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blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.
복잡한 개발 프로세스에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나는 키메라 배아의 분석이다. 키메라는 하나 이상의 동물에서 세포를 포함하는 유기체로 정의되며 모자이크는 하나 이상의 유전자형의 세포는 일반적으로 야생 - 타입과 돌연변이 혼합되어있는 키메라의 한 종류입니다. zebrafish에서 chimeras은 즉시 적절한 배아 단계에서 호스트 배아에 기증자의 배아에서 세포 이식에 의해 만들 수 있습니다. 표시 기증자 세포는 한 세포 단계의 배아로 같은 형광 염료로 혈통 마커,의 주사에 의해 생성됩니다. 표시 기증자 세포는 기증자의 배아에서 제거하고 화합물 또는 해부 현미경 중 하나에 장착된 오일 제어 유리 피펫을 사용하여 레이블이 지정되지 않은 호스트 배아에 도입하고 있습니다. 기증자 세포가 어떤 경우에는 잘 설립 운명의지도에 따라 호스트 배아에 이식 사이트를 선택하여 개발 blastula 또는 gastrula 무대 호스트 배아의 특정 지역 또는 조직을 대상으로 수 있습니다.
blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.
복잡한 개발 프로세스에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나는 키메라 배아의 분석이다. 키메라는 하나 이상의 동물에서 세포를 포함하는 유기체로 정의되며 모자이크는 하나 이상의 유전자형의 세포는 일반적으로 야생 - 타입과 돌연변이 혼합되어있는 키메라의 한 종류입니다. zebrafish에서 chimeras은 즉시 적절한 배아 단계에서 호스트 배아에 기증자의 배아에서 세포 이식에 의해 만들 수 있습니다. 표시 기증자 세포는 한 세포 단계의 배아로 같은 형광 염료로 혈통 마커,의 주사에 의해 생성됩니다. 표시 기증자 세포는 기증자의 배아에서 제거하고 화합물 또는 해부 현미경 중 하나에 장착된 오일 제어 유리 피펫을 사용하여 레이블이 지정되지 않은 호스트 배아에 도입하고 있습니다. 기증자 세포가 어떤 경우에는 잘 설립 운명의지도에 따라 호스트 배아에 이식 사이트를 선택하여 개발 blastula 또는 gastrula 무대 호스트 배아의 특정 지역 또는 조직을 대상으로 수 있습니다.
파트 1 : 1 - 세포 단계에서 Zebrafish 배아를 주입.
2 부 : 이식하여 키메라 zebrafish의 배아를 만들기.
그림 1 : 키메라 배아를 만들기위한 현미경 설정. A : 해부 현미경 이식 장비는 마이크로 드라이브 (A) 3 방향 꼭지 (D)를 통해 석유 가득한 저수지 (B)와 이식 피펫 (C)에 연결되어있는 기름 가득 해밀턴 주사기로 구성되어 있습니다. 이식 피펫은 자기 발 (F)를 통해 금속베이스 플레이트 (표시되지 않음)에 첨부되어 거친 micromanipulator (E)에 장착됩니다. 이식은 최적의 광학에 대한 하단의 조명을 갖춘 stereomicroscope (G)의 무대에서 수행됩니다. B : 복합 현미경의 이식 장비는 비슷한 기름 가득 해밀턴 주사기와 마이크로 미터 드라이브 (A, B)로 구성되어 있지만이 경우에는 장기 이식 피펫은 누구의 X, Y 및 Z의 움직임을 제어할 수 피펫 홀더 (C)에 탑재 중 굵은 (D) 또는 고급 (E) micromanipulator에 의해. 이 예제에서는 micromanipulator가 고정 단계 현미경의 본문에 탑재, 그러나 그것은 일반 현미경의 무대에 마운트하는 것도 가능합니다. 우울증 슬라이드에 메틸 셀룰로오스에 고정화되는 배아는, 10X 목적 (F)을 사용하여 시각입니다. C : stereomicroscope 이식을위한 배아를 immobilizing에 대한 이식 금형. Dechorionated 배아는 90mm 페트리 접시에 아가로 오스에이 금형을 주조하여 만든 우물에 개별적으로 삭제됩니다. 우물의 크기가 표시됩니다.
그림 2 : gastrula 단계 이식을위한 배아를 장착. A : gastrula 이식 피펫의 이상적인 형태. 날카로운 팁과 베벨은 배아를 관통의 AIDS. B : 메틸 셀룰로오스의 기증자와 호스트 배아를 Immobilizing. 메틸 셀룰로오스의 스트립은 우울증 슬라이드의 우물에 드러 누우 셨다가 배아 매체의 풍부한 양의 홍수입니다. 배아는 배아 매체에 추가하고 작은 루프 (C)를 사용하여 메틸 셀룰로오스에 굴러 있습니다. 그림 배아의 DG 확대. 1B. D :이 단계에서 세포가 계속 커밋되므로 기증자의 배아는 피펫에 대한 쉬운 액세스를 허용하는 방향입니다. 예 : 쉴드 단계 호스트 배아는 대상 영역이 맨 위에되도록 지향하고 있습니다. 박스 지역에 이식 세포는 왼쪽 (E)과 오른쪽 (G) 양쪽 또는 복부 hindbrain 및 척수 (F)로 파생 등의 hindbrain 및 두개골 신경 능선에 기여하는 것입니다.
그림 3 : 키메라 배아 대표 이미지.
왼쪽 앞쪽에 등의보기에 표시되는 실드 단계에서 이식에 의해 생성 (AC) 18hpf 키메라 배아. (A, B) 키메라 배아의 분석에 의해 밝혀 세포 표면 수용체 EphA4에 대한 기능을 정렬. 왼쪽 패널 : 특정 hindbrain 세그먼트 (녹색)로 표시 rhodamine - 라벨 (rhod.) 공여 세포 (적색)와 유전자 변형 GFP의 병합. (A) WT 세포는 제어 키메라 배아의 전체 hindbrain에 기여. (B) EphA4 - 고갈 기증자 세포는 WT 호스트의 hindbrain의 특정 세그먼트에서 제외됩니다. (C) 기증자의 세포가 방패 단계 이식에 신경 튜브의 다른 부분을 타겟으로. EfnB2a의 forebrain를 표시 항체, 중반 hindbrain 경계와 중간 세그먼트와 카운터 묻은 WT 호스트의 forebrain / midbrain (왼쪽 패널) 또는 hindbrain / 척수 (오른쪽 패널)을 타겟으로 공여 세포 (적색) hindbrain (녹색). 스케일 바 : 50μm.
이식이 타겟 chimeras를 생산하는 데 사용할 수있는 용이성은 척추 모델로 zebrafish의 위대한 능력 중의 하나입니다. 위에서 설명하지 않은이 프로토콜의 수정 접합자의 개발에 필수적인 역할과 함께 유전자에 대한 모성 유전자 기능의 분석을 수 있습니다. 이러한 돌연변이 물고기가 성인까지 생존 수 있기 때문에 돌연변이 세포의 'germline의 클론 "을 작성, 기타 야생 형 호스트 배아에 돌연변이 germline을 전송하는 것이 필요합니다. 생성 germline 모자이크는 야생 형 호스트 배아에 돌연변이 기증자로부터 이식 원시 배아 세포를 포함한다. 배아에있는 다른 모든 세포 lineages 달리 배아 세포 계보 (Lineage)는 산모 determinants 5,6의 상속에 의해 초기 개발에 지정됩니다. 따라서 germline의 모자이크 만들기의 첫 번째 도전은 기증자의 배아에 원시 배아 세포 (PGCs)를 식별합니다. midblastula 단계에서 PGCs 그렇게 혈통 - 표시 기증 배아의 여백 50-100 임의의 세포를 채취, 여백 7,8 함께 거주하고 자주 PGCs의 전송 결과. 레이블이 지정되지 않은 호스트 배아의 동물 극으로 전달하면 원시 배아 세포는 적극적으로 그들이 unambiguously 자신의 특성 위치, 대형, 그들의 느린 proliferative 속도로 인해 염료 보존에 의해 개발의 24 시간 확인할 수있는 추정 생식선으로 마이 그 레이션 9-11. 그들이 blastula 동물 극에 이식한다면 주로 forebrain과 눈 : 한편, 비 PGCs는 호스트의 위치에 의해 결정 운명을 습득합니다 기증자 - 파생. 데드 엔드 유전자를 허물고 morpholinos와 호스트의 배아를 주입하는 것이 효과적 그래서, 셀 자율적인 방식으로 호스트 germline을 제거까지만해도 하나의 기증자 파생 PGC는 전체 germline 10,12 (CM, 개인 관찰)을 repopulate 수 있습니다. 최근 PGCs가 blastula 단계 동안 라이브 배아에서 시각 될 수있는 유전자 변형 라인은 13 개발되었습니다. 단일 PGCs가 확인하고 germline - 고갈 호스트로 이식 수 있기 때문에 누구의 모성 기능을 결정하는 돌연변이로 넘어 때, 데드 엔드 morpholinos와 결합이 transgene은 germline 이식 손쉬운하겠습니다.
이 문서의 작성 중에 도움이 입력을위한 Moens 연구실의 구성원 감사합니다. HK는 NIH / NICHD 부여 # 5R01HD037909 - 08에 의해 지원 박사후 사람입니다. CBM은 하워드 휴즈 의학 연구소와 수사관이다.
시약 :이 절차에 사용되는 시약의 많은 조리법이에서 전체 온라인에서 사용할 수 있습니다 Zebrafish 도서에서 발견되는 http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html . 조리법은 생선 물, 엠브료 매체로의 준비와 항생제, dechorionating, 형광등 dextrans에 대한 pronase 및 메틸 셀룰로스없이이 제공됩니다.
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