안녕하세요 여러분. 제 이름은 니콜라스 인입니다. 저는 오하이오 주 콜럼버스에 있는 전국 아동 병원의 수석 연구원입니다.
그리고 오늘 우리는 당신에게 피부 생검을 복용하고 myoblasts및 myotube로 변환하는 방법에 대한 비디오를 보여 줄 거야. 이것은 신경 근육 장애를 공부 하는 매우 유용한 도구. 또한 이러한 유형의 셀에 직접 대처하기 위해 두 가지 유형의 바이러스를 사용하고 있기 때문에 IPSC에 비해 기술이 더 빠른 방법입니다.
이 비디오는 인간 피부 유래 섬유아세포 배양을 확립하고, myoblasts로의 전환, 그리고 근관을 차별화하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 피부 생검은 진피 섬유아세포를 도출하기 위하여 세포 배양으로 옮겨질 것입니다. hTERT 및 MYOD 유전자를 운반하는 렌즈 바이러스는 이 섬유아세포를 변환하기 위하여 이용됩니다.
독시사이클린으로 보충된 myoblast 성장 배지를 첨가하면 MYOD 유전자가 발현되어 섬유아세포가 myoblasts로 전환됩니다. 다음으로, 매체는 분화 매체로 전환되고, 또한 독시사이클린으로 보충된다. 그런 다음 근막세포가 서로 융합되어 다중 핵처리된 근사튜브를 형성합니다.
튜브에서 미디어를 흡습하고 10 밀리리터로 생검을 헹구고 실온에서 1 개의 x PBS를 세 번 헹구십시오. 세 번째 세척 후, 튜브에 PBS를 둡니다. PBS와 피부 생검을 10센티미터 제곱 접시에 붓습니다.
멸균 메스를 사용하여 생검을 가능한 한 작은 조각으로 자른다. 파이펫을 사용하여 개별 스킨 피스를 멸균 10센티미터 제곱 접시에 전달합니다. 각 조각 주위에서 PBS의 초과를 흡인.
조각 자체를 흡인하지 않도록주의하십시오. 뚜껑으로 접시를 부분적으로 덮고 피부 생검 조각이 5~20분 동안 건조되도록 합니다. 조각이 너무 오래 건조하지 마십시오.
조각이 건조되면, 45도 각도로 접시를 기울이고 천천히 접시의 모서리에 섬유 아세포 매체의 12 밀리리터를 추가합니다. 접시를 낮추고 미디어를 조심스럽게 배포하여 조각이 언론에 의해 들어 올리지 않도록합니다. 요리를 인큐베이터에 넣습니다.
5~7일, 그 후 일주일에 한 번 으로 미디어를 교체하십시오. 1차 섬유아세포는 다음 날 약 50%의 인플루엔티지를 갖기 위해 12개의 웰 플레이트, 약 20, 000개의 세포, 12개의 우물의 2개의 우물에서 1차 섬유아세포에 있다. 렌티바이러스 트랜스듀션의 경우, hTERP Puromycin Lentivirus의 2~50억 개의 바이러스 게놈과 400마이크로리터의 섬유아세포 배지를 추가합니다.
렌티바이러스 믹스를 한 가지 우물에 추가합니다. 두 번째 우물에 섬유 아세포 배지의 단지 400 마이크로 리터를 추가합니다. 다음 날, 미디어의 1 밀리리터를 추가합니다.
1~2일 후, 세포를 6개의 우물 판으로 옮기고 60~70%의 합류에 도달할 때까지 성장합니다. 푸로마이신의 밀리리터 당 1 마이크로그램으로 섬유아세포 배지를 보충하고 각 웰에 2밀리리터를 추가합니다. 제어의 모든 세포가 적어도 12 일 동안 죽을 때까지 셀을 선택하여 2 ~ 3 일마다 미디어를 변경하십시오.
종자 H 차트는 다음 날 약 50 %의 합류를 가지고 12 웰 플레이트의 세 우물에서 30 %의 합류에서 섬유 아세포를 표현한다. 렌티바이러스 트랜스듀션의 경우 MYOD Hygromycin B 렌즈티바이러스의 2~50억 바이러스 게놈과 400마이크로리터의 섬유아세포 배지를 혼합하여 2개의 우물에 추가합니다. 다음 날 1 밀리리터의 배지를 추가합니다.
1~2일 후에 세포를 6개의 우물 판으로 옮기고 60~70%까지 성장합니다. Hygromycin B.의 밀리 리터 당 400 마이크로 그램으로 성장 미디어를 보충 합니다 각 잘 에 두 밀리 리터를 추가. 제어 우물의 모든 세포가 죽을 때까지 셀을 선택하던 상태로 유지하여, 일반적으로 적어도 12일을 복용하여 2~3일마다 미디어를 변경합니다.
myoblasts의 유도를 위해, 그(것)들이 70%의 confluent 때까지 섬유아세포를 성장합니다. 독시사이클린밀리리터당 8마이크로그램을 근막세포 성장 배지에 넣습니다. 항상 독시사이클린과 매체의 신선한 알리쿼시를 사용하십시오.
매체는 미디어가 변경되기 직전에 준비해야 합니다. 또한 독시사이클린은 재고정해서는 안 됩니다. 섬유아세포 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 헹구십시오.
보충 된 myoblast 미디어의 10 밀리리터를 추가합니다. 2 ~3 일 후, 세포는 90 ~ 95 %의 컨실레이며 형태가 변경됩니다. myoblast 성장 매체를 흡인하고 PBS로 세포 표면을 헹구는.
신선한 독시사이클린의 밀리리터 당 8 마이크로그램으로 보충된 분화 매체의 10 밀리리터를 추가하십시오. myotube가 형성될 때까지 2~3일마다 미디어를 계속 변경합니다. 근전분분이 개시된 지 7~10일 후에 세포는 완전히 분화되어야 하지만, 이는 한 세포주에서 다른 세포주에서 다릅니다.
첫 번째 섬유아세포는 피부 조각이 배양된 지 5일 후에 나타날 수 있다. 사진 B에서 섬유아세포는 컨실카로되어 75센티미터 의 사각형 플라스크로 옮겨져 추가 확산을 위해 준비됩니다. 1 차 세포가 복제 노화를 입력할 때 낮은 통로 수에 섬유 아세포의 몇몇 유리병을 동결하는 것이 중요합니다.
일단 FM 세포주가 근사로 섬유아세포의 변환을 위해 설치되면, 섬유아세포는 그림A.에 도시된 바와 같이 70%의 컨플루천까지 증식해야 하며, 고밀도가 분화를 저해할 수 있기 때문에 80%의 수렴을 초과하지 않는 것이 중요합니다. 덩어리세포선을 배지에 첨가한 후, 2~4일 이내에 세포가 근막세포가 되고, B.분화된 심투포가 그림C.분화된 myotubes에 나타난 것과 같이 길쭉한 형태와 병렬 방향을 특징으로 하는 것은 셀 게노타입에 따라 7일에서 21일까지 다양할 수 있다. 세포가 분리되기 전에 수집하거나 고정해야 합니다.
분리의 시작은 이 그림의 화살표에 의해 지적된 바와 같이, myotube 가장자리의 색상과 밝기에 의해 관찰될 수 있다. 면역 형광에 의해, 성숙한 근육 특정 단백질의 발현은 근사로 섬유 아세포의 성공적인 변환을 확인합니다. 이 사진에서는 세 가지 다른 세포가 표시됩니다.
분화의 정도는 세포마다 다르며, 모델의 C.추가 검증이 RNAeq에 의해 확인되었다. 이 플롯에 나타난 바와 같이 12개 이상의 분현유전자가 있으며, 000개의 분화 유전자는 해골 근육에 비해 FM 심포튜브에서 검출된다. 두 전사 사이의 중요한 상관 관계는 FM 세포가 근육 유래 세포주를 위한 유용하고 신뢰할 수 있는 대리임을 보여주는 근육 특정 발현 프로파일을 가지고 있음을 뒷받침합니다.
이 시험관 내 모델의 유용성을 설명하기 위해 DMD 유전자에서 가장 흔한 외장 복제 중 하나를 사용했습니다. Exon 2의 복제는 DMD 판독 프레임의 중단으로 이어지며, 건너뛰기는 해당 판독 프레임의 복원 또는 내부 리보솜 진입 사이트의 활용으로 이어질 수 있습니다. 이 치료법은 이미 생체 내 연구 그림 A로 검증되었으며, 우리는 엑슨 건너뛰기에 의한 치료 유무에 관계없이 이 특정 돌연변이 세포주의 RTPCR 분석에 의한 개념 증명을 입증했습니다.
도 B의 서쪽 얼룩은 기능성 Dystrophin 단백질이 처리된 세포에서 발현된다는 것을 보여줍니다. 이 치료법의 효율을 생체 내 모델과 비교할 때, 결과는 세포 분화 기술의 신뢰성을 지원하고 다양한 돌연변이 특이적 유전자 치료를 테스트하기 위한 사용을 지원합니다. 신경 근육 장애에 대한 공식 치료 지원의 효능을 테스트하는 데 필요한 임상 연구 전에, 동물 및 세포 모델의 능력에 따라.
동물 모델의 개발, 비록 요즘 쉽게 되 고, 각 특정 돌연변이에 대 한 그것의 실현 가능한 옵션. 진피 섬유아세포에서 유래된 IPS 세포를 통한 근막세포의 생성은 대안이지만 시간이 많이 걸리는 기술입니다. 따라서, 이 절차는 자궁 근막으로 섬유 아세포의 직접 변환을 허용하는 IPS 생성에 대한 간단한 대안이다.
그것은 근육 생검의 더 침략적인 응용을 피함으로써 인간 세포 모형에 접근을 용이하게 합니다 결론에서, myoblasts로 섬유아세포의 이 직접적인 변환은 특정 맥락을 제한하는 신경 근육 무질서를 위한 치료를 시험하기 위한 강력한 공구입니다.
