3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

私たちの研究グループは、主にがんと免疫細胞とのクロストークに焦点を当てています。私たちは、腫瘍免疫の調節を通じて、頭頸部がんの進化に対するさまざまな生物学的メカニズムの影響を調べることを目指しています。このプロトコルの目的は、細胞外マトリックス内の浸潤と、多層的な状況における異なる細胞タイプの空間的共局在を評価することです。

このプロトコルの利点は、癌細胞と並んで2つの関連する非腫瘍性細胞タイプを組み込んだヘテロスフェロイドを使用して、微多孔膜と走化性刺激の両方に向けた細胞外マトリックスの浸潤を分析できることです。まず、磁性ナノ粒子を細胞懸濁液に加え、10回混合します。細胞を室温で400Gで5分間遠心分離し、10回混合して細胞を再懸濁します。

次に、共培養のために新しいチューブ内のすべての細胞を移して混合し、100マイクロリットルの共培養細胞を超低接着プレートの各ウェルに分注します。プレートの下にスフェロイド駆動磁場を挿入して凝集とスフェロイド形成を誘導し、インキュベーターに3時間置きます。200マイクロリットルのチップを使用して、50マイクロリットルのECMを24ウェルの微多孔質メンブレンの中心に追加します。

滅菌針で気泡を取り除き、マトリックスが膜表面を均一に覆うようにします。メンブレンを摂氏37度で1時間インキュベートしてゲル形成します。まず、3D細胞培養と細胞外マトリックスコーティングされた微多孔質膜を調製します。

500マイクロリットルの培養培地を加え、10%ウシ胎児血清を添加して、化学療法誘引剤として微多孔膜の下部チャンバーに加えます。次に、形成されたヘテロスフェロイドから培地を慎重に取り出し、スフェロイドのウェルごとに50マイクロリットルの新鮮な非補充培地を静かに加えます。滅菌ハサミを使用して、200マイクロリットルの低保持チップの端を切り取り、回転楕円体を50マイクロリットルの培地とともに収集します。

スフェロイドを細胞外マトリックスの上にそっと置きます。次に、150マイクロリットルの非サプリメント培地を一滴ずつ慎重に追加して、総容量200マイクロリットルに到達します。プレートをインキュベーターに48時間置きます。

解析ソフトウェアでファイルをクリックします。[開く]を選択し、画像を選択して[OK]をクリックします。次に、[分析]をクリックし、続いて測定値を設定して、面積、積分密度、および表示ラベルを選択します。

[OK]をクリックします。最後に[分析]をクリックし、[測定]をクリックします。明視野画像は、暗いまたは黒いコングロマリットによって識別されるスフェロイドまたは細胞の局在化を表しています。

異なる細胞の画像は、Z軸に沿った異なる画像間で蛍光強度と蛍光量にばらつきを示し、細胞間の増殖と浸潤の異なるパターンを示しました。共焦点顕微鏡を使用して、侵入中の共局在パターンを視覚化するために、異なるチャネルを重ね合わせました。提示された代表的な結果の画像解析は、単球が最初に侵入し、次に腫瘍細胞が侵入し、線維芽細胞が細胞外マトリックスに侵入する最後の細胞であることを示しました。