TCID50アッセイを用いたウイルス滴定のための視覚細胞パシー効果ベースの読取を改善するための結晶バイオレットの使用

このプロトコルの目的は、ウイルスストック滴定を生成し、結晶バイオレット染色を使用して視覚化することです。これを行うために、一般的なウイルス滴定が示され、その後染色が行われます。この滴定は、バイオセーフティレベル2の実験室内のバイオセーフティキャビネットで7日間の96ウェルプレートで行われます。

これを行うには、好ましい細胞株の96ウェルプレートは、対応する培地を使用して播種され、コンフルエントまで成長させます。ウイルスストックは、900マイクロリットルの培地と100マイクロリットルのウイルス、または対応する希釈を混合することによって、10倍希釈を使用して希釈される。各チューブを渦に入れ、メディアとウイルスの適切な混合を確保し、希釈のエラーを避けてください。

感染プロセス中に助けるためにリードだけでなく、各希釈にあなたのプレートのレイアウトを書きます。感染前に、200マイクロリットルのPBSを使用して洗浄してください。対応する井戸に接種物の50マイクロリットルを追加します。

その後、5%CO2インキュベーターで摂氏37度で7日間インキュベートします。7日間のインキュベーションの後、200マイクロリットルのPBSを使用して洗浄する。PBSで4%でPFAのウェルあたり50マイクロリットルを加えて細胞を固定し、室温で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、水に水の結晶バイオレットのウェルあたり50マイクロリットルを添加する前にPBSの200マイクロリットルで再び細胞を洗浄し、室温で5分間インキュベートします。最後に、井戸からクリスタルバイオレットを吸引し、必要に応じて、プレートを室温で2〜5分間空気乾燥させたままにするか、200マイクロリットルの水で洗浄して視覚化前に過度の汚れを取り除きます。その結果、再染色後、陰性細胞が染色される。

ポジティブな井戸はクリアされます。この情報は、最終的なウイルス性の高さを計算するために、2つの式のいずれかで使用されます。各方法で得られた力価を比較した場合、単球化学染色では、結晶バイオレットと比較して追加の陽性ウェルを検出できる場合があり、同様に、両方の染色法が顕微鏡による視覚的評価よりも陽性の井戸を検出できることを示した。