TCID50 에세이를 사용하여 바이러스 성 적정에 대한 시각적 세포 병증 효과 기반 읽기를 개선하기 위해 크리스탈 바이올렛의 사용

이 프로토콜의 목표는 바이러스 재고 적정을 생성하고 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 시각화하는 것입니다. 이를 위해, 일반적인 바이러스 성 적정은 염색 다음에 입증될 것입니다. 이 적정은 생물 안전 수준 2 실험실 내의 생물 안전 캐비닛에서 7 일 동안 96 웰 플레이트에서 수행됩니다.

이를 위해, 선호하는 세포주 96웰 플레이트는 해당 매체를 이용하여 시드되고 컨할 때까지 성장하게 한다. 바이러스 재고는 900 마이크로리터의 미디어와 100 마이크로리터의 바이러스 또는 상응하는 희석을 혼합하여 10배 희석제를 사용하여 희석될 것이다. 각 튜브를 소용돌이어 미디어와 바이러스의 적절한 혼합을 보장하고 희석제에 대한 오류를 피하십시오.

감염 과정에서 플레이트의 레이아웃과 각 희석을 리드에 적어 둡니다. 감염하기 전에 PBS 의 200 마이크로 리터를 사용하여 세척하십시오. 해당 우물에 50 마이크로리터의 접종을 추가합니다.

그런 다음 7 일 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 7일 간의 인큐베이션 후 PBS 200마이크로리터를 사용하여 세척하십시오. PBS에서 PFA 웰당 50 마이크로리터를 PBS에서 4%로 추가하고 실온에서 15분 동안 배양하여 세포를 수정합니다.

인큐베이션 후, 200 마이크로리터의 PBS를 사용하여 다시 두 번 세척한 후, 물에 크리스탈 바이올렛의 웰 당 50 마이크로리터를 첨가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 마지막으로, 우물에서 크리스탈 바이올렛을 흡기하고 선택적으로 플레이트를 실온에서 2~5분 동안 건조하게 하거나 200마이크로리터의 물로 세척하여 시각화 전에 과도한 얼룩을 제거합니다. 그 결과, 다시 염색한 후에, 부정적인 세포는 얼룩질 것입니다.

긍정적 인 우물은 지워질 것입니다. 이 정보는 최종 바이러스 성 titer를 계산하기 위해 두 설명 된 수식 중 하나에서 사용됩니다. 각 방법을 사용하여 얻은 티터를 비교했을 때, 단사이토 화학 염색시 어떤 경우에는 크리스탈 바이올렛과 비교하여 추가 양성 우물을 검출할 수 있으며, 마찬가지로 두 염색 방법 모두 현미경 검사를 통해 시각적 평가보다 더 긍정적인 우물을 검출할 수 있음을 보여주었습니다.