全基因组测序（WGS）可以通过基因组询问和鉴定抗菌素耐药性表型背后的分子机制来帮助回答抗菌素耐药性领域的关键问题。世界基因组测序改善了对DNA，细菌DNA的大规模探索，有助于在单次运行中对微生物进行深入表征，包括密切相关的致病变异。下一代测序提供了微生物及其抗微生物药物耐药性的快速鉴定和表征，考虑了临床环境中病原体诊断、治疗、监测和来源跟踪的工具。
下一代测序方法不仅可以在临床环境中，而且在环境环境中，在食品安全方面，在病原体的监测和来源追踪中发挥决定性作用。目前，这不是常规技术。事实上，一些程序都会让你更容易理解他们进行实验的成功程度。
演示该程序的是我们工作组的基因组学技术员Julissa Enciso-Ibarra。提取和定量细菌DNA后，加入2.5微升标记缓冲液。在0.2毫升管中输入两微升G D N A，并通过移液混合。
加入一微升扩增缓冲液，上下移液混合。然后以 280 G 的速度旋转试管一分钟。将样品放入55摄氏度的热循环仪中5分钟，然后保持在10摄氏度。
向样品管中加入一微升中和缓冲液，并通过移液轻轻混合。旋转试管并在室温下孵育五分钟。接下来，加入 1.7 微升每个索引适配器和 3 微升索引 PCR 预混液。
混合组分后，在室温下以 280 G 旋转一分钟。将样品放入热循环仪中，并按照手稿中的说明进行第二次PCR反应。现在通过涡旋混合商用磁珠溶液。
根据制造商的指南。将标记或索引的G D N A样品转移到新的一个5毫升管中，并为G D N A样品的最终体积的每微升添加0.6微升磁珠。通过移液轻轻混合组分，并在室温下孵育五分钟。
将样品管放在磁性架上两分钟，直到上清液清除。小心地丢弃上清液，不要干扰珠子。然后加入200微升新鲜制备的80%乙醇，不混合。
孵育30秒，直到洗脱液清除，然后小心地除去上清液，不要干扰珠子。重复此过程并将珠子风干 10 分钟。现在将 15 微升 10 毫摩尔 tris 缓冲液加入到通过移液轻轻混合的珠子中，并在室温下孵育两分钟。
将样品管放在磁性架上两分钟，使上清液清除。然后，小心地将14微升上清液从样品管转移到新的0.2毫升管中，并获得清理后的文库。按照制造商的说明解冻试剂盒。
将 5 微升标准化文库拉入低结合的 1.5 毫升管中，并用适当体积的 RSB 以 4 纳摩尔稀释混合文库。然后在新的低结合1.5毫升管中加入每个5微升的合并库和0.2个普通氢氧化钠。要将汇集的文库变性为单股，请通过涡旋混合管。
旋转一分钟，在室温下孵育五分钟。现在加入10微升变性混合文库990微升预冷杂交缓冲液，并通过移液轻轻混合。将试管放在冰上，直到执行测序仪加载的最终稀释。
通过混合两微升对照文库和三微升无核酸酶的水，倒入并制备浓度为四纳摩尔的对照文库。然后加入对照库各5微升和新鲜制备的0.2普通氢氧化钠。如前所述，将控制库变性为单链。
通过移液轻轻混合 10 μL 变性对照库和 990 μL 预冷杂交缓冲液，并将其放在冰上，直到完成测序仪加载的最终稀释液。在一个新的低结合，1.5毫升管中，混合594微升变性混合库和6微升变性对照库。使用预冷的杂交缓冲液将最终文库混合物适当混合并稀释至最终上样浓度为 1.2 peco 摩尔，体积为 600 微升。
在将最终文库混合物加载到试剂盒之前，请进行额外的热预处理，以实现高效上样到流通池中。将最终文库混合物在 96 摄氏度下孵育两分钟。倒置试管以混合并将试管放在冰上五分钟。
将 500 微升最终文库混合物装入试剂盒上的设计储液槽中。启动测序仪后加载试剂盒、流通池并设置测序运行。对于数据分析，请连接到测序数据服务器并下载 FASTQ 文件。
使用第三方软件评估原始序列数据的初始质量。从原始测序数据中删除残留的适配器序列、低质量碱基和短读段。使用第三方软件将质量检查测序数据组装到重叠群或支架级别。
通过将包含组装基因组的 Phaster 文件提交到 RAST 服务器来执行基因组注释。将Phaster文件上传到基因组流行病学中心和克莱蒙特分型网络平台，以确定流行病学特征。ARGS、VAGS和质粒。
将 Phaster 文件上传到 Phaster 服务器以识别噬菌体序列。基因组注释显示5， 633个编码特征，其中5， 524个是蛋白质包被基因，109个是RNA相关序列。预测的大肠杆菌菌株属于 filo 组 B 一和序列类型 40。
鉴定出一种抗菌素耐药决定因素，即编码广谱多药外排泵的M D F A 基因。还鉴定了编码热稳定肠毒素A血清抗性蛋白和三型分泌系统及其分泌效应蛋白的基因。编码序列被分组到功能相关的蛋白质集合中，称为子系统，特别是在碳水化合物，蛋白质，氨基酸和衍生物代谢和膜转运中起功能作用的蛋白质。
良好的实验室规范是所有协议的基础。但是，在切片DNA文库制备过程中处理多个样品时必须特别小心，以避免交叉污染。
