L’utilisation de la CAM pour observer les changements précoces après une greffe de tissu ovarien présente un avantage significatif par rapport aux modèles in vitro, car elle permet d’étudier les mécanismes affectant le processus de vascularisation précoce et de perte de follicules. Cette technique est peu coûteuse et peut être réalisée sans risque de rejet du greffon en raison de l’immunodéficience naturelle de l’embryon pendant les 17 premiers jours. De plus, cette approche ne soulève aucune préoccupation éthique ou juridique au regard du droit européen.
La meilleure stratégie pour développer les compétences manuelles nécessaires à la manipulation des ovules peut être atteinte en s’entraînant avec des ovules non embryonnés avant l’expérience proprement dite. Pour commencer, étiquetez les œufs du jour zéro reçus de Louvain à l’aide d’un marqueur. Incubez les œufs dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius, avec les extrémités pointues vers le bas.
Faites pivoter les œufs de 180 degrés, deux à trois fois par jour manuellement. Dans l’obscurité, placez un chandelier à œufs contre la coquille d’œuf et repérez le centre de la poche d’air sur la coquille d’œuf à l’aide d’un marqueur. Allumez les lumières et faites tourner une broche droite stérile à la position marquée pour faire une ouverture d’environ un millimètre.
Localisez le sac jaune dans l’obscurité à l’aide du chandelier à œufs. Piquez l’œuf à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 19, inclinée à 45 degrés vers le bas de l’œuf, sans perturber le sac jaune. Aspirer 1,5 à deux millilitres d’albumine pour détacher le CAM de la coquille.
Fermez ensuite le trou avec du ruban adhésif. Allumez les lumières et dessinez une fenêtre rectangulaire mesurant un centimètre sur 1,5 centimètre sur l’œuf placé horizontalement. Tenez l’œuf dans une main et coupez doucement une fenêtre dans la coquille de l’œuf, à l’aide d’une lame de scie à chantourner, sans fissurer la coquille.
Soufflez régulièrement pour enlever la poussière et les débris de la coquille. Glissez la pince stérile sous le morceau rectangulaire de la coquille et retirez-la proprement sans endommager la came. Ensuite, jetez la membrane blanche de la coquille extérieure pour voir l’embryon et le CAM.
Dans les ovules embryonnés viables, de l’albumine claire, un anneau vasculaire autour de l’embryon et parfois un cœur battant sont observés au troisième jour du développement de l’embryon de poussin. Sous la hotte à flux laminaire, placez l’œuf sur le support à œufs avec la fenêtre vers le haut et décollez le ruban adhésif. Placez délicatement et retirez immédiatement une bande carrée d’un centimètre carré de papier stérile extrait à l’éther sur la surface épithéliale, pour traumatiser une petite zone de la CAM.
Ensuite, saisissez une bandelette corticale ovarienne congelée et décongelée avec des pinces microchirurgicales et placez-la sur la CAM traumatisée avec le côté médullaire contre la CAM. Évaluez le greffon macroscopiquement et portez une attention particulière à la réaction vasculaire du CAM envers le greffon avant de prendre des photos ou des vidéos numériques. Une fois cela fait, récoltez le greffon en saisissant le tissu ou la CAM environnante avec une pince, et en excisant soigneusement le greffon de la CAM à l’aide de ciseaux.
Les greffons étaient viables dans 100% des cas après le premier jour de la greffe. Ils adhéraient déjà partiellement à la CAM et présentaient le motif des rayons de roue des vaisseaux sanguins nécessaires à leur vascularisation. Après six jours de greffe, les implants ont été collés à la CAM.
Vers le troisième jour après la transplantation, les greffons ont été recouverts d’une deuxième couche de CAM et ont été encapsulés. Le greffon a montré une bonne vascularisation, 80% des greffons pénétrant dans l’ovule. Deux greffons ne se sont pas attachés à la CAM et ont pris un aspect nécrotique, ce qui a entraîné un taux de survie du tissu greffé de 83 % après six jours.
Lors de l’évaluation histologique de la greffe, des follicules sains ont été observés à tous les moments. Après la transplantation, une diminution insignifiante des densités folliculaires a été observée. Les taux de survie des follicules ont été maintenus pendant la période de greffe à 95 % le premier jour et à 83 % le sixième jour.
La partie la plus difficile est de faire le petit trou nécessaire à l’aspiration de l’albumine, de détacher le CAM de la coquille d’œuf, avant de créer une fenêtre d’application. Trop de pression peut entraîner une surstimulation, ou même fissurer et détruire l’ovule, causant des dommages irrévocables à la CAM ou à son système vasculaire. Ce modèle est idéal pour tester plusieurs aspects de la période post-greffe du tissu ovarien précoce, y compris l’impact des facteurs pro-angiogéniques, des agents antioxydants protecteurs, des cytokines, des hormones et d’autres facteurs contrôlant l’activation des follicules et la croissance précoce.
Ce modèle a mis en évidence le lien entre la vascularisation précoce et la modulation de l’activation folliculaire, qui sont les deux principaux événements entraînant le déclin de la réserve ovarienne après une greffe de tissu ovarien.
