프로토콜 생성 과정에서 그녀의 아이디어와 토론에 대한 줄리아 파인 박사와 편집 전반에 걸쳐 도움이되는 의견을 주신 Cassondra Vernier 박사에게 감사드립니다. 이 자료들은 보조금 ID 549025에 따라 식량 농업 연구 재단이 부분적으로 지원하는 프로젝트에 기여했습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서는 유충 수집 및 바이러스 전파, 추출 및 농축뿐만 아니라 케이지 먹이 실험의 형태로 바이러스 처리를 포함하여 바이러스 증폭 및 접종 재고 준비 과정의 모든 단계를 자세히 설명하는 방법을 설명했습니다. 이러한 방법은 반순수 바이러스 입자의 생산을 허용하며(그림 4), 그 효과는 성인에게 치명적인 바이러스에 대한 용량-반응 사망률 테스트에 의해 일관되게 정량화될 수 있다(도 5). 감염 능력 및/또는 병리학의 확인 후, 생성된 입자는 꿀벌과 꿀벌 바이러스 사이의 상호작용을 밝히기 위해 생물 검정에 사용될 수 있다.
기술된 프로토콜의 가장 독특한 이점 중 하나는 번데기 수확, 입자 생성 또는 생물학적 검정 수행 여부에 관계없이 각각이 대량으로 쉽게 스케일링된다는 것입니다. 번데기 절제 방법33을 사용하면 시간당 ~ 100 마리의 번데기를 제거 할 것으로 예상 할 수 있지만이 숫자는 숙련도에 따라 확장됩니다. 그러나 여기에 보고된 애벌레 자가 제거 방법은 다양한 계획 및 스케줄링 절차가 필요하지만 밤새 제거된 꿀벌 수의 10-20배를 쉽게 생성할 수 있으며, 비교적 적은 수작업 노력과 꿀벌에 대한 기계적 부담이 적다.
이 방법의 주요 한계는 자체 제거 된 유충이 이전에 Varroa에 감염되지 않았 음을 보장 할 수있는 방법이 없다는 것입니다. 정기적 인 진드기 치료 및 근원 두드러기의 모니터링은이 위험을 최소화 할 수 있지만 일부 유충은 여전히 어느 정도의 Varroa 기생을 가졌을 수 있습니다. 그러나 번데기를 개별적으로 수동으로 제거하면 사용자는 주어진 번데기의 세포에 진드기가 있는지 관찰 할 수 있습니다. 또한, 자체 제거 과정은 애벌레의 음식 추구 행동에 의존하기 때문에,이 애벌레를 포함하는 프레임은 정상적으로 발생하는 최종 먹이 전에 제거되어야합니다. 노동자들에 의한 이러한 공급 부족으로 인해 애벌레는 세포에서 기어 나옵니다. 따라서이 방법으로 파생 된 번데기는 식민지 내부에서 완전히 발달 한 유충에 비해 영양 스트레스의 매우 짧은 창을 경험하며 약간 작게 나타날 수 있습니다. 이것은 프레임에 존재하는 코호트에서 가장 어린 애벌레에서 특히 주목할 만하다. 여왕이 24 시간 창문 위에 알을 낳았 기 때문에이 애벌레들은 비례하여 더 많은 먹이 시간을 놓치고 있습니다. 이들은 일반적으로 수동 절제에 의해 제거 된 것과 비교하여 매우 작은 크기로 번식하는 동안 분명히 주목할 만합니다. 그러나, 자기 제거에 의해 생성 된 유충의 양은 감소 된 개별 바이오 매스를 보상하는 것 이상입니다. 또한, 수동 절제 방법은 번데기가 세포에서 뽑힐 때 상당한 기계적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 두 방법 중 하나를 바이러스 입자를 생성하는 것뿐만 아니라 실험의 일부로 사용해야하는 경우 적절한 제어를 보장하기 위해주의를 기울여야합니다.
추출 방법에 관계없이, 바이러스 전파 프로토콜은 번데기를 사용하여 다량의 바이러스 입자를 생성 할 수 있으며, 이는 꿀벌 바이러스 반응을 테스트 할 때 현재 시행되는 다른 바이러스 접종 방법35,36,37에 의해 유도 된 변동성을 최소화합니다. 이 프로토콜은 피코나비랄레스(Picornavirales) 순으로 외피되지 않은 바이러스(예를 들어, 이스라엘 급성 마비 바이러스, 변형된 날개 바이러스)를 사용하여 최적화되고 테스트되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 바이러스 입자를 분리하기 위한 상이한 전략은 외피된 바이러스(44)로 작업할 때 뒤따라야 한다. 대략적인 근사치로서, 바이러스 수확 노력에 관여한 16개의 샘플(도 4의 4개의 콜로니를 포함함)을 각각 200-300개의 주입된 번데기로부터 생성하고, 2-2.5 mL의 농축된 바이러스 입자 제제를 수득하였다. 바이러스 접종 농도가 0.1%이고 표준 35-bee 케이지가 있다고 가정하면, 16개의 바이러스 제제 각각은 3,300-4,200개의 케이지에 충분한 입자를 제공할 것이다. 감염성 물질의 이러한 잉여는 실험 제한을 줄이고 높은 처리량의 생물 분석을 가능하게합니다. 바이러스 입자 농축액이 -80°C에서 저장될 때 수개월 또는 수년 동안 생존 가능한 상태로 유지될 수 있지만, 몇 번의 동결-해동 사이클을 거치더라도 감염성이 서서히 감소할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 따라서 바이러스 제제 스톡을 작은 분취량으로 저장하는 것이 좋으며, 그 중 몇 가지는 바이러스 역가를 정량화하고 실험 당시 치료 용량을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 도 5에서 입증된 연중 변동성은 주기적인 용량-반응 테스트의 필요성을 더욱 강화시켜 바이러스 생존력에서 예기치 않은 손실의 가능성을 최소화한다.
케이지 생물검정 자체는 또한 케이지 생물분석 환경의 인위적인 성질인 것인, 또는 고려하는데 필요한 한계 또는 적어도 주의사항을 갖는다(도 3). 꿀벌을 인클로저로 그룹화하면 개별 수준을 넘어서는 바이러스 검사가 가능합니다. 새장은 꿀벌 자체가 아닌 실험 단위가됩니다. 이것은 단일 꿀벌이 고립되어 치료되는 것보다 실제 식민지와 더 유사하지만 여전히 현실적인 벌집 환경과는 거리가 멀다. 여왕과 새끼 페로몬, 다른 나이의 꿀벌 및 기타 단서를 포함한 사회 환경에서 제거된이 꿀벌은 전체 크기의 식민지가 될 수있는 것처럼 반응하지 않을 수 있습니다. 그러나 이들은 케이지 시스템을 사용하는 대규모 실험에 대한 주로 고려 사항입니다. 케이지 바이러스 생물 분석으로부터 수집 된 결과는 주로 사용자가 원하는보다 현장 현실적인 설정으로 확장 된 미래의 바이러스 테스트 결정을 알리는 데 사용할 수있는 기준 정보 확립으로 취급되어야합니다.
여기에 기재된 방법은 꿀벌 바이러스 검정에 사용하기 위한 바이러스 입자의 대량 생산을 위한 표준화된 공정을 제공한다. 이러한 분석은 다중 바이러스 감염을 포함한 꿀벌 - 바이러스 상호 작용의 다양한 측면과 바이러스 감염에 직면하여식이 품질 및 영양 보충제가 생존에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 이미 구현되었습니다 11,18,45,46. 그들은 콜로니 전체 감염 실험11,47에 사용하고 행동 47 및 유전자 발현 48에 대한 감염의 영향을 연구하기 위해 확장되었습니다. 전반적으로, 이러한 방법은 꿀벌 바이러스 접종물을 생산하고 평가하는 데 사용할 수있는 도구의 기준선을 제공합니다.

꿀벌 (Apis mellifera)은 현대 세계 농업 환경에서 중요한 역할을하지만 현재 살충제 노출, 가난한 사료, 기생충 및 병원균 1,2를 포함한 생물 학적 스트레스 요인과 비생물 적 스트레스 요인의 조합으로 고통 받고 있습니다. 우려되는 가장 중요한 병원균 중 하나는 바이러스이며, 그 중 많은 바이러스는 또 다른 주요 꿀벌 스트레스 요인 인 기생 Varroa 진드기 (Varroa 소멸자)에 의해 벡터화됩니다. 이 바이러스는 꿀벌에 일련의 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 감소 된 새끼 생존, 발달 결함 및 마비를 포함하여 과동기 3,4,5 전후에 총 벌집 붕괴로 이어질 수 있습니다. 바이러스 감염 6,7,8,9 퇴치에 사용되는 기술 개발에는 유망한 발전이 있었지만, 꿀벌이나 식민지 내에서 많은 바이러스가 전파, 확산 및 상호 작용하는 역학은 여전히 잘 이해되지 않습니다 5,10 . 꿀벌과 바이러스 상호 작용의 기본 생물학과 다른 환경 요인과의 관계를 이해하는 것은 효과적인 바이러스 관리 기술을 개발하는 데 중요합니다.
그러나 꿀벌 - 바이러스 상호 작용을 연구하는 것은 과정을 복잡하게 만드는 수많은 알려진 요인과 알려지지 않은 요인으로 인해 어려움을 겪습니다. 여기에는 식이요법 11,12, 살충제 노출(13), 꿀벌 유전적 배경(14,15)과의 상호작용이 포함된다. 바이러스 감염에만 초점을 맞출 때조차도, 꿀벌 개체군은 관리되고 야생이기 때문에 합병증이 흔합니다.하지만 종종 급성 증상을 나타내지 않고 바이러스 16,17 및바이러스 공동 감염의 효과는 잘 이해되지 않습니다 18. 이로 인해 꿀벌 바이러스 효과에 대한 연구가 풀리기 어려워졌습니다.
많은 꿀벌 바이러스 연구는 상황 바이러스 감염을 사용하여 다른 스트레스 요인과의 상호 작용을 찾아 배경 감염이 다른 치료법12,19,20,21과 어떻게 변하는지 관찰했습니다. 이 접근법은 중요한 효과, 특히 살충제 또는식이 요법이 바이러스 수준과 복제에 어떻게 영향을 미치는지 발견하는 데 성공했지만 알려진 함량과 농도의 바이러스 처리 접종은 바이러스 감염 역학의 실험적 테스트에 중요합니다. 그럼에도 불구하고 실험적 치료를 배경 감염과 분리하는 것도 어려움을 초래할 수 있습니다. 현장 연구에서 연구자들은 꿀벌에서 꿀벌22로 바이러스가 전염되는 증거를 제공하기 위해 변형 된 날개 바이러스 (DWV)의 균주를 차별화했지만이 접근법을 사용하는 것은 꿀벌만으로는 어려울 것입니다. 바이러스 감염성 클론은 감염 23,24,25을 추적하는 것뿐만 아니라 꿀벌 바이러스의 역 유전학 연구 및 바이러스 - 숙주 상호 작용 연구 26,27,28을위한 강력한 도구입니다. 그러나 대부분의 경우, 감염성 클론은 입자를 생산하기 위해 세포 내부의 감염주기를 충족시켜야합니다. 이러한 입자는 그들의 감염성이 네이키드 바이러스 RNA보다 높고 캡슐화된 게놈을 사용한 접종이 자연 감염을 모방하기 때문에 실험적 치료를 위한 접종물로서 바람직하다.
오염되지 않은 순수 꿀벌 바이러스 접종물 (야생형 바이러스 균주 또는 감염성 클론에서 유래 한 균주)의 생산은 또한 도전을 제기합니다. 이들은 주로 순수 균주 바이러스29,30을 생산하기 위해 신뢰할 수 있고, 지속적으로 복제되는, 바이러스가 없는 꿀벌 세포주를 수득하는데 어려움 때문이다. 일부 세포주가 생산되었지만, 이러한 시스템은 불완전한 상태로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 생존 가능한 세포주가29 개 생산되어 바이러스 생산 및 조사를보다 세밀하게 제어 할 수 있기를 희망합니다. 이러한 라인이 널리 이용가능해질 때까지, 대부분의 바이러스 생산 프로토콜은 생체내 바이러스 생산 및 정제(18,31,32,33,34)의 사용에 계속 의존할 것이다. 이러한 접근법에는 관심있는 바이러스 입자를 확인하고 정화 (또는 전염성 클론을 생산)하고이를 사용하여 꿀벌, 보통 번데기와 같은 꿀벌을 감염시키는 것이 포함됩니다. 번데기는 표적 바이러스와 함께 주입 된 다음 희생되고 더 많은 입자가 추출되고 정제됩니다. 그러나 처음에는 바이러스가없는 꿀벌이 없기 때문에 그러한 농축액에서 다른 바이러스의 흔적으로 인해 어느 정도 오염이 항상 발생하므로 배경 감염 가능성이 낮은 꿀벌을 선택할 때 세심한주의를 기울여야합니다. 또한, 이들 프로토콜(33)에 사용하기 위해 빗 세포로부터 번데기를 제거하는 방법은 매우 노동 집약적이며 꿀벌에서 스트레스를 유도할 수 있으며, 이러한 수단(18,32)에 의해 생산을 제한한다. 여기에서, 우리는 꿀벌에 대한 노동이 거의없고 기계적 스트레스가 적고 애벌레를 대규모로 제거 할 수있는 대체 방법을보고합니다.
번데기를 얻고 시작 바이러스 접종물과 함께 주입하면 바이러스가 복제 할 시간을 제공하기 위해 배양되어야합니다. 이어서, 생산된 바이러스 입자는 실험용 꿀벌을 감염시키는 데 사용할 수 있는 형태로 가공될 수 있다. 이를 달성하기 위한 몇 가지 간단한 방법들이 있는데, 여기에는 바이러스적으로 감염된 꿀벌로부터 생성된 조질 균질액(35,36) 또는 용혈림프(37)를 감염원으로서 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 효과적이지만 배경 기질로부터 알려지지 않은 변수 (예 : 죽은 벌 균질물의 다른 요인)를 도입 할 가능성이 더 큽니다. 또한, 실험이 단기간에 바이러스의 크고 알려진 복용량을 제공해야하는 경우 입자를 집중시키는 것이 바람직합니다. 따라서, 보다 나은 제어를 위해, 바이러스 입자의 어느 정도의 정제 및 농축을 허용하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 일련의 침전 및 원심분리 단계는 거의 모든 가능한 비표적 바이러스 물질(33)의 제거를 초래할 것이다.
이 농축 접종물을 생산 한 후, 바이러스 역가 (qPCR)를 정량화하고 생체 내 생물 분석법으로 특성화하여 생존력과 사망률을 유발하는 능력을 테스트 할뿐만 아니라 감염 후 증가 된 바이러스 역가가 얻어진다는 것을 확증하는 것이 유익합니다. 이것은 주사 실험 (번데기 또는 성인으로) 또는 먹이 실험 (애벌레 또는 성인에게)을 통해 달성 될 수 있습니다. 이러한 모든 접근법이 가능하지만 새장에있는 성인 꿀벌 그룹에 먹이를주는 것이 종종 가장 빠르고 간단합니다. 케이지 분석 방법은 또한 살충제 독성38, 난소 발달39 및 행동40,41에 대한 영양 영향을 포함하여 꿀벌에 대한 다양한 다른 치료법을 테스트하는 데 널리 사용되므로 바이러스 감염과 다른 요인(42)을 연결하는 실험을위한 좋은 기초를 형성 할 수 있습니다.
여기서는 꿀벌에 대한 노동 및 기계적 스트레스를 줄이는 번데기를 제거하는 방법과 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기위한 반복성이 높고 처리량이 높은 생물 분석을 포함하여 값 비싼 초원심분리기를 사용하지 않고 대량의 반 순수하고 고농축 바이러스 입자를 생산하는 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 바이러스 접종의 순도를 엄격하게 조절함으로써 조사관은 다른 바이러스 접종 방법에 비해 꿀벌 바이러스 반응의 변화를 줄일 수 있습니다. 또한, 생물 분석은 현장 현실적인 설정으로 확장하기 전에 매우 반복 가능한 실험 단위를 사용하여 소그룹 수준에서 바이러스 효과를 스크리닝 할 수 있으며, 이는 관리하기에 훨씬 더 노동 집약적입니다. 이 두 가지 방법이 결합되어 꿀벌 - 바이러스 생리 학적 상호 작용에 대한 전반적인 이해를 향상시키는 데 도움이되는 연구에 필요한 도구를 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

꿀벌은 전 세계적으로 생태 학적 및 농업적으로 매우 중요하지만 바이러스 성 병원균에 노출되는 것을 포함하여 꿀벌 건강에 부정적인 영향을 미치는 다양한 압력을받습니다. 이러한 바이러스는 매우 다양한 파괴적인 효과를 일으킬 수 있으며 실험 치료의 효과를 기존의 배경 감염과 분리하는 것을 어렵게 만드는 여러 요인으로 인해 연구하기가 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기 위해 높은 처리량의 생물 분석과 함께 다량의 바이러스 입자를 대량 생산하는 방법을 제시합니다. 현재 바이러스가없는 지속적인 꿀벌 세포주의 부족으로 인해 바이러스 입자는 최소한의 스트레스 방법론을 사용하여 벌집에서 대량으로 추출되는 꿀벌 번데기를 사용하여 생체 내에서 증폭됩니다. 이 바이러스 입자는 꿀벌 케이지 생물 검정에 사용되어 접종 생존력뿐만 아니라 영양, 살충제 및 기타 병원체와의 상호 작용을 포함한 다양한 다른 바이러스 감염 역학을 테스트 할 수 있습니다. 이러한 입자를 사용하는 가장 큰 장점은 감염된 꿀벌 용혈림프 또는 균질화에 의한 감염과 같은 현재의 대안과 비교할 때 후속 실험에서 알려지지 않은 변수를 도입 할 가능성을 크게 줄여 주지만 꿀벌을 소싱 할 때는주의를 기울여야하지만 배경 바이러스 오염을 최소화해야한다는 것입니다. 케이지 분석은 콜로니 수준에서 바이러스 감염 효과를 테스트하는 대규모 현장 현실적인 실험을 대체하는 것이 아니라 반순수 바이러스 입자와 결합하여 꿀벌과 바이러스 생리 적 상호 작용의 다양한 차원을 검사하는 중요한 도구 역할을 할 수있는 기준선 바이러스 반응을 확립하는 방법으로 기능합니다.

번데기 주사 및 바이러스 추출을위한 프로토콜 (그림 1)을 성공적으로 따르면 다량의 바이러스 입자가 생성되어야합니다. 그러나 여러 시점에서 다양한 콜로니에서 공급되는 번데기를 샘플링하고 주입하면 오염이 적은 표적 바이러스를 획득 할 가능성이 극대화됩니다. 꿀벌 내에서 바이러스가 복제되고 서로 상호 작용하는 역학은 잘 이해되지 않았습니다. 기존 감염의 가능성과 함께, 번데기가 동일한 원래 식민지에서 샘플링 된 경우에도 주사 된 (원하는) 바이러스가 주어진 번데기에서 우세해질 것이라는 보장은 없습니다. 그림 4는 추출 후 볼 수 있는 바이러스 비율의 잠재적 범위를 보여줍니다. 표시된 네 개의 콜로니는 모든 번데기가 처음에 ~ 95 %의 이스라엘 급성 마비 바이러스 (IAPV) 접종을 주입 한 더 큰 바이러스 수확 노력의 하위 집합을 나타냅니다. 이러한 추출에 관여하는 16개의 콜로니 샘플 중 10개는 일부 > 99%(예를 들어, 콜로니 1)를 포함하여 매우 순수한 IAPV(> 95%)를 포함했지만, 다른 샘플은 IAPV 비율(예: 콜로니 2-3)이 다양했으며, 일부는 변형된 날개 바이러스(DWV)(예: 콜로니 4)와 같은 다른 바이러스에 의해 지배되기도 했습니다.
표 1은 RT-qPCR 역치 주기(Ct) 값 (PCR 표적이 검출 역치에 도달하는 지점) 및 100 ng RNA 당 총 바이러스 게놈 등가물 (ge)의 형태로 도 4에 도시된 4 개의 바이러스 (BQCV, DWV, IAPV, SBV)의 증폭 수준에 대한 추가적인 맥락을 제공한다. Ct값은 비율의 예측 변수로 사용될 수 있지만, ge 값은 표준 곡선 기반 방법(17)을 사용하여 계산될 필요가 있다. 생성 된 입자의 실제 양 (즉, ge)은 처리 된 번데기의 수와 추출 과정 동안의 필터링 엄격도에 달려 있습니다.
바이러스 입자 제제 (증폭 된 접종물)는 -80 °C에서 보관해야하며 여러 동결 - 해동 사이클(18)을 받으면 크게 저하 될 것이므로 분취하는 것이 좋습니다. 또한, 용량 반응 분석은 다양한 외부 요인 (벌집 유전학, 꿀벌 건강 등)이 매우 가변적 인 바이러스 반응을 유발할 수 있으므로 실험 전에 항상 수행되어야합니다. 실험 케이지로부터 유래된 데이터를 사용하여(도 3), 도 5 는 두 개의 상이한 연도 동안 동일한 IAPV 입자를 공급한 꿀벌의 용량-반응 생존 곡선을 비교함으로써 이러한 가변성을 입증한다. 동일한 바이러스 접종 및 1 % ~ 0.01 % IAPV의 시험 농도를 포함하여 동일한 테스트 매개 변수에도 불구하고 2018 년 (그림 5A) 및 2019 년 (그림 5B)에서 수행 된 시험은 수크로오스 접종물에서 바이러스를받지 않은 대조 처리를 제외하고는 모두 눈에 띄게 다른 생존 반응을 일으켰습니다. 원한다면,LD50 계산은 또한 보다 정확한 사망률 측정치(43)를 얻기 위해 이 시점에서 수행될 수 있지만, 근사치가 일반적으로 충분하기 때문에 이것은 일반적으로 필요하지 않다. 2018 년에 1 % 용량은 감염 후 72 시간 (hpi)에서 약 50 %의 생존율을 가져 왔으며, 따라서 그 해에 실시 된 대부분의 바이러스 케이지 실험의 기본 농도가되었습니다. 그러나 동일한 용량이 동시에 2019 년에 총 사망률에 가까운 결과를 얻었으며 그 결과 그 해에 수행 된 대부분의 바이러스 케이지 실험은 0.01 % IAPV 접종을 대신 받았다. 이 상당히 낮은 농도는 2018 년 1 % IAPV 접종과 동일한 수준의 사망률에 도달했으며 바이러스 입자를 100 배 적게 사용했습니다.
이들 데이터는 도 3에 도식화된 것과 유사한 케이지를 사용하여 생물검정으로 생성되었다. 상단과 측면의 피더 구멍은 쉽게 다이어트 제어를 할 수 있으며 슬라이딩 케이지 도어는 접종 트레이 또는 죽은 꿀벌과 같은 케이지 환경에서 물체를 간단하게 추가하거나 제거 할 수 있습니다. 그러나 일반화 된 바이러스 분석 프로토콜은 이러한 유형의 케이지 또는 식단 선택에 국한되지 않으며 실험 요구에 맞게 수정되어야합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig01.jpg"> 그림 1 : 애벌레 자체 제거 프로토콜 중 다양한 단계의 대표적인 이미지. (a) 밤새도록 자가 제거 기간 (1.6) 이후에 예상되었던 유충 질량의 예. (B) 별도의 주사 / 성장 트레이 (1.6.3) (C, D) 바이러스 주사 준비가 된 흰 눈 번데기 (1.9)에서 서로 떨어져 있는 유충. 갈색 반점은 제거 할 필요가없는 말린 애벌레 찌꺼기입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61725/61725fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig02.jpg"> 그림 2: 피하 주사 바늘과 다중 디스펜서 팁을 결합하여 만든 인젝터 장치의 예. 바늘 및 팁을 액체 접착제를 사용하여 접합시켜 반복 피펫터에 부착할 때 1 μL 유체 주사를 일관되게 전달하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61725/61725fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig03.jpg"> 도 3: 바이러스 생물분석에 사용된 실시예 케이지. 수크로오스 용액과 꽃가루는 시험 기간 동안 피더 구멍에도 불구하고 Ad libitum 을 제공받았다. 바이러스 접종물은 케이지의 바닥을 통해 삽입된 트레이를 사용하여 쉽게 전달될 수 있었다. 케이지 유형 및 피더 함량은 실험 매개 변수에 맞게 필요에 따라 조정할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61725/61725fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig04.jpg"> 그림 4: 4개의 샘플 콜로니로부터의 바이러스 제제에 걸친 평균 총 바이러스 부하 및 비율. 바이러스 부하를 100 ng RNA에서 블랙 퀸 세포 바이러스 (BQCV) + 변형 날개 바이러스 (DWV) + 이스라엘 급성 마비 바이러스 (IAPV) + 사브루드 바이러스 (SBV) 게놈 등가 (ge)로서 RT-qPCR에 의해 측정하였다. 각 샘플 콜로니는 원래 IAPV와 함께 주사된 150개 이상의 균질화된 번데기로 구성되었으며, 번데기 바이러스 주입 프로토콜로부터 생성된 바이러스 비율의 전형적인 범위를 나타낸다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61725/61725fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig05.jpg"> 도 5: 꿀벌 생물분석 케이지의 용량-반응 생존 곡선. 2018 (A) 및 2019 (B)의 케이지를 IAPV로 접종하고 시험 기간 동안 30 % 수크로오스 용액 Ad libitum을 공급했습니다. 처리는 30% 수크로오스 용액에 혼합된 1% 내지 0.1% IAPV 입자 제제를 나타내는 10-2 내지 10-4로 IAPV 접종 농도를 나타내고; 대조군 수크로오스 접종은 바이러스를 함유하지 않았다. n = 56에서 2018 총 케이지; n = 77의 2019 총 케이지. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61725/61725fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 네 개의 샘플 콜로니로부터의 네 개의 바이러스 제제 내의 바이러스 혼합물의 100 ng RNA 당 평균 역치 주기 (Ct) 값 및 게놈 등가물. 각 샘플 콜로니는 번데기 바이러스 주입 프로토콜로부터 생성된 150개 이상의 균질화된 번데기로 구성된다. 바이러스는 각 바이러스에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-qPCR에 의해 검출되었다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61725/Table_1.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K 조회수.  University of Illinois. 여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

비디오: Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Baculovirus과 Lepidopteran 애벌레의 구강 감염 프로토콜

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

연구

생물학

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component which can be extracted with an appropriate signal filter. Two factors are important: the EMG must be recorded in monopolar fashion, and the recording must be done so the low frequency signal corresponding the EPP is not eliminated. This report explains how to extract the EPP component from the EMG of the masseter muscle in a human subject. The surface EMG is recorded from eight sites using traditional disc electrodes aligned along over the muscle, with equal inter-electrode distance from the zygomatic arch to the angle of mandible in response to quick gum clenching. A reference electrode is placed on the tip of the nose. The EPP component is extracted from the raw EMGs by applying a high-cut digital filter (2nd dimension Butterworth filter) with a range of 10-35 Hz. When the filter is set to 10 Hz, the extracted EPP wave deflects either negative or positive depending on the recording site. The difference in the polarity reflects the sink-source relation of the end plate current, with the site showing the most negative deflection corresponding to the neuromuscular junction. In the case of the masseter muscle, the neuromuscular junction is estimated to be located in the inferior portion close to the angle of mandible. The EPP component exhibits an interesting oscillation when the cut-off frequency of the high-cut digital filter is set to 30 Hz. The EPP oscillation indicates that muscle contraction is adjusted in an intermittent manner. Abnormal tremors accompanying various sorts of diseases may be substantially due to this EPP oscillation, which becomes slower and is difficult to cease.

The endplate potential (EPP) component can be extracted from the surface EMG using a digital filter. The extracted EPP shows oscillation with a frequency of about 30 Hz.

표면 EMG에서 EPP 구성 요소의 추출

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

아프리칸 유럽 꿀 꿀벌에 의해 만들어 Beebread의 영양소를 비교하는 방법과하는 Hemolymph 단백질 역가에 미치는 영향

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

뼈 조정 배지 : 준비 및 생물 검정

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

심장 기능의 연구에 대한 해부와 벌 꿀 지느러미 선박의 관측

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

꿀 꿀벌에 Sublethal 농약 노출의 식민지 수준 효과 모니터링

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.