplante, conforme necessário durante o transplante, tendo o cuidado fure a gema. Posicione o prato no palco de modo que quando a agulha entra transplante de um embrião, a agulha empurra o embrião contra a parede do fundo do seu poço. Usando o micromanipulador, inferior a agulha transplante no prato em um ângulo bastante íngreme. Idealmente, a agulha deve entrar no transplante de embrião em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Uma vez que a ponta da agulha está abaixo da superfície do meio de embrião, desenhe uma pequena quantidade de meio de embrião para a agulha rodando a unidade micrômetro controlar a seringa Hamilton. Para o controle mais preciso, a interface entre o óleo mineral eo meio de embriões devem permanecer na parte fina, afilada da agulha, mas não muito perto do fim. Suavemente a posição do embrião doador com a agulha e depois tirar a agulha para trás e entrar no cap blástula do embrião na posição desejada. Uma batida rápida e dura irá penetrar o embrião sem causar-lhe a implantação. Elaborar células do doador, lenta e cuidadosamente para dentro da agulha. Se as células são absorvidos muito rapidamente, é provável que eles cisalhamento. Além disso, evite tomar gema para dentro da agulha, uma vez que irá ligar ao óleo mineral, que então matar as células. Após o número desejado de células é retomada, reverter a pressão um pouco para parar a sucção e remover a agulha do embrião. Trazer o embrião hospedeiro em posição movendo o prato de transplante. Pequenos ajustes para a posição do embrião hospedeiro pode ser feita com cuidado de ligá-lo utilizando a agulha de transplante, desde que seja tomado cuidado para não tocar a gema. Ao expulsar as células do doador para o embrião hospedeiro, evitar a introdução de uma grande quantidade de meio de embrião ou qualquer óleo mineral, pois isso poderia interferir com o desenvolvimento ou matar o embrião. A posição das células ao longo do eixo animal-vegetal influencia a sua contribuição para uma das três camadas germinativas, endoderme, mesoderme e ectoderme 2,3. Assim, as células transplantadas junto à margem antes do início da gastrulação dará origem preferencialmente a endoderme e mesoderme, enquanto as células transplantadas em direção ao pólo animal vai contribuir para destinos ectodérmica, mais comumente ectoderma superficial, prosencéfalo e os olhos. Assim, um grau de segmentação do tecido pode ser realizado mesmo em estágios blástula. Após as transferências celulares têm sido concluída, a transferência dos pares doador-anfitrião aos poços agar revestidas de uma placa de 24 poços para desenvolver ainda mais.
   

1. Transplante em estágios gástrula sobre o microscópio composto

1. Descrição do dispositivo de transplante
   
   Transferências celular realizada em um microscópio composto benefício do controle preciso da posição da agulha fornecido por um óleo de três eixos hidráulicosmicromanipulador. Este micromanipulador controla os movimentos finos da pipeta transplante, enquanto a sucção na pipeta é controlado por uma seringa Hamilton micrômetro drive-semelhante ao utilizado para os transplantes de blástula. Um microscópio composto na vertical com um palco fixo é preferível para a realização de transferências celulares desde foco como um microscópio não causa o embrião para se mover em relação à pipeta. No entanto, se um microscópio composto ajustável-estágio deve ser usado, então o micromanipulador pode ser montado no palco do que ao corpo do microscópio com o mesmo efeito. Adaptadores que fornecem opções para a montagem do micromanipulador, quer o estágio ou corpo de microscópios compostos de uma variedade de fabricantes também estão disponíveis a partir Narishige.
   
2. Preparando a pipeta transplante
   
   Agulhas transplante são feitas, essencialmente, como descrito acima; para transplantes estádio de gástrula a abertura agulha ideal é de 30-40 mm. Após a formação escudo, a camada envolvente (EVL) torna-se mais aderente, o que torna difícil para o transplante de agulha para penetrar no embrião. Para facilitar a entrada da agulha, puxe uma farpa na ponta da agulha usando um microforge. Em primeiro lugar, suavizar a ponta da agulha, trazendo-o próximo ao filamento da microforge; em seguida, vire a agulha para que a ponta do bisel pode fazer contato com o filamento. Uma vez que a ponta da agulha contatos do filamento, puxe-o rapidamente para longe para criar um barb ou arpão. Para evitar danificar as células, o barb deve ser reta e ponta da agulha não deve curva
   
3. Embriões de montagem para transplante em metilcelulose
   
   Para transplantes de microscópio composto, monte embriões em uma lâmina de depressão em uma solução de 3% de metilcelulose (Sigma) dissolvida em meio embrião. Primeiro esfregaço, uma faixa vertical de metilcelulose na depressão de um slide de vidro da depressão, então inundação com uma quantidade generosa de meio de embrião. Usando uma pipeta-fogo polida, a transferência de um doador e três escudo estágio hosts sob a superfície do EM no slide depressão em um lado da metilcelulose. Escolha embriões de doadores que são ligeiramente mais jovens do que os anfitriões (30-50% epiboly). Com um pequeno laço feito colando as extremidades de um curto período de 2 lb linha de pesca de teste no final de um tubo capilar, rolo delicadamente os embriões de doadores e hospedar-se na parte superior da faixa de metilcelulose e enchê-los para dentro do metilcelulose até seguro. Se as células transplantadas são direcionados para um determinado domínio do conhecimento, do destino estágio escudo 3,4 mapa ea posição do tecido-alvo em relação ao escudo é essencial para que os embriões host pode ser posicionado corretamente. Como os embriões são colocados em série a metilcelulose, rolá-los em posição de modo que a região de destino é mais alto, já que durante o transplante a agulha entra tangencialmente o embrião para entregar as células do doador, sem danificar a gema.
   
4. Transplante de células
   
   Posição da agulha transplante, movendo-a no plano focal do embrião. Primeiro foco no embrião doador usando a objetiva de 10x. Em seguida, mova o embrião para o lado, e sem ajustar o plano focal, use os controles do micromanipulador para trazer a ponta da agulha transplante em foco. A posição do titular micropipeta e agulha em um ângulo bastante superficial, de modo que a agulha esteja o mais próximo possível horizontal como a borda da depressão no slide irá permitir. Se um embrião é montado corretamente em metilcelulose, não vai rolar como a agulha entra transplante, a menos que o embrião é velho demais para permitir que a agulha penetrar facilmente. A camada envolvente parece endurecer como idade embriões, portanto, os transplantes de estádio de gástrula são os melhores realizados logo após a formação de escudo. Após a fase de cúpula, a gema reside apenas sob as células do cap blastoderma, que progressivamente se dilui à medida que prossegue epiboly. A fim de evitar perfurar a gema, a agulha deve entrar o embrião em um plano focal, que é apenas ligeiramente mais profundo do que o EVL. Ao remover um grande número de células do embrião doador, mover a agulha em torno de como as células são retomadas, a fim de evitar acidentalmente chupando gema na agulha. Se as células de um embrião doador devem ser transplantadas para vários hosts, o melhor é entrar o doador com a agulha apenas uma vez, a fim de minimizar a possibilidade de danos. As células do doador podem então ser transferidos para o local desejado em até três embriões host. Ao transferir as células de dois ou mais embriões de doadores em um embrião hospedeiro, o melhor é retirar células de cada um dos embriões de doadores dentro da agulha transplante mesmo antes de transplantá-las para um embrião hospedeiro. Isso minimiza os danos ao embrião hospedeiro, e garante que as células são transferidas para a mesma área do embrião, de modo que seus comportamentos podem ser comparados. Muito pouca mistura occurs entre as células do doador no transplante de agulha, portanto, as células devem ser transferidos para um único host, quando mais de um doador é utilizado. A fim de aumentar a probabilidade de que as células do doador irá contribuir para o tecido desejado, expulsar as células do doador, enquanto a agulha está sendo elaborado pela área alvo, em oposição ao depositar as células em um aglomerado único. Uma vez que as transferências sejam concluídas célula, coloque o slide inteiro em uma placa de Petri e inundações cuidadosamente com Pen / Strep EM. Sobre as próximas horas a metilcelulose se dissolverá, liberando os embriões.
   

Figura 1: Microscópio set-up para a tomada de embriões quiméricos. R: A plataforma de transplante de dissecar microscópio composto por uma seringa cheia de óleo Hamilton com uma unidade de micrômetro (a) conectada a um reservatório cheio de óleo (b) eo transplante de pipeta (c) através de uma torneira de 3 vias (d). A pipeta transplante é montado em um micromanipulador grosseiros (e) que está ligado a uma placa de metal (não mostrado) através de uma base magnética (f). Transplantes são realizados no palco de um estereomicroscópio (g) equipada com iluminação de fundo para a óptica ideal. B: um composto rig microscópio transplante consiste em uma unidade de petróleo seringa Hamilton e micrômetro similar (a, b), mas neste caso a pipeta transplante é montado em um suporte de pipeta (c), cujo X, Y e Z movimentos podem ser controlados ou por uma grossa (d) ou multa micromanipulador (e). Neste exemplo, o micromanipulador é montado sobre o corpo de um microscópio fixa-fase, no entanto, é também possível montá-la no palco de um microscópio comum. Os embriões, que são imobilizados em metilcelulose em um slide depressão, são visualizados usando uma objetiva de 10x (f). C: Transplante de molde para imobilização de embriões para transplantes de estereomicroscópio. Dechorionated embriões são descartados individualmente em poços feita por fundição este molde em agarose numa placa de Petri 90mm. As dimensões dos poços são mostrados.

Figura 2: Montagem embriões para gástrula estágio transplantes. A: forma ideal de uma pipeta transplante de gástrula. A bisel com uma ponta afiada ajuda na penetração do embrião. B: Imobilizar embriões de doadores e de acolhimento na metilcelulose. Uma tira de metilcelulose está previsto no poço de um slide depressão e inundado com uma quantidade generosa de meio de embrião. Embriões são adicionadas ao meio de embrião e são rolados para a metilcelulose usando um pequeno laço (C). DG alargamento de embriões na fig. 1B. D: O embrião doador é orientado para permitir fácil acesso para a pipeta, uma vez que as células nesta fase ainda não confirmadas. EG: host Escudo estágio embriões são orientados para que a região de destino é mais alto. Células transplantadas para as regiões encaixotado contribuirá para rombencéfalo dorsal da crista neural cranial e derivados a partir da esquerda (E) e direito (G) os lados ou para a parte posterior do cérebro e da medula espinhal ventral (F).

Figura 3: Imagens representativas de embriões quiméricos.
(AC) 18hpf embriões quiméricos gerado por transplante no escudo estágio mostrado em vista dorsal, anterior à esquerda. (A, B) Classificando funções para receptor da superfície celular EphA4 revelada pela análise de embriões quiméricos. Painéis à esquerda: fusão de rodamina marcado células (rhod.) doador (vermelho) e GFP transgênicos expressa em segmentos específicos rombencéfalo (verde). (A) células WT contribuir para o rombencéfalo inteira de um embrião quimérico controle. (B) células EphA4 depleção dos doadores são excluídos segmentos específicos no cérebro posterior de uma série WT. (C) as células dos doadores direcionados para diferentes partes do tubo neural no escudo do palco transplantes. Células do doador (vermelho) direcionados para o prosencéfalo / mesencéfalo (painel esquerdo) ou rombencéfalo / medula espinhal (painel direito) de uma série WT contra-coradas com um anticorpo EfnB2a que marca o cérebro anterior, rombencéfalo mid-limite e do segmento médio do rombencéfalo (verde). Barras de escala: 50 ìm.

A facilidade com que o transplante pode ser usado para produzir quimeras alvo é uma das grandes potências do zebrafish como modelo vertebrados. A modificação do presente protocolo não descrito acima permite a análise da função dos genes maternos para a genes com funções essenciais no desenvolvimento zigóticos. Uma vez que estes peixes mutantes não podem sobreviver até a idade adulta, é necessário transferir a linha germinativa mutante em um embrião hospedeiro contrário do tipo selvagem, a criação de "clones da linha germinativa" de células mutantes. Geração de mosaicos da linha germinativa envolve o transplante de células germinativas primordiais de um doador para um mutante embrião hospedeiro do tipo selvagem. Ao contrário de todas as outras linhagens celulares do embrião, a linhagem de células germinativas é especificado muito cedo no desenvolvimento pela herança dos determinantes materna ^5,6. Assim, o primeiro desafio de fazer mosaicos da linha germinativa é identificar as células germinativas primordiais (PGCs) no embrião doador. Em estágios midblastula o PGCs residem ao longo da margem ^7,8, então pegar 5-10 células aleatórias em relação à margem de uma linhagem marcado embrião doador freqüentemente resulta na transferência de PGCs. Quando transferido para o pólo animal de um embrião hospedeiro sem rótulo, as células germinativas primordiais ativamente migrar para o gônadas presuntivo, onde podem ser inequivocamente identificado às 24 horas de desenvolvimento por sua posição característica, tamanho grande, e retenção de corante, devido à sua lenta taxa proliferativa ^9-11. Enquanto isso, doador de derivados não-PGCs irá adquirir o destino determinado por sua localização no host: principalmente prosencéfalo e os olhos se eles foram transplantadas para o pólo de animais blástula. Injetar o embrião hospedeiro com morpholinos que derrubar o gene beco sem saída efetivamente eliminar o anfitrião da linha germinativa de uma forma de células autônomas, de modo que mesmo um único doador-derivado PGC podem repovoar a linha germinativa ^10,12 inteira (CM, observação pessoal). Mais recentemente, uma linha transgênica que permite PGCs para ser visualizado em embriões vivos durante as fases de blástula foi desenvolvida ^13. Quando cruzou para o mutante cuja função materna deve ser determinado, este transgene, combinado com o morpholinos beco sem saída, vai fazer transplantes de células germinativas fácil porque PGCs único podem ser identificados e transplantadas para uma série germinativas estão esgotados.

Graças aos membros do laboratório para a entrada Moens útil durante a escrita deste artigo. HK é pós-doutorado apoiado pelo NIH / NICHD conceder # 5R01HD037909-08. CBM é um investigador com o Howard Hughes Medical Institute.