전체 게놈 시퀀싱, WGS는 게놈 조사 및 항생제 내성 표현형의 기초가되는 분자 메커니즘의 식별을 통해 항생제 내성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세계 게놈 시퀀싱은 DNA, 박테리아 DNA의 대규모로 탐색을 개선하여 밀접하게 관련된 병원성 변이를 포함하여 한 번의 실행으로 미생물의 심층 특성 분석을 용이하게합니다. 차세대 염기서열분석은 임상 상황에서 병원체의 진단, 치료, 감시 및 공급원 추적을 위한 도구를 고려하여 미생물 및 항균 내성 프로파일의 신속한 식별 및 특성화를 제공합니다.
차세대 염기서열분석 방법론은 임상적 맥락뿐만 아니라 환경 환경, 그리고 식품 안전에서 병원체의 감시 및 공급원 추적에서 결정적인 역할을 할 수 있습니다. 현재 이것은 일상적인 기술이 아닙니다. 실제로, 약간의 절차를 통해 실험을 얼마나 성공적으로 수행했는지 더 쉽게 이해할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 우리 실무 그룹의 유전체학 기술자 인 Julissa Enciso-Ibarra가 될 것입니다. 박테리아 DNA를 추출하고 정량화 한 후 2.5 마이크로 리터의 태그 멘 테이션 버퍼를 첨가하십시오. 0.2 밀리리터 튜브에 2 마이크로리터의 G DNA를 투입하고 피펫팅에 의해 혼합한다.
1마이크로리터의 증폭 버퍼와 피펫을 위아래로 추가하여 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 280G에서 1분 동안 회전시킵니다. 샘플을 섭씨 55도의 열순환기에 5분 동안 넣은 다음 섭씨 10도에서 유지합니다.
1마이크로리터의 중화 버퍼를 샘플 튜브에 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 튜브를 돌리고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 1.7 마이크로리터의 각 인덱스 어댑터와 3마이크로리터의 인덱싱 PCR 마스터 믹스를 추가합니다.
성분을 혼합한 후 실온에서 1분 동안 280G으로 스핀다운합니다. 샘플을 열순환기에 넣고 원고에 설명된 대로 두 번째 PCR 반응을 수행합니다. 이제 와동으로 상업용 자기 비드 용액을 혼합하십시오.
제조업체의 지침에 따라. 태깅된 또는 인덱싱된 GDNA 샘플을 새로운 5 밀리리터 튜브로 옮기고, GDNA 샘플의 최종 부피의 각 마이크로리터에 대해 0.6 마이크로리터의 자성 비드를 첨가한다. 피펫팅으로 성분을 부드럽게 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
상청액이 깨끗해질 때까지 2분 동안 마그네틱 랙에 샘플 튜브를 놓습니다. 구슬을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오. 그런 다음 혼합하지 않고 새로 준비된 80 % 에탄올 200 마이크로 리터를 첨가하십시오.
용출액이 깨끗해질 때까지 30초 동안 배양하고 비드를 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 이 절차를 반복하고 비드를 10분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 15 마이크로리터의 10 밀리몰 트리스 완충액을 피펫팅에 의해 부드럽게 혼합된 비드에 첨가하고 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
시료 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 놓아 상층액이 투명해지도록 합니다. 그런 다음 샘플 튜브에서 새 0.2밀리리터 튜브로 14마이크로리터의 상청액을 조심스럽게 옮기고 정리된 라이브러리를 가져옵니다. 제조업체의 지침에 따라 시약 카트리지를 해동하십시오.
정규화 된 라이브러리의 5 마이크로 리터를 낮은 바인딩 1.5 밀리리터 튜브로 당기고 적절한 부피의 RSB로 4 나노 몰에서 풀링 된 라이브러리를 희석합니다. 그런 다음 풀링된 라이브러리 각각 5마이크로리터와 0.2 일반 수산화나트륨을 새로운 낮은 결합, 1.5밀리리터 튜브에 추가합니다. 풀링된 라이브러리를 단일 가닥으로 변성시키려면 와동하여 튜브를 혼합합니다.
1 분 동안 스핀 다운하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 이제 10마이크로리터의 변성 풀링된 라이브러리 990마이크로리터의 사전 냉각된 혼성화 완충액을 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 시퀀서 로딩을 위한 최종 희석이 수행될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
2 마이크로리터의 제어 라이브러리 및 3 마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 혼합하여 4나노몰 농도의 제어 라이브러리를 붓고 준비한다. 그런 다음 각각 5 마이크로 리터의 제어 라이브러리와 새로 준비된 0.2 일반 수산화 나트륨을 추가합니다. 앞에서 설명한 것처럼 제어 라이브러리를 단일 가닥으로 변성시킵니다.
피펫팅을 통해 10마이크로리터의 변성 제어 라이브러리와 990마이크로리터의 사전 냉각 하이브리드화 버퍼를 부드럽게 혼합하고 시퀀서 로딩을 위한 최종 희석이 완료될 때까지 얼음 위에 놓습니다. 새로운 낮은 바인딩인 1.5밀리리터 튜브에서 594마이크로리터의 변성 풀링 라이브러리와 6마이크로리터의 변성 제어 라이브러리를 결합합니다. 적절하게 혼합하고 사전 냉각된 혼성화 완충액을 사용하여 600마이크로리터의 부피에서 1.2 페코 몰의 최종 로딩 농도로 최종 라이브러리 혼합물을 희석합니다.
최종 라이브러리 혼합물을 시약 카트리지에 로드하기 전에 추가 열 전처리를 수행하여 플로우 셀에 효율적으로 로딩하십시오. 최종 라이브러리 믹스를 섭씨 96도에서 2분 동안 배양합니다. 튜브를 뒤집어 혼합하고 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다.
500마이크로리터의 최종 라이브러리 혼합물을 시약 카트리지의 설계 저장소에 로드합니다. 시퀀서를 개시한 후 시약 카트리지를 로딩하고, 플로우 셀을 시퀀싱 실행을 설정한다. 데이터 분석을 위해 시퀀싱 데이터 서버에 연결하고 FASTQ 파일을 다운로드합니다.
타사 소프트웨어로 원시 시퀀스 데이터의 초기 품질을 평가합니다. 원시 시퀀싱 데이터에서 잔여 어댑터 시퀀스, 저품질 베이스 및 짧은 읽기를 제거합니다. 타사 소프트웨어를 사용하여 품질 검사 시퀀싱 데이터를 연속 또는 스캐폴드 수준으로 어셈블합니다.
조립된 게놈을 포함하는 Phaster 파일을 RAST 서버에 제출하여 게놈 주석을 수행합니다. Phaster 파일을 게놈 역학 센터 및 Claremont 타이핑 웹 플랫폼에 업로드하여 역학적 특징을 식별합니다. ARGS, VAGS 및 플라스미드.
페이스터 파일을 페이스터 서버에 업로드하여 프로파지 서열을 식별합니다. 게놈 주석은 5, 633 개의 암호화 된 특징을 밝혀 냈으며 그 중 5, 524 개는 단백질 코팅 유전자이고 109 개는 RNA 관련 서열이다. 예측된 대장균 균주는 필로 그룹 B 1 및 서열 유형 40에 속합니다.
항생제 내성 결정인자로서, 광범위한 스펙트럼의 다중 약물 유출 펌프를 암호화하는 MF A 유전자가 동정되었다. 열 안정한 장독소에 대해 혈청 저항성 단백질과 그의 분비된 이펙터 단백질과 함께 제3형 분비계를 암호화하는 유전자도 확인되었다. 코딩 서열은 하위 시스템, 특히 탄수화물, 단백질, 아미노산 및 유도체 대사 및 막 수송에서 기능적 역할을하는 기능적으로 관련된 단백질의 모음으로 그룹화됩니다.
좋은 실험실 관행은 모든 프로토콜을 통해 기본입니다. 그러나 단면 DNA 라이브러리 준비 중에 여러 샘플을 처리할 때는 교차 오염을 방지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다.
