3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

우리 연구 그룹은 주로 암과 면역 세포 사이의 교차에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 종양 면역의 조절을 통해 두경부암의 진화에 대한 다양한 생물학적 메커니즘의 영향을 조사하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜의 목적은 세포외 기질 내 침입을 평가하고 다층적 맥락에서 다양한 세포 유형의 공간적 공동 국소화를 평가하는 것입니다.

이 프로토콜의 장점은 암세포와 함께 두 가지 관련 비종양 세포 유형을 통합하는 헤테로스페로이드를 사용하여 미세 다공성 막과 화학주성 자극 모두에 대한 세포외 기질의 침입을 분석한다는 것입니다. 시작하려면 세포 현탁액에 자성 나노 입자를 추가하고 10 번 혼합하십시오. 400G에서 실온에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 10회 혼합하여 세포를 재현탁시킵니다.

그런 다음 공동 배양을 위해 새 튜브에 모든 세포를 옮기고 혼합하고 100마이크로리터의 공동 배양 세포를 초저 부착판의 각 웰에 분주합니다. 스페로이드 드라이브 자기장을 플레이트 아래에 삽입하여 응집과 스페로이드 형성을 유도하고 인큐베이터에 3시간 동안 둡니다. 200마이크로리터 팁을 사용하여 24웰 미세 다공성 멤브레인의 중앙에 50마이크로리터의 ECM을 추가합니다.

멸균 바늘로 기포를 제거하고 매트릭스가 멤브레인 표면을 고르게 덮도록 합니다. 겔 형성을 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다. 먼저 3D 세포 배양과 세포외 기질 코팅된 미세 다공성 막을 준비합니다.

화학 유인제로 10% 소 태아 혈청이 보충된 500마이크로리터의 배양 배지를 미세 다공성 멤브레인의 하부 챔버에 추가합니다. 그런 다음 형성된 헤테로스페로이드에서 배지를 조심스럽게 제거하고 스페로이드 위에 웰당 50마이크로리터의 신선한 보충되지 않은 배지를 부드럽게 추가합니다. 멸균 가위를 사용하여 200마이크로리터의 저머무름 팁의 가장자리를 자르고 50마이크로리터의 배지와 함께 스페로이드를 수집합니다.

스페로이드를 세포외 기질 위에 부드럽게 놓습니다. 다음으로, 150마이크로리터의 보충되지 않은 배지를 한 방울 한 방울 조심스럽게 추가하여 총 부피 200마이크로리터에 도달합니다. 플레이트를 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다.

분석 소프트웨어에서 파일을 클릭합니다. 열기를 선택한 다음 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 analyze(분석)를 클릭한 다음 측정값을 설정하여 면적, 통합 밀도 및 디스플레이 레이블을 선택합니다.

확인을 클릭합니다. 마지막으로 분석을 클릭한 다음 측정합니다. 명시야 이미지는 어두운 색 또는 검은색 복합체로 식별되는 스페로이드 또는 세포 국소화를 나타냅니다.

서로 다른 세포의 이미지는 Z축을 따라 서로 다른 이미지에서 형광 강도와 양의 변화를 보였으며, 이는 세포 간의 증식 및 침입 패턴이 서로 다르다는 것을 나타냅니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 침입 중 공동 국소화 패턴을 시각화하기 위해 다양한 채널을 오버레이했습니다. 제시된 대표적인 결과의 이미지 분석에 따르면 단핵구가 먼저 침입하고 그 다음에 종양 세포가 침입하며 섬유아세포가 세포외 기질에 침입하는 마지막 세포입니다.