당사의 PLA 프로토콜을 사용하면 막 접촉 부위에서 단백질 간의 내인성 상호 작용을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 우리는 소포체 미토콘드리아 접촉 부위에서 두 개의 소포체 단백질 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용했습니다. 이 기술은 PLA와 세포 소기관 염색 및 세포 소기관의 거리 분석을 결합합니다.
그것은 세포 기관 간 세포 간 접촉 부위에서 단백질 사이의 상호 작용을 현지화하고 정량화 할 수 있습니다. 근접 결찰 분석(PLA)과 영상 획득을 수행한 후, MATLAB을 시작하고 Mac 운영 체제에서 Imaris 옵션을 클릭하거나 Windows에서 편집 메뉴를 클릭하여 확장 프로그램을 시작하도록 세포 분석 소프트웨어를 설정합니다. 환경 설정을 선택하고 사용자 정의 도구 패널로 변경한 다음 경로를 설정합니다.
이미지를 소프트웨어로 가져오려면 아레나 섹션을 통해 직접 또는 일괄 변환이 가능한 독립형 파일 변환기를 사용하여 컨포칼 스택 이미지를 IMS 파일로 변환합니다. 가져온 후 편집을 클릭하고 이미지 속성으로 이동한 다음 이미지 지오메트리를 선택하여 이미지 보정을 확인합니다. 복셀 크기가 X와 Y의 실제 이미지에 대해 예상되는 픽셀 크기와 일치하는지 확인하고, 현미경으로 Z 스택을 생성하기 위해 적용한 단계를 Z.To 다른 채널의 대비를 조정합니다. 메뉴에서 편집을 클릭하고 디스플레이 조정으로 이동하여 디스플레이 조정 표시를 선택합니다.
각 채널을 독립적으로 조정하여 각 색상의 표시를 최적화합니다. 이 단계는 정확한 임계값을 설정하거나 약한 물체를 감지하는 데 필수적입니다. 그런 다음 편집을 클릭하고 3D 자르기를 선택하여 이미지를 잘라내어 분석을 단일 셀로 제한합니다.
동일한 시야에서 다른 셀을 분석하려면 동일한 이미지를 다시 열고 다르게 자릅니다. 새 스팟 추가 옵션을 클릭하여 ORP5 및 ORP8 상호 작용 위치에서 생성된 PLA 신호를 감지하면 새 객체 세트가 생성되고 스팟 감지 마법사가 열립니다. 스팟 감지를 수행할 채널을 선택합니다.
추정된 XY 지름을 조정하면 스폿 검출 알고리즘이 관심 있는 물체를 쉽게 찾을 수 있습니다. 선택한 값이 너무 높으면 주변 물체가 융합되고 값이 너무 작으면 비정상적인 신호가 감지될 수 있습니다. 이제 배경 빼기를 클릭하여 스팟 감지 전에 이미지 배경을 제거하여 관심 개체 주변의 로컬 대비를 향상시킵니다.
품질을 소프트웨어 자동 임계값의 임계값 매개변수로 유지하여 스팟 감지 임계값을 조정하거나 이 값을 약간 수정하여 모든 물체를 감지합니다. 스팟 검출이 완료되면 검출 파라미터를 저장하고 이를 재사용하여 다른 이미지를 처리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 네트워크를 감지하여 새 표면 추가를 클릭하여 새 개체를 만들고 표면 감지 마법사를 열어 표면 렌더링을 생성합니다.
지표면 작성을 수행할 채널을 선택합니다. 가우스 필터를 적용하면 매끄러운 확인란을 클릭하고 표면에서 관찰할 수 있는 사소한 세부 사항을 나타내는 임계값을 설정하여 더 매끄러운 표면을 얻을 수 있습니다. 그런 다음 배경 빼기를 수행하여 로컬 대비를 향상시키고 임계값을 조정하여 신호 강도에 따라 미토콘드리아 네트워크를 감지합니다.
표면 분류 창에서 복셀 필터의 수를 선택하여 임계값에서 작은 잔차를 제거하기 위해 표면에 필터를 적용하고, 상한 및 하한 임계값을 사용하여 관심 있는 객체만 유지합니다. 표면 생성이 끝나면 생성 매개변수를 저장하고 이를 다시 사용하여 다른 이미지를 처리합니다. 생성된 미토콘드리아 표면 외부에 거리 맵을 생성하려면 장면 트리 상자에서 미토콘드리아 표면을 선택합니다.
이미지 처리를 클릭하고 표면 기능을 선택한 다음 거리 변환을 선택합니다. 맵을 객체 표면의 바깥쪽에서 계산할지 아니면 안쪽에서 계산할지를 선택하도록 요청하는 MATLAB 확장 프로그램이 표시됩니다. PLA 반점과 미토콘드리아 표면 사이의 거리를 측정하기 위해 외부 표면 물체를 선택합니다.
맵이 생성되면 디스플레이 조정 패널에 새 채널로 나타납니다. 이 채널에서 모든 픽셀은 가장 가까운 미토콘드리아까지의 거리에 해당하는 값을 갖습니다. 장면 트리 상자에서 이전에 생성된 스팟을 선택하여 각 지점에서 가장 가까운 미토콘드리아까지의 거리를 측정하고 가장 가까운 스팟을 식별하고 시각화합니다.
이제 통계 및 상세 로그에서 거리 지도에 해당하는 채널의 특정 값과 중심 강도를 선택하여 거리 지도에서 미토콘드리아에 가장 가까운 거리에 해당하는 각 스폿 중심의 값을 측정합니다. 창 왼쪽 하단에 있는 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다. 미토콘드리아까지의 거리를 기준으로 스팟의 하위 모집단을 추출하려면 씬 트리에서 스폿을 선택하고 필터 탭을 클릭합니다.
이 창에서 거리 맵에 해당하는 채널의 중심 강도를 기반으로 새 필터를 추가하고 하한 임계값을 0마이크로미터로 설정하고 상한 임계값을 0.380마이크로미터로 설정하여 미토콘드리아에서 380나노미터 미만의 지점을 추출합니다. 선택한 스팟에 초점을 맞추기 위해 새 스팟에 선택 영역 복제 버튼을 눌러 복제 단계를 수행합니다. 내인성 ORP5-ORP8 PLA의 컨포칼 이미지는 일반적으로 미토콘드리아 관련 ER 막이라고 하는 미토콘드리아와 밀접하게 접촉하는 망상 ER, 피질 ER 및 ER 하위 도메인의 HeLa 세포에서 상호 작용을 보여주었습니다.
3D 이미징 분석에 따르면 미토콘드리아 관련 ER 막에서 내인성 ORP5-ORP8 PLA 상호 작용의 약 50%가 검출되었습니다. ORP5 및 ORP8을 공동 과발현하는 세포의 미토콘드리아 관련 ER 막에서 발생하는 ORP5-ORP8 PLA 상호작용의 백분율은 이들 단백질이 내인성 수준에서 발현된 세포에서 관찰된 것과 유사하였다. ORP5 및 ORP8 하향 조절은 PLA 신호의 총 수를 크게 감소시킨 반면, 이들의 동시 과발현은 PLA를 증가시켰다.
PLA 신호는 ORP5-PTPIP51 및 ORP8-PTPIP51 커플에서 검출되었으며, 이들의 평균 수치는 ORP5-ORP8 PLA 커플과 유사하여 ER-미토콘드리아 막 접촉 부위에서 ORP5 및 ORP8 국소화를 확인하였다. 또한, 미토콘드리아, ER 및 지질 방울 사이의 3원 접촉 부위에서 ER 원형질막 접촉에서 ORP5-ORP8 PLA의 상호작용은 PHPLCD-RFP 또는 mCherry-PLN1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하여 확인됩니다. 모든 이미지 분석 방법과 마찬가지로 이미지 품질이 핵심이므로 신호의 최적화는 물체의 자동 감지에 결정적입니다.
이 기술은 또한 3 자 ER, 미토콘드리아, 지질 방울 접촉 부위에서 ORP5 및 ORP8 기능에 대한 최근 연구에서했던 것처럼 두 개 또는 여러 세포 소기관 간의 연관성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 세포 내 통신 분야의 다른 연구에서 새로운 다자간 세포 기관 간 연관성을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
