This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).

1. 공동 면역 침전 <ol><li> 씨앗 하나 6 웰 플레이트에 웰 당 2 × 10 5 세포에서 HEK293 세포 2 ㎖의 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 함께 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) 보충 100 U / mL의 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균) . </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 세포를 성장. </li><li> 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 5 분 500 XG에 원심 분리하여 수확 세포. </li><li> 상업 핵 및 세포질 추출 시약을 사용하여 핵 및 세포질 분수를 준비합니다. 일부 수정과 제조업체의 지시 사항을 따르십시오. <ol><li> 하나의 공동 면역 실험 (한 6 웰 플레이트의 3 우물에서 약 90 %의 컨 플루)에 대한 3 × 10 6 세포를 사용합니다. 최고 속도로 15 초 동안 300 μl의 차가운 세포질 추출 용액 (CER의 I)와 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 얼음에 30 분 동안 품어. 배양, vorte 중5 초마다 10 분 동안 X. </li><li> 5 초 동안 16.5 μl의 차가운 세포질 추출 용액 II (CER II), 소용돌이를 추가하고 얼음에 5 분 동안 품어. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 16,000 XG에 5 초 원심 분리기를위한 소용돌이. </li><li> 새로운 사전 냉각 튜브에 뜨는 (세포질 추출물)를 전송하고, 사용까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 때마다 최대 피펫 팅에 의해 5 배 아래로 1 ml의 차가운 PBS와 불용성 펠렛 (포함하는 핵)을 세 번 씻으십시오. 세척 후 PBS를 제거합니다. </li><li> 15 초 동안 150 μl의 차가운 핵 추출 용액 (NER), 소용돌이를 추가하고 얼음에 1 시간을 품어. 배양하는 동안, 15 초 및 피펫 200 μl의 팁 10 시간마다 10 분 동안 소용돌이. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에 15 초 동안 소용돌이와 원심 분리기. </li><li> 새로운 사전 냉각 튜브에 뜨는 (핵 추출물)로 이동시켜 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 각각의 입력으로 핵 및 세포질 추출물의 볼륨의 10 %를 가져 가라. </li><li> 에이1 ml의 최종 용적에 남아있는 추출물을 차가운 PBS를 위해 dd. 얼음에 사용할 때까지 보관하십시오. 주 : 단백질 G 공역 자성 비드를 사용하는 경우 사전 클리어링이 필수적인 것은 아니다. 백그라운드가 높은 경우에는, 40 ㎕의 단백질 G 공역 자성 비드 (50 % 슬러리)와 회 전자에서 30 분 동안 4 ℃에서이 단계에서 해물 희석 한 용액을 배양하여 전 소거를 수행한다. 자기 랙 구슬에서 분리 된 상층 액 (사전 허가 해물). 구슬을 폐기하십시오. </li><li> 단백질 G-복합 자석 구슬 몇 차 항체로, 4 μg의 토끼 다 클론 항 RBM3 항체 또는 토끼의 IgG (음성 대조군) 200 ㎕의 PBS에 플러스 트윈 20 버퍼와 단백질 G - 복합 자석 구슬 (50 % 슬러리) μL (40)을 품어 (PBST, 0.02 % 트윈 20)가 회 40 분 동안 실온 (RT)에서. </li><li> 별도의 자기 랙 구슬과 뜨는 항체를 결합하고, 상층 액을 버린다. 200 μL PBST (0.02 %) 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 1 추가용액은 비드 해물을 (또는 필요한 사전 허가 해물 경우)로 희석하고, 밤새 4 ℃에서 회전에 배양한다. </li><li> 다음 날, 자기 랙에 의해 구슬과 상층 액을 분리하고, 상층 액을 버린다. 20 rpm의 고정 된 속도로 회 전자에 4 ° C에서 각각의 튜브 0.5 ml의 PBST (0.02 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> 40 ㎕의 시료 완충액 (1X 상업용 샘플 버퍼의 50 mM 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT))를 첨가하여 비드로부터 단백질을 용출. 10 분 동안 70 ℃에서 가열한다. 새로운 1.5 ML 튜브에 스핀 다운 및 전송 액체. </li><li> 10 분 동안 70 ℃에서 가열 (1X 상업용 샘플 완충액 50 mM의 DTT, 최종 농도)을 샘플 버퍼에 입력 해물을 희석. 프리 캐스트 4-12% 비스 - 트리스 젤 마지막 단계에서로드 입력과 면역 단백질. 각 웰의 적재 부피는 20 μl를 초과 할 수 없습니다. 35 분 동안 얼음에 1 배 상업 운전 버퍼에 전기 영동을 수행합니다. 참고 :로드 핵 및 세포질 추출물셀의 동일한 초기 량을 반영 (2) (V / V를) : 1의 비율로 S. </li><li> 4 ° C에서 2 시간 동안 30 V에서 1 배 상업 전송 버퍼에서 PVDF 막에 전달 단백질. </li><li> 5 % 차단 막을 진탕 기에서 40 분 동안 RT에서 우유 PBST (0.1 % 트윈 20)를 미끄러 져. </li><li> 밤새 4 ° C에서 PBST (0.1 %)에서 : 일차 항체와 멤브레인 (1,000 두 1에 희석) 품어. </li><li> 쉐이커에 RT에서 PBST (0.1 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> 1 시간 동안 RT에서 PBST (0.1 %)에서, (5000 모두 1로 희석) 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)와 함께 막을 인큐베이션 항 - 마우스 또는 항 - 토끼 이차 항체를 π 공역. </li><li> 쉐이커에 RT에서 PBST (0.1 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> cm 2 막 당 0.2 ml의 강화 된 화학 발광 (ECL) 기판 혼합물을 사용하여, 5 분 동안 실온에서 품어. 빨간 불빛을 제외하고 이후이 단계에서 모든 빛을 피하십시오. </li><li> 액체 버리고 필름 카세트에 X 선 필름에 노출. 자동 필름 홍보를 사용하여 필름 개발ocessing 기계. </li></ol> 2. 면역 세포 화학 및 근접 내고 분석 <ol><li> 시드 0.4 ㎖의 DMEM 한 8 실, 폴리 D 라이신 코팅 된 슬라이드 챔버 당 1.5 × 104 세포의 HEK293 세포는 10 % FBS, 100 U / ㎖ 펜 연쇄상 보충. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 세포를 성장. </li><li> 대기음 매체 및 RT에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다. </li><li> 대기음 PFA, 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 세척 3 × 10 분. </li><li> Permeabilize 하시려면 1 시간 동안 실온에서 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 블록 셀. </li><li> 밤새 4 ° C에서 통에 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 및 5 % NGS의 일차 항체와 함께 품어. 마우스 단일 클론 항 NF90 항체 토끼 다 클론 항 RBM3 항체 1을 희석 : PBS 100을 두 번 염색을 위해. 음성 대조군의 경우, 독립적으로 두 일차 항체 중 어느 하나를 생략하고, 제 3 제어 모두 항체 생략. 참고 : 광고 차단 및 희석 시약을 사용하지 마십시오. </li><li> 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> 면역 세포 또는 근접 내고 분석 프로토콜에 따라 <ol><li> 면역 세포 화학 <ol><li> 부화 1 : 500 희석 된 녹색 형광 염료가 결합 된 항 - 마우스 및 적색 형광성 염료 결합 항 - 토끼 이차 항체를 실온에서 1 시간 동안. 이후이 단계에서 빛을 피하십시오. </li><li> 10 분 동안 실온에서 PBS로 5,000 : 4 &#39;, 6-diamidin -2- phenylindol (DAPI)로 Counterstain과 핵 (1) 희석 하였다. </li><li> 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 3 × 10 분을 씻으십시오. </li><li> 유리 슬라이드 건조에서 챔버를 제거합니다. 슬라이드 당 매체를 장착, 250 μ으로 마운트합니다. </li></ol></li><li> 근접 내고 분석 <ol><li> 근접 내고 분석 프로브를 준비합니다. 믹스와 일을 결찰 수있는 다른 올리고 뉴클레오티드로 연결된 두 개의 근접 내고 분석 프로브 (항 - 마우스 및 안티 - 토끼 보조 항체를 희석하나 8 챔버 슬라이드 (cm 2 당 약 40 ㎕를 320 ㎕의 총 부피로 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 5 5 % NGS) 다른 두 연결 용액의 올리고 뉴클레오티드)을 모두 한 거친 첨가 . 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 유리 슬라이드에서 챔버를 제거하고 희석 프로브를 추가 할 수 있습니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 습도 인큐베이터에서 인큐베이션. </li><li> 연결 용액을 준비합니다. 8 리가 ㎕를 혼합 64 μl를 5 × 결찰 재고 및 248 μL의 H 2 O </li><li> 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 (A)에 2 × 5 분을 씻어 (키트와 함께 제공). </li><li> 라이 게이션 용액을 첨가하고 30 분 동안 37 ℃에서 습도 인큐베이터에서 배양한다. </li><li> 증폭 솔루션을 준비합니다. 이후이 단계에서 빛을 피 4 μL 중합 효소, 64 ㎕의 5 배 증폭 재고 및 252 μL의 H 2 O를 섞는다. </li><li> 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 A에 2 × 2 분을 씻어 </li><li> 앰프 추가lification 용액을 100 분 동안 37 ℃에서 어두운 습도 인큐베이터에서 배양한다. </li><li> 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 B에 2 × 10 분을 씻어 (키트와 함께 제공). 0.01x 세척 버퍼 B.에서 1 분 동안 세척 </li><li> 슬라이드를 건조 및 슬라이드 당 (DAPI)와 상업 장착 매체의 250 μl를 마운트. </li></ol></li></ol></li><li> 10 배의 접안 렌즈와 20 배 대물 렌즈를 사용하여 현미경 형광 신호를 검사합니다. CCD 카메라에 의해 화상을 취득. </li></ol>

<ol>
	<li>Pati&#241;o, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF90+isoforms,+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication?.">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?.</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li><li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization.">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway.">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li><li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits,+alters+microRNA+levels,+and+enhances+global+protein+synthesis.">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li><li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+mouse+Rbm3,+a+cold-shock+protein,+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis.">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li><li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism.">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li><li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma.">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

두 방법에 대한 몇 가지 장점뿐만 아니라 단점이있다. 비교적 새로운 기술로서, 인접 결찰 분석법의 명백한 이점은 단일 세포 수준 대신 이기종 셀 배치의 단백질 - 단백질 상호 작용을 규명 할 수있는 가능성이다. 높은 크기 및 (공 초점 현미경으로 예) 해상도의 이미지는 하나의 형광 반점을 계산하여 정량화에 대한 가능성을 제공합니다. 대조적으로, 웨스턴 블랏과 공동 면역 침전 기술의 통상적 인 조합은 단지 적절한 로딩 컨트롤 IP 샘플에 대해 결정하기 곤란하기 때문에, 주로 단백질 밴드를 반 정량 할 수있다. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용은 공 면역 침전 또는 융합 태그 인공 과발현 시스템에 필요한 생체 물질, 예를 들어, 세포 또는 조직, 다량의 상호 작용을 검출 할 수있는 기회를 향상시키기 위해 적용되며, 약하거나 과도 때 . 또한, 검출 t이러한 질량 분석법 등의 고감도 echniques 실험의 품질을 향상시킬 수있다. 그러나, 원료의 양에 대하여 근접 결찰 정량법 명확한 이점을 갖는다. 단지 몇 개의 세포가 필요한 항체의 높은 품질이 제공 제공된다. 또한, 조직 샘플에서, 조직 구조 및 세포 유형에서 다른 단백질 - 단백질 상호 작용의 동일계 시각화 정상적인 면역과 동일한 패턴에 근접 결찰 분석법에 의해 달성 될 수있다. 대조적으로, 공동 면역 침전은 단백질 - 단백질 상호 작용의 공간 분포를 표시 부적당 그 성질이다. 대형 핵 작지만 세포질 구획 셀, 인접 결찰 분석 방법은 핵 세포질 분포 전통적인 공동 면역 침전 분석 자체 우월성을 갖는다 제한된다. 예를 들어 T 림프구 세포주의 예는 Jurkat 세포의 핵 - 세포질 DISTRI핵이 세포 내부의 거의 전체 공간을 차지하기 때문에 인접 결찰 분석 기술에 의해-NF90 RBM3 상호 작용 butions은 제한되고, 세포질 구획의 경계를 확인하기 어렵다. 핵과 세포질의 비율이 매우 불균형 때, 일반적으로 면역 세포에 대한 일반적인 문제가 될 수있다. 그러나,이 상황에서 공동 면역 이러한 제한을받지 않는다. 근접 결찰 분석법에 관한 하나의 특별한 관심은 근접 결찰 분석법에서 신호가 직접 또는 간접적으로 단백질 - 단백질 상호 작용을 나타내는 것인지이다. NF90 및 RBM3 모두 RNA 결합 특성을 가지고 우리의 이전 연구 (7)에보고 된 상호 작용은 RNA에 따라 달라집니다. 따라서,의 RNase와 세포 용 해물의 전처리 NF90 및 RBM3 아무것도 사이의 상호 작용이 공동 면역 침전 법 (7)에 의해 검출 될 수 녹는다. 그러나, 근접 내고 분석 신호는 영향을받지 않습니다RNA 의존성 단백질 - 단백질 상호 작용은 두 단백질 사이의 거리가 일반적으로 직접적인 상호 작용으로 간주 이하가 40nm 인 경우는 생성되는 바와 같이, RNA 종을 잃을지라도. 근접 내고 분석의이 속성은 RNA 중재를 필요로하는 상호 작용을 폐지 할 수있다 세포 용 해물에서의 RNase 자료 등의 공동 면역에서 기술적 인 문제를 극복 할 수 있습니다. RNA의 의존성 단백질 - 단백질 상호 작용이 실제로 생리적 조건에서 특정 RNA의 부족으로 인해 존재하지 않는 경우, 다른 한편으로는, 근접 결찰 분석 방법은 또한 위양성 신호를 생성 할 수있다. 특별한주의가 가치가있는 또 다른 문제는 일차 항체의 특이성 단백질 이성체, 전구체 단백질 응집체의 가능성이다. 우리 NF90에 비해 긴 NF90 이성체, NF110은 (FI 훨씬 덜 풍부 HEK293 세포에서 모두 핵과 세포질하다 웨스턴 블롯에 의해 관찰gure 1). 그러나, 공동 면역 침전은 NF110 높은 결합력 특히 핵 RBM3 위해 풀린다. 세 가지 주요 밴드는 핵에 RBM3의 말에 발견 된, 만 20 kDa의 정상 RBM3 밴드는 주로 세포질에서 관찰되었다. 다른 두 50 kDa의 100 kDa의 밴드가 결합 된 RBM3와 RBM3 이성체, 전구 물질, 단백질 응집체를 반영하거나 인해 불특정 배경에되었는지 밝혀지지 남아있다. 근접 결찰 분석법이 면역에 기초하고 있기 때문에 동시 면역은보다 항체 특이성 또는 단백질 이성체 및 전구체에 대한 추가 정보를 제공 할 수 있지만, 대신, 근접 결찰 분석법, 단백질 이성체, 전구체 응집체 또는 비특이적 염색 상이한 간의 차이를 구별 할 수있다 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하는 근접 결찰 분석법. 핵에서 관찰 세 RBM3 대역을 고려할 때 RBM3에 관해서는, 웨스턴 블롯 결과는 지배적 인 핵와 일치 localizatiRBM3의에 면역 염색으로 관찰. 결론적으로, 모두 공동 면역과 근접 내고 분석 기술은 고유의 장점과 제한이 있습니다. 많은 경우에, 그들은 일관성있는 결과를 생성하지만, 체계적 특정한 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사 할 때 두 가지 기술을 사용하는 것이 유리하다. 그러나 특별한 경우 또는 특정 목적으로, 하나는 다른 것보다 우월를 표시 할 수 있습니다. 최근 근접 결찰 분석법 신규 예후 마커 (12)을 개발하는 화면의 단백질 - 단백질 상호 작용에 사용되어왔다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 하나의 단백질보다 더 신뢰할 수있는 바이오 마커로 간주됩니다. 이러한 바이오 마커의 동정 및 특성은 여전히 ​​저 종래 공동 immuoprecipication 필요하지만 향후에는 근접 결찰 분석은 잠재적으로, 병원에서의 진단 및 예후 바이오 마커로서 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을 위해 신속하고 신뢰할 수있는 방법이 될 수있다THOD.

핵 인자 90 (NF90)은 인터루킨 -2 후 전사 및 miRNA의 생합성 1-3의 규제의 바이러스 감염에 대한 반응 조절 등 다양한 기능을 가진 멀티 이소 단백질이다. RBM3는 RNA 결합 단백질 번역 및 miRNA의 생합성에 관여 저체온증 저산소증 4-6을 포함하는 다양한 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 최근에, 우리는 단백질 복합체 7 NF90 및 RBM3를 발견했다. NF90 RBM3과의 상호 작용은 단백질 펼친 응답 7 단백질 키나제 RNA 같은 소포체 키나제 (PERK) 활성을 조절하는 것이 필수적이다. NF90 및 RBM3 모두 핵하지만 세포질에 작은 NF90의 비율과 RBM3 셔틀에 주로 위치하며, PERK 활동을 조절하는 특정 기능을 위해 서로가 예를 결합한다. 따라서, 어느 것을 나타낼 수 있고, 세포 내 구획에서-NF90 RBM3 상호 작용의 분포를 시각화하는 것이 중요각각의 구획에서의 다양한 역할. 수십 년 전에, 효모 두 하이브리드 (Y2H)는 두 단백질 (8) 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 개발되었다. 그러나, 융합 단백질의 인공 건설, 거짓 양성 결과는이 방법의 적용을 제한하고있다. 오랫동안, 공동 면역 침전 특히 내인성 조건 9, 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는 주요 기술이다. 최고 감도 및 정밀도가 요구되는 경우, 질량 스펙트럼에서 사용되는 동안에 공동 면역 침전 된 단백질 복합체를 분석, 웨스턴 블롯, 가장 편리한 기술이다. 최근, 근접 결찰 분석은 동일계 10,11 모두에서 세포 및 조직에서의 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 신규 한 방법으로 개발되었다. 여기서는 NF9 캡처에서 가장 인기있는 공동 면역 침전 법 및 비교적 신규 근접 결찰 분석 방법에 비해세포 내 분수에 0 RBM3 상호 작용. 우리는 또한 장점과 두 가지 기술의 한계를 논의했다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>High glucose 
			4500 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRBP76 (NF90/NF110) antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>612154</td>
			<td>use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBM3 antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>14363-1-AP</td>
			<td>use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin A/C antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2032</td>
			<td>use 1:1000 for WB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8245</td>
			<td>use 1:1000 for WB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal rabbit IgG</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#7074</td>
			<td>use 1:5000 for WB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse HRP secondary antibody</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4759.1</td>
			<td>use 1:5000 for WB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>CarlRoth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td>
			<td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP00061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX X-ray film</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>4741029230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide</td>
			<td>Corning BioCoat</td>
			<td>354632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink PLA&#160; probe Anti-rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Wash Buffers Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AX-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>SPOT</td>
			<td>Insight 2MP Firewire</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Super RX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film processing machine</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>FPM-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of protein-protein interaction in nuclear and cytoplasmic fractions by co-immunoprecipitation and in situ proximity ligation assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.

도 1 및 NF90 RBM3 모두 핵 단백질과 작은 부분이 세포질에 존재하는 것을 보여준다. 특히, RBM3에 대한 긍정적 인 스테인드 세 가지 밴드가 있습니다. 20 kDa의 아래 작은이 RBM3의 정확한 크기를 반영 (RBM3의 예측 분자량이 17 kDa의)입니다. 다른 두 밴드의 기원은 조사가 남아있다. 미끼 단백질로 RBM3와 공동 면역 침전 실험 NF90-RBM3 상호 작용은 핵 및 세포질에서 소수 민족에 주로 존재하는 것으로 나타났습니다. 공동 면역 침전 데이터는 각각의 단일 단백질의 현지화를 지원합니다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, NF90 및 RBM3 주로 핵하지만 시튜 세포질에 위치한다. 두 단백질 모두 구획에 완벽한 공동 현지화을 보여줍니다. 근접 내고 분석은 패턴을 밝혀세포의 대부분의 핵에있는 대부분의 상호 작용으로, 기존의 면역 세포와 매우 유사하다 NF90-RBM3 상호 작용의. 만 세포의 작은 비율은 NF90-RBM3 상호 작용의 주로 세포질 분포를 보여 주었다. 종합적으로, 공동 면역 침전 법 및 근접 내고 분석 기술은 기본적 핵과 세포질 구획에 단백질 - 단백질 상호 작용의 동일한 배광 패턴을 반영한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55218/55218fig1.jpg" /> 그림 1 : NF90 및 RBM3 및 HEK293 세포의 핵 및 세포질 분수에서 그들의 상호 작용의 웨스턴 블롯 분석. 핵과 세포질 추출물의 비율로 SDS-PAGE 겔에 로딩하고 1 : 2 (V / V), 추출 프로토콜에서 명시된 바와 같이 셀의 동일한 양을 반영. 라민 및 GAPDH 핵으로 사용했다각각과 세포질 마커. 공동 면역 침전은 음성 대조군으로서 항 - RBM3 항체 또는 토끼 IgG를 사용하여 수행 하였다. 핵과 세포질 추출물도 1의 비율로 안티 RBM3 항체로 인큐베이션 하였다 : 2 (V / V)를 각각. NF90 오의 상위 대역은 110 kDa의 긴 이성체 NF110를 나타냅니다. N : 핵 추출물; C : 세포질 추출물, IP : 면역. 단백질 마커는 RBM3 긍정적 밴드 표지 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55218/55218fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55218/55218fig2.jpg" /> 그림 2 : 면역 세포 화학 및 HEK293 세포의 근접 내고 분석. (A) 항 NF90 (녹색) 및 항 RBM3 (적색) 항체 HEK293 세포의 이중 염색. NF9의 명확한 세포질 공동 현지화와 쇼 세포 화살표0 RBM3. 핵은 DAPI (파란색)으로 대조 하였다. 안티 NF90 및 HEK293 세포에서 항 RBM3 항체와 (B)의 근접 결찰 분석법. 적색 형광 반점은 NF90-RBM3 상호 작용을 나타냅니다. 화살표는 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용을 보여줍니다. 핵은 DAPI (파란색)으로 대조 하였다. 음성 대조군 1 (NC 1) : 두 일차 항체를 생략 하였다. 음성 대조군 2 (NC 2) : RBM3 단일 차 항체 만. 음성 대조군 3 (NC 3) : NF90 단일 차 항체 만. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55218/55218fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

visualization-protein-protein-interaction-nuclear-cytoplasmic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

12.7K 조회수.  University of Basel. Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.

비디오: Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for skin-care cosmetics. The goals of the protocol are: (1) to process chicken feathers into KH by alkaline-enzymatic hydrolysis and purify it by dialysis, and (2) to test if adding KH into an ointment base (OB) increases hydration of the skin and improves skin barrier function by diminishing transepidermal water loss (TEWL). During alkaline-enzymatic hydrolysis feathers are first incubated at a higher temperature in an alkaline environment and then, under mild conditions, hydrolyzed with proteolytic enzyme. The solution of KH is dialyzed, vacuum dried, and milled to a fine powder. Cosmetic formulations comprising from oil in water emulsion (O/W) containing 2, 4, and 6 weight% of KH (based on the weight of the OB) are prepared. Testing the moisturizing properties of KH is carried out on 10 men and 10 women at time intervals of 1, 2, 3, 4, 24, and 48 h. Tested formulations are spread at degreased volar forearm sites. The skin hydration of stratum corneum (SC) is assessed by measuring capacitance of the skin, which is one of the most world-wide used and simple methods. TEWL is based on measuring the quantity of water transported per a defined area and period of time from the skin. Both methods are fully non-invasive. KH makes for an excellent occlusive; depending on the addition of KH into OB, it brings about a 30% reduction in TEWL after application. KH also functions as a humectant, as it binds water from the lower layers of the epidermis to the SC; at the optimum KH addition in the OB, up to 19% rise in hydration in men and 22% rise in women occurs.

The goal of the protocol is to prepare keratin hydrolysate from chicken feathers by alkaline-enzymatic hydrolysis and to test whether adding keratin hydrolysate into a cosmetics ointment base improves skin barrier function (heightening hydration and diminishing transepidermal water loss). Tests are conducted on men and woman volunteers.

각 질의 닭 깃털 및 화장품에의 응용에서의 준비

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...