우리의 지식에, 이것은 동시에 분석당 두 개의 결과를 측정하기 위해 두 개의 기자 신호를 사용하는 구슬 기반 멀티플렉스 프로토콜의 첫 번째 예입니다. 이 기술을 통해 사용자는 항원별 IgM 및 IgG를 동시에 측정할 수 있으며, 샘플이 적고 결과에 대한 시간이 짧습니다. 이 이중 리포터 방법은 항체 이소타이핑에 특이적이지만, 번역 후 변형 또는 자유 약물 형태와 같은 다른 문별 쌍을 측정하도록 조정할 수 있다.
오늘 우리의 절차를 시연우리는 박사 스티브 안젤로니, 루미넥스 공사의 수석 필드 응용 과학자가있다. 이중 기자 IgG와 IgM serological assay를 시작하려면 개별 커플 비드에서 필요한 멀티플렉스 비드 믹스를 준비하고 밀리리터 당 6 개의 구슬에 1 회 10 의 농도로 비드 주식을 제어하십시오. 다음으로, PBS-TBN 버퍼의 990 마이크로리터에 혈청 10 마이크로리터를 추가하여 혈청 샘플을 100배 희석한 다음, PBS-TBN의 180 마이크로리터에 1:100 희석제 20마이크로리터를 추가하여 샘플을 10배 더 희석시 희석시 10배 더 희석시 희석시.
비드 믹스 와 혈청 샘플이 준비되면 멀티플렉스 비드 믹스 50 마이크로리터를 96웰의 비결합 마이크로티터 플레이트의 할당된 웰에 추가한 다음 희석된 혈청 샘플 50마이크로리터를 적절한 우물에 추가합니다. 모든 샘플이 추가되면, 마이크로 플레이트 호일 씰로 접시를 덮고 15 분 동안 섭씨 37도에서 가열 플레이트 셰이커에 인큐베이션하십시오. 그런 다음, 플레이트를 자기 판 분리기위에 2분 동안 배치하여 반응 혼합물에서 구슬을 분리한다.
자석에 접시를 유지, 호일 씰을 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전하고 부드럽게 우물에서 상류를 쓸어. 여전히 자석에 접시를 들고있는 동안, 흡수 성 용지에 접시를 얼룩.
반응 우물을 씻으려면 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 PBS-TBN 150 마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 가열 된 셰이커에 2 분 동안 배양한 후 다시 플레이트 자석에 2 분 동안 다시 놓습니다. 접시를 자석에 두면서 접시를 뒤집어 서퍼넌트를 버리고 흡수성 용지에 접시를 부수십시오.
두 번째 PBS-TBN 세척 후 자석에서 플레이트를 제거하고 100 마이크로리터의 신선한 검출 시약 믹스를 각 웰에 추가합니다. 마이크로 플레이트 호일 씰로 플레이트를 덮은 후 15분 동안 가열된 플레이트 셰이커에 놓고 2분간 마그네틱 플레이트 분리기위에 놓습니다. 플레이트가 자석에 있는 동안, 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 흡수성 용지에 블롯하여 검출 시약 믹스를 폐기하십시오.
이전에 시연된 것보다 두 번 PBS-TBN으로 반응 우물을 씻은 다음 자석에서 플레이트를 제거합니다. 각 우물에 PBS-TBN 100 마이크로리터를 추가한 다음 호일 씰로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 2분간 흔들어 줍니다. 호일 씰을 제거하고 유량 분석기에서 각 우물에서 샘플의 50 마이크로리터를 읽는 진행합니다.
플레이트를 읽으려면 왼쪽 위 모서리에 있는 드롭다운 메뉴를 선택하고 플레이트 구성으로 이동하여 이전에 구성된 플레이트를 로드하고 실행 플레이트를 선택합니다. 배출 아이콘을 선택하여 플레이트 캐리어를 배출한 다음 플레이트 캐리어에 플레이트를 로드한 다음 리트랙트 아이콘을 선택하여 플레이트 캐리어를 회수합니다. 플레이트 캐리어가 분석기로 장기화되면 실행 아이콘을 선택하여 플레이트 읽기를 시작합니다.
듀얼 리포터 중화 분석의 경우 멀티플렉스 비드 믹스 50마이크로리터를 96웰의 비구속미 마이크로티터 플레이트에 추가한 다음, 각 웰에 밀리리터 ACE2당 2마이크로그램의 마이크로리터 25마이크로리터를 추가하고 호일 씰로 플레이트를 덮었다. 가열 된 플레이트 셰이커에 2 분 인큐베이션 후 할당 된 우물에 1:500 혈청 희석제 25 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 샘플이 추가되면, 이전에 서학적 분석에 대해 설명한 대로 인큐베이션, 세척, 검출 및 분석 단계를 수행합니다.
증상 발병으로부터 5~60일 이내에 혈청 샘플을 이용한 DyLight 405 리포터 염료에 공주된 항-IgM의 시험은 스파이크 항원에게 높은 신호를 생성하지 않았다. IgM 배지 형광 강도가 높은 샘플의 경우, 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 항원에서 가장 높은 신호가 보였다. IgM 티터는 일부 샘플에서 상승되어야하지만 관찰 된 중간 형광 강도 수준은 140 MFI 단위를 초과하지 않았습니다.
더욱이, IgM에 대한 대조구는 동일한 농도에서 피컬리스린라벨이 부착된 안티IgM에 비해 다이라이트 405를 안티-IgM으로 공주할 때 중간 형광 강도에 대한 상당한 동적 범위가 부족했다. IgG 검출을 위해, 화려한 보라색 공주체는 형광 슈퍼 브라이트 436의 스트렙타비딘 컨쥬게이트보다 더 높은 중앙형광 강도 신호를 가졌다. 그러나, 화려한 바이올렛 컨쥬게이트에 대한 신호 강도는 ACE2 적정에 걸쳐 다양했다.
ACE2 농도를 가로 지르는 화려한 보라색 컨쥬게이트에 의한 이 신호 변동은 또한 IgG 티터의 범위에 걸쳐 ACE2에 의한 백분율 억제를 결정하는 것을 방해했습니다. IgM 검출의 경우, 물리에리트린 안티-IgM은 DyLight 549 항인간 IgM에 의해 생성된 신호보다 더 높은 신호를 표시했다. IGM 결합의 ACE2 % 억제를 결정하는 동안, 두 IgM 검출 시약 사이에 약간의 그러나 사소한 차이가 있었다.
따라서 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나는 개별 비드 주식에서 멀티플렉스 비드 믹스를 준비하고 올바르게 수행해야합니다. 그래서 이 절차는 또한 백신의 효험을 측정하고 그밖 병원체에 면역 반응을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다.
