La secuenciación del genoma completo, WGS, puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la resistencia a los antimicrobianos a través de la interrogación del genoma y la identificación de los mecanismos moleculares subyacentes al fenotipo de resistencia a los antimicrobianos. La secuenciación del genoma mundial mejora la exploración del ADN, el ADN bacteriano a gran escala, facilitando la caracterización en profundidad de los microbios en una sola ejecución que incluye variantes patogénicas estrechamente relacionadas. La secuenciación de próxima generación proporciona una rápida identificación y caracterización de microorganismos y su perfil resistente a los antimicrobianos considerando una herramienta para el diagnóstico, tratamiento, vigilancia y seguimiento de la fuente de patógenos en el contexto clínico.
Las metodologías de secuenciación de próxima generación pueden desempeñar un papel determinante en la vigilancia y el seguimiento de la fuente de patógenos no solo en el contexto clínico, sino también en los entornos ambientales y, lo que es más importante, en la seguridad alimentaria. Actualmente, esta no es una técnica de rutina. De hecho, un poco del procedimiento hará que sea más fácil entender qué tan exitoso llevan a cabo el experimento.
Demostrando el procedimiento estará Julissa Enciso-Ibarra, técnica genómica de nuestro grupo de trabajo. Después de extraer y cuantificar el ADN bacteriano añadir 2,5 microlitros de tampón de marcado. Dos microlitros de entrada G D N A en un tubo de 0,2 mililitros y mezclar por pipeteo.
Agregue un microlitro de tampón de amplificación y pipete hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Luego gire el tubo a 280 G durante un minuto. Coloque las muestras en un termociclador a 55 grados centígrados durante cinco minutos, seguido de mantener a 10 grados centígrados.
Agregue un microlitro de tampón neutralizante a los tubos de muestra y mezcle suavemente con pipeteo. Gire el tubo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue 1.7 microlitros de cada adaptador de índice y tres microlitros de mezcla maestra de PCR de indexación.
Después de mezclar los componentes, girar a 280 g durante un minuto a temperatura ambiente. Coloque las muestras en el termociclador y realice una segunda reacción de PCR como se describe en el manuscrito. Ahora mezcle la solución comercial de perlas magnéticas mediante vórtice.
Según las directrices del fabricante. Transfiera la muestra G D N A una nueva muestra de cinco mililitros e indizada y agregue 0,6 microlitros de perlas magnéticas por cada microlitro del volumen final de la muestra G D N A. Mezclar los componentes suavemente pipeteando e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Coloque los tubos de muestra en una rejilla magnética durante dos minutos hasta que el sobrenadante se haya aclarado. Deseche el sobrenadante con cuidado sin alterar las cuentas. Luego agregue 200 microlitros de etanol al 80% recién preparado sin mezclar.
Incubar durante 30 segundos hasta que el eluy se aclare y retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las cuentas. Repita este procedimiento y seque al aire las perlas durante 10 minutos. Ahora agregue 15 microlitros de tampón tris milimolar a las perlas mezcladas suavemente por pipeteo e incube durante dos minutos a temperatura ambiente.
Coloque los tubos de muestra en la rejilla magnética durante dos minutos para permitir que el sobrenadante se elimine. Luego, transfiera cuidadosamente 14 microlitros del sobrenadante del tubo de muestra a un nuevo tubo de 0.2 mililitros y obtenga la biblioteca limpia. Descongele el cartucho de reactivo siguiendo las instrucciones del fabricante.
Extraiga cinco microlitros de la biblioteca normalizada en un tubo de 1,5 mililitros de unión baja y diluya la biblioteca agrupada en cuatro nanomolares con el volumen adecuado de RSB. Luego agregue cinco microlitros cada uno de la biblioteca combinada y 0.2 hidróxido de sodio normal en un nuevo tubo de 1.5 mililitros de bajo enlace. Para desnaturalizar la biblioteca agrupada en hebras individuales, mezcle el tubo con vórtice.
Girar durante un minuto e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Ahora agregue 10 microlitros de la biblioteca agrupada desnaturalizada 990 microlitros de tampón de hibridación pre enfriado y mezcle suavemente por pipeteo. Coloque el tubo en hielo hasta que se realice la dilución final para la carga del secuenciador.
Verter y preparar una biblioteca de control a una concentración de cuatro nanomolares mezclando dos microlitros de la biblioteca de control y tres microlitros de agua libre de nucleasa. Luego agregue cinco microlitros cada uno de la biblioteca de control y el hidróxido de sodio normal 0.2 recién preparado. Desnaturalice la biblioteca de controles en hebras individuales como se demostró anteriormente.
Mezcle suavemente 10 microlitros de biblioteca de control desnaturalizada y 990 microlitros de tampón de hibridación preenfriado por pipeteo, y colóquelo en hielo hasta que se realice la dilución final para la carga del secuenciador. En un nuevo tubo de 1,5 mililitros de unión baja, combine 594 microlitros de la biblioteca combinada desnaturalizada y seis microlitros de la biblioteca de control desnaturalizada. Mezclar adecuadamente y diluir la mezcla final de biblioteca a una concentración de carga final de 1,2 peco molar en un volumen de 600 microlitros utilizando el tampón de hibridación preenfriado.
Antes de cargar la mezcla de biblioteca final en el cartucho de reactivo, realice un pretratamiento térmico adicional para lograr una carga eficiente en la celda de flujo. Incubar la mezcla final de la biblioteca durante dos minutos a 96 grados centígrados. Invierta el tubo para mezclar y coloque el tubo en hielo durante cinco minutos.
Cargue 500 microlitros de la mezcla final de la biblioteca en el depósito de diseño del cartucho de reactivo. Después de iniciar el secuenciador, cargue el cartucho de reactivo, la celda de flujo y configure la ejecución de secuenciación. Para el análisis de datos, conéctese al servidor de datos de secuenciación y descargue los archivos FASTQ.
Evalúe la calidad inicial de los datos de secuencia sin procesar con software de terceros. Elimine las secuencias de adaptadores remanentes, las bases de baja calidad y las lecturas cortas de los datos de secuenciación sin procesar. Reúna los datos de secuenciación de control de calidad en nivel de contig o andamio utilizando software de terceros.
Realice la anotación del genoma enviando el archivo Phaster que contiene el genoma ensamblado al servidor RAST. Cargue el archivo Phaster en las plataformas web de tipificación del Centro de Epidemiología del Genoma y Claremont para identificar las características epidemiológicas. ARGS, VAGS y plásmidos.
Cargue el archivo Phaster en el servidor Phaster para identificar secuencias de profagos. La anotación del genoma reveló 5.633 características codificadas, de las cuales 5.524 son genes de recubrimiento de proteínas y 109 son secuencias relacionadas con el ARN. La cepa de Escherichia coli predicha pertenece al filo grupo B uno y secuencia tipo 40.
Se identificó un determinante de la resistencia a los antimicrobianos, el gen M D F A que codifica una bomba de eflujo de múltiples fármacos de amplio espectro. También se identificaron genes que codifican para una enterotoxina termoestable, una proteína de resistencia sérica y el sistema de secreción tipo tres junto con sus proteínas efectoras secretadas. Las secuencias codificantes se agrupan en colecciones de proteínas funcionalmente relacionadas llamadas subsistemas, especialmente aquellas que desempeñan funciones funcionales en carbohidratos, proteínas, aminoácidos y metabolismos derivados y transporte de membranas.
Las buenas prácticas de laboratorio son fundamentales a través de todo el protocolo. Sin embargo, se debe tener especial cuidado al procesar múltiples muestras durante la preparación de la biblioteca de ADN seccional para evitar la contaminación cruzada.
