성인 마우스의 골격 근육에서 단일 심근 섬유를 분리하기 위한 많은 프로토콜이 존재합니다. 우리의 프로토콜은 아주 젊은 마우스를 위해 그리고 아주 연약한 근섬유를 가진 작은 마우스를 위해 고안됩니다. 이 표준화된 절차는 산후 발달 도중 근섬유 보조 근육 줄기 세포를 연구하거나 근섬유섬유를 기계적 스트레스에 특히 영향을 받기 쉬운 질병의 마우스 모형에서 공부하기 위해 사용될 수 있습니다.
절차는 글로리아 페글리올리에 의해 입증될 것입니다, 박사 과정 학생, 페데리카 루시니, 박사 후, 모두 실험실에서. 근육 해부 및 수확을 위해 핀을 사용하여 안락사된 매우 젊거나 아주 작은 마우스에서 한 개의 뒷다리를 해부 보드에 고정하고 날카로운 핀셋을 사용하여 티비알리스 앞쪽의 하부 힘줄을 발목 높이로 들어 올립니다. 힘줄을 잘라 슬개골의 수준에서 힘줄에 근육 주위에 모든 방법을 잘라 미세 가위를 사용합니다.
근육을 소화 용액 튜브에 넣고 엑스텐소 디지토리롱의 하부 힘줄을 들어 올리고 힘줄에서 부드럽게 위로 당겨 다른 근육과 엑스텐소 디지오럼 롱더를 분리합니다. 근육을 자르고 수확하십시오. 다리를 회전하여 허리 근육을 보고 아킬레스 건을 들어 올립니다.
위장관 근육은 자동으로 다른 근육과 분리됩니다. 슬개골 뒤쪽의 위 힘줄을 자르고 소화 용액에 근육을 놓습니다. 다리의 외부 힘줄을 들어 올리고 힘줄 아래에 핀셋을 굴려 힘줄을 근육에서 부드럽게 분리합니다.
그런 다음 근육을 수확하고 동일한 방식으로 다른 다리에서 동일한 근육을 수집하기 위해 잘라냅니다. 모든 근육이 수집되면 수집 튜브를 섭씨 37도의 수조에 45~50분 동안 넣고 10분마다 10회 튜브를 적극적으로 반전시면 됩니다. 근육이 느슨해지기 시작하고 근섬유가 눈에 띄게되면, 소화 현탁액을 10 밀리리터의 세척 용액을 함유한 100mm 페트리 접시로 소화 현탁액을 조심스럽게 옮기기 전에 마지막으로 샘플을 흔들어 줍니다.
단일 심근섬유를 분리하려면 접시를 해부 된 현미경 아래에 놓고 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 코팅 한 말 세럼을 사용하여 개별 근육 섬유를 따로 따로 선택하십시오. 실행 가능한 근섬유를 35mm 페트리 접시에 미리 데워진 세척 용액 5밀리리터가 들어 있는 말 세럼으로 옮기습니다. 모든 실행 가능한 근섬유가 수집되면 세포 배양 인큐베이터에서 근섬유 시료를 5분 동안 평형화합니다.
더 많은 근섬유가 필요한 경우, 추가 섬유가 기계적으로 방출 될 때까지 나머지 근육 조직 샘플을 세트리히하기 위해 큰 보어 유리 파이펫을 사용합니다. 충분한 근섬유제가 수집되면, 추가 평형 기간 동안 1시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 개별 근섬유를 적절한 배양 배지를 함유한 새로운 미리 데워진 말 세럼 코팅 접시로 옮기고 접시를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
근섬유의 면역형분석의 경우, 교차 연결 후 충분한 상체를 모두 제거하고, 섬유를 제거하고 PBS에서 0.5% Triton X-100의 동일한 튜브에 부드러운 동요로 5분 간 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면 섬유가 5분 동안 정착한 후 슈퍼너처를 PBS의 1.5 밀리리터로 교체할 수 있습니다. 부드러운 동요의 5 분 후, 섬유차단 용액의 1 밀리리터로 상체를 교체하기 전에 또 다른 5 분 동안 정착 할 수 있습니다.
1시간 동안 부드러운 교반 후 블로킹 용액을 1차 항체를 함유한 신선한 차단 용액으로 교체하여 섭씨 4도에서 잠복하는 데 있어 부드러운 동요를 가한다. 다음 날 아침, PBS에서 부드러운 동요와 실온에서 5분간의 퇴적물을 사용하여 PBS에서 신선한 0.25%Tween 20의 1밀리리터로 5분간 세척하여 섬유를 세척합니다. 마지막 세척 후, 적절한 플루오로크롬 공액이 있는 이차 항체로 섬유를 부드러운 동요로 실온에서 1시간 동안 차단용으로 희석하고, 빛으로부터 보호한 다음, PBS에 3개의 세척을 플러스0.1%Tween, 빛으로부터 보호한 것으로 나타났다.
마지막 세척 후, 상체를 DAPI 용액 1밀리리터로 교체하여 실온에서 5분간 배양하고 빛으로부터 보호합니다. 인큐베이션이 끝나면 섬유를 세척하고 절단 팁이 있는 블로킹 용액 코팅 파이펫을 사용하여 섬유를 수집하고 유리 슬라이드에 섬유를 조심스럽게 퍼냅니다. 슬라이드를 해부 현미경 아래에 놓고 거울에 의해 반사되는 자연 광만 을 사용하여 새로운 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 섬유를 부드럽게 퍼뜨리고 과도한 용액을 제거하십시오.
여분의 용액을 제거한 후 매우 적은 양의 용액만 남을 때까지 슬라이드가 어둠 속에서 10~15분 동안 건조되도록 합니다. 그런 다음, 조심스럽게 조직 위에 커버 슬립을 배치하기 전에 섬유에 장착 매체의 적절한 볼륨을 추가합니다. 성장 인자가 풍부한 매체에서 96 시간 동안 생존 할 수있는 길고 실행 가능한 섬유의 충분한 수를 회수하려면 4 개의 다른 근육은 일반적으로 수확되고 소화됩니다.
가장 온전한 섬유만 배양 매체로 옮겨야 한다. 깨진 섬유와 다른 파편을 버려야 합니다. 배양 72시간 후, 활성화된 위성 세포는 근섬유에 결합된 세포 응집체를 생성한다.
우리는 라빈 델타에서 파생된 세포 배양8 11 이중 음성 마우스가 더 적은 수의 세포에 의해 형성되는 것을 관찰합니다. 96시간 후, 위성 세포는 MyoG를 발현하고, 세포 클러스터 내에서 볼 수 있게 되어 새로운 근섬유로의 분화를 개시한다. 특히, 위성 세포 분화의 지연된 역학은 그들의 야생 모형 대응에 비해 호머지구우스 돌연변이 라빈 녹아웃 마우스에서 관찰됩니다.
빠르고 정확한 근육 수확이 실험의 성공에 필수적이기 때문에 근육 해부 단계를 연습해야합니다. 이 기술은 활성화 및 분화 하는 동안 단일 위성 세포의 추적을 허용, 다른 생리 및 병 리 조건에서 근육 성장 및 재생 의 기본 주요 프로세스의 연구를 촉진.
