난소 조직 이식을 연구하기 위한 도구로서의 병아리 맥락막 막(CAM) 모델

난소 조직 이식 후 초기 변화를 관찰하기 위해 CAM을 사용하면 초기 혈관 형성 및 난포 손실 과정에 영향을 미치는 메커니즘을 조사할 수 있기 때문에 체외 모델에 비해 상당한 이점이 있습니다. 이 기술은 비용이 저렴하며, 처음 17일 동안은 자연 배아 면역 결핍으로 인한 이식 거부 반응의 위험 없이 수행할 수 있습니다. 더욱이, 이 접근법은 유럽법 측면에서 윤리적 또는 법적 문제를 제기하지 않습니다.

난자 조작에 필요한 수동 기술을 개발하기 위한 최선의 전략은 실제 실험 전에 배아가 아닌 난자로 훈련함으로써 도달할 수 있습니다. 먼저, 루뱅(Louvain)에서 엄선한 흰다리뿔 병아리로부터 받은 달걀 0개에 마커를 사용하여 라벨을 붙입니다. 뾰족한 끝이 아래를 향하도록 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에서 알을 품습니다.

달걀을 180도 회전시키며, 하루에 2-3회 수작업으로 돌린다. 어둠 속에서 달걀 껍질에 달걀 캔들러를 놓고 마커를 사용하여 달걀 껍질의 에어 포켓 중앙을 정확히 가리킵니다. 조명을 켜고 표시된 위치에서 멸균 직선 핀을 돌려 약 1mm의 구멍을 만듭니다.

달걀 촛대를 사용하여 어둠 속에서 노른자 자루를 찾으십시오. 노른자 자루를 방해하지 않고 달걀 바닥을 향해 45도 각도로 멸균된 19게이지 바늘로 달걀에 구멍을 뚫습니다. 1.5-2밀리리터의 알부민을 흡인하여 CAM을 쉘에서 분리합니다.

그런 다음 접착 테이프로 구멍을 막습니다. 조명을 켜고 수평으로 놓인 달걀에 1x1.5cm 크기의 직사각형 창을 그립니다. 달걀을 한 손으로 잡고 껍질을 깨지 않고 스크롤 톱날을 사용하여 달걀 껍질에 창을 부드럽게 자릅니다.

정기적으로 바람을 불어 껍질 먼지와 부스러기를 제거하십시오. 멸균 집게를 직사각형 쉘 조각 아래로 밀어 넣고 CAM을 손상시키지 않고 깨끗하게 제거합니다. 그런 다음 흰색 외피막을 버리고 배아와 CAM을 확인합니다.

생존 가능한 배아 난자에서는 투명한 알부민, 배아 주위의 혈관 고리, 때로는 박동하는 심장이 병아리 배아 발달 3일째에 관찰됩니다. 층류 후드 아래에서 창이 위를 향하도록 계란 선반에 계란을 놓고 테이프를 떼어냅니다. 멸균 에테르 추출 렌즈 종이의 1cm 정사각형 스트립을 상피 표면에 부드럽게 놓고 즉시 제거하여 CAM의 작은 영역에 외상을 입힙니다.

그런 다음 미세 수술 겸자로 얼어붙은 해동된 난소 피질 스트립 하나를 잡고 수질이 CAM에 닿도록 외상을 입은 CAM에 놓습니다. 이식편을 거시적으로 평가하고 디지털 사진이나 비디오를 캡처하기 전에 이식편에 대한 CAM의 혈관 반응에 특히 주의를 기울이십시오. 작업이 끝나면 집게로 조직이나 주변 CAM을 잡고 가위를 사용하여 CAM에서 이식편을 조심스럽게 절제하여 이식편을 수확합니다.

이식편은 이식 첫날 이후 100%의 사례에서 생존할 수 있었습니다. 그들은 이미 CAM에 부분적으로 부착되어 있었고 혈관화에 필요한 혈관의 바퀴 스포크 패턴을 보여주었습니다. 이식 6일 후, 임플란트는 CAM에 부착되었습니다.

이식 후 3일째 되는 날쯤, 이식편은 CAM의 두 번째 층으로 덮여 캡슐화되었습니다. 이식편은 양호한 혈관 형성을 보였으며 이식의 80%가 난자를 관통했습니다. 두 개의 이식편이 CAM에 부착되지 않고 괴사한 모양으로 나타났으며, 그 결과 6일 후 이식된 조직 생존율이 83%에 달했습니다.

이식의 조직학적 평가에서 모든 시점에서 건강한 모낭이 관찰되었습니다. 이식 후 난포 밀도에서 미미한 감소가 관찰되었습니다. 이식 기간 동안 모낭 생존율은 1일째 95%, 6일째 83%로 유지되었습니다.

가장 어려운 부분은 창을 만들기 전에 알부민을 흡인하고 달걀 껍질에서 CAM을 분리하는 데 필요한 작은 구멍을 만드는 것입니다. 너무 많은 압력을 가하면 과도한 자극이 발생하거나 난자가 깨져 파괴되어 CAM 또는 혈관 조직에 돌이킬 수 없는 손상을 줄 수 있습니다. 이 모델은 혈관 신생 유발 인자, 보호 항산화제, 사이토카인, 호르몬 및 난포 활성화 및 조기 성장을 제어하는 기타 인자의 영향을 포함하여 이식 후 초기 난소 조직의 여러 측면을 테스트하는 데 이상적입니다.

이 모델은 난소 조직 이식 후 난소 예비력 감소를 초래하는 두 가지 주요 사건인 초기 혈관 형성과 난포 활성화 조절 사이의 연관성을 나타냅니다.