시냅스는 뉴런의 기능적 요소이며 결함이나 손실은 여러 신경 퇴행성 및 신경 장애의 기초입니다. 이미징 연구는 생리학적 및 병리학 적 조건에서 자신의 기능과 가소성을 조사하는 데 널리 사용됩니다. 단백질의 크기와 구조 때문에 고해상도 이미징 기술이 필요합니다.
이 프로토콜에서, 우리는 구조화된 조명 현미경을 사용하여 초해상도 수준에서 시냅스 마커를 가진 표적 단백질의 공동 국소화를 1 차 뉴런에서 공부하는 절차를 기술합니다. SIM은 약 100 나노미터의 세부 사항에 도달, 넓은 필드 현미경 검사법의 공간 해상도를 두 배로 패턴 조명 기술이다. 이 프로토콜은 강력한 공동 지역화 연구에 필요한 제어 및 설정과 이미징 데이터를 제대로 분석하는 통계 방법에 대한 개요를 나타냅니다.
그러나 초해상도 수준에서 분석을 허용하는 핵심은 목표의 회절 인덱스와 호환되는 챔버 커버립 및 장착 솔루션과 같이 획득 중에 사용되는 시약입니다. 마우스 해마 1 차 신경을 얻으려면, P1에서 P4 새끼로 해마를 분리합니다. 플레이트 셀70, 000 셀당 잘 부피 200 마이크로 리터당.
해마 1 차 신경이 완전히 성숙 될 때까지 기다립니다 12 받는 번째 14 공동 지역화 연구를 수행 하기 위해 도금 후 일. PBS 200 마이크로리터에 4%의 파라포름알데히드,PFA를 추가하여 뉴런에 잘 어울리하게 수정하여 신속하게 수정합니다. 실온에서 1시간 동안 200마이크로리터당 200마이크로리터의 PBS에서 1%소 세럼 알부민, BSA로 샘플을 배양하여 분석용 무관단백질로 플레이트의 모든 자유 결합 표면을 수동적으로 커버한다.
Triton X-100이 없는 BSA 기반 차단 버퍼는 0.2%트리톤 X-100을 가진 동일한 버퍼보다 항체 배경을 보다 효율적으로 감소시킨다. 1 차적인 항체를 추가합니다. 부정적인 대조군으로서, 우물 중 하나에 어떤 1 차적인 항체를 추가하지 마십시오.
SIM 호환 마운트를 사용하여 마운트 셀(예: ProLong Glass Antifade Mountant). 커버와 커버 유리, 예를 들어, 8 밀리미터의 직경둥근 커버 글래스로 세포를 보호합니다.
정사각형 을 사용할 수도 있습니다. 챔버 커버립을 실온에 보관하고 이미지를 획득하기 전에 적어도 48 시간을 기다립니다. 다이아몬드 유리는 슈퍼 해상도 획득 전에 적어도 이틀의 경화가 필요합니다.
항체 특이성을 보장하기 위해 두 가지 전략을 사용합니다. 첫 번째는 동일한 기판을 표적으로 하는 적어도 2개의 상이한 항체의 사용입니다. 두 번째 전략은 정제된 단백질 표적을 이용한 배큐비에 의한 항체 중화, 또는 항체를 높이기 위해 사용된다.
우리는 정기적으로 우리의 분석을 위해 Nikon에 의해 제조 된 N-SIM 슈퍼 해상도 현미경을 사용합니다. 다음 지침은 사용 현미경과 는 별개로 SIM 이미지를 수집하기위한 것입니다. 또한 교정 링, 레이저 정렬 및 격자 블록 초점을 포함하여 계측기의 정확한 교정을 수행하기 위해 현미경의 성능을 극대화하는 것이 중요합니다.
SIM 이미지를 획득하기 전에 시스템은 특정 하위 해상도 크기의 형광 구슬을 적절히 보정해야 합니다. 예를 들어 테트라스펙 마이크로스피어가 있습니다. 이 구슬은 하나의 샘플로 다른 레이저의 보정을 허용하기 위해 다른 형광 염료로 얼룩져 있습니다.
수조에서 10분 동안 8형광 마이크로스피어에 1.8배 10배 정도 초음파 처리합니다. 이중 증류수로 500개 중 형광 마이크로스피어를 희석시 희석시다. 추가 10 분 동안 두 번째 를 음속.
희석된 구슬의 파이펫 15 마이크로리터가 챔버 커버슬립의 우물에 넣습니다. 실온에서 5분간 용액을 건조시키십시오. 예를 들어 마운팅 솔루션의 마이크로리터 10개 추가
프로롱 글래스, 위에 8 밀리미터 커버 슬립을 배치합니다. 적절한 경화를 허용하려면 적어도 48 시간을 기다립니다. 현미경과 레이저를 켭니다.
모든 현미경 구성 요소의 열 평형에 도달하기 위해 시스템을 따뜻하게하고 SIM 초해상도 현미경 시스템은 적어도 3 시간이 필요합니다. 100X 목표를 선택합니다. 레이저를 회절 격자 블록의 중심에 정렬하여 교정을 시작합니다.
N-SIM 시스템에서는 마이크로미터 노브와 전용 카메라를 사용하여 광선을 대상에 중앙을 구성할 수 있습니다. 현미경의 챔버 커버슬립을 삽입하여 볼 수 있습니다. 객관적인 보정 커버를 조정하여 챔버 커버슬립 두께로 시스템을 설정합니다.
N-SIM 초해상도 현미경 시스템과 함께 제공되는 독점 소프트웨어인 NIS Software는 색상 보정을 조절하는 자동 기능을 갖추고 있습니다. 각 채널에 대한 격자 블록 포커스를 조정하여 샘플에 초점을 맞춘 구조화 패턴 조명을 보장합니다. 이 소프트웨어는이 작업에 대한 자동 기능을 제공합니다.
멀티 컬러 마이크로스피어의 원시 3D SIM 이미지를 획득합니다. 각 파장에 대해 계산하여 매우 해결된 이미지의 Fourier 변환을 계산합니다. 변형된 이미지가 올바른 꽃 모양 패턴을 얻지 못하면 슈퍼 해상도가 달성되지 않았기 때문에 교정을 다시 시작합니다.
수퍼 해결 된 이미지에서 단일 마이크로 스피어를 선택하고 각 채널에 대한 강도 프로파일을 계산하여 달성 된 해상도를 측정합니다. 이제 100 나노미터에 가까운 측면이어야 합니다. 마이크로스피어의 멀티 채널 인수를 오버레이하여 채널 등록을 수행합니다.
목표는 모든 채널 신호를 측면및 축으로 정렬하는 것입니다. 이렇게 하면 서로 다른 채널의 정렬 불량으로 인해 색수차를 제거하고 공동 지역화 분석을 지원합니다. 오픈 소스 응용 프로그램 ImageJ에 대한 플러그인 제품군인 SIMcheck의 기능 조명 단계 및 조명 패턴 포커스를 사용하여 교정 품질을 확인합니다.
공초점 또는 와이드필드 모드에서 40X 목표를 사용하여 샘플 분석을 시작합니다. 이렇게 하면 샘플의 탐색을 통해 좋은 세부 사항과 넓은 시야를 유지할 수 있습니다. MAP2 항체 신호를 사용하여 신경 과정을 나타내는 영역을 감지합니다.
공초점 모드에서 샘플의 이미지를 획득하여 염색의 품질을 결정합니다. 목표 100X로 전환합니다. 100X 목표에 오일을 적용합니다.
나중에 슈퍼 해결 된 이미지의 품질을 평가하는 데 사용할 넓은 필드 또는 공초점 이미지를 획득합니다. 3D SIM 모드로 전환합니다. 대화 창을 사용하여 수집을 위한 매개 변수를 설정하려면 색상 정보를 최대화하기 위해 사용할 수 있는 가장 높은 비트 깊이 설정을 선택합니다.
일반적으로 16비트는 표준 선택입니다. 또한 신호 대 잡음 비율을 개선하기 위해 1메가헤르츠와 같은 획득을 위한 저주파 값을 선택합니다. 히스토그램 창을 사용하여 레이저 전원을 설정하여 정보 손실을 방지하고 이미지의 포화 픽셀을 제한하기 위해 신호의 선형 응답을 얻습니다.
N-SIM 시스템은 Andor iXon3 카메라를 사용합니다. 16비트로 작업할 때는 카메라의 선형 응답을 보장하기 위해 16, 000의 목표 강도를 선택합니다. 또는 인수의 동적 범위를 최대화하기 위해 30, 000 ~ 45, 000 사이의 범위를 선택합니다.
샘플을 이미징할 때 0.1%에서 50%의 레이저 전력을 설정하고 50밀리초에서 2초 사이의 노출 시간을 설정합니다. 50% 이상의 레이저 파워는 사용 중형 형광의 신속한 광표백을 일으킬 수 있습니다. 3D SIM 모드에서 이미지 수집을 시작합니다.
ImageJ용 무료 플러그인 제품군인 SIMcheck를 사용하여 원시 이미지의 획득 품질을 평가합니다. SIMcheck가 아티팩트 또는 품질 문제를 감지하지 못하는 경우 전체 기술 복제에서 최소 10개의 이미지를 수집하여 통계 분석을 허용합니다. 획득된 이미지는 추가 분석에 사용되는 재구성된 SIM 이미지를 얻기 위해 처리해야 하는 원시 데이터입니다.
프로토콜에서 시냅토피신과 PSD-95를 시냅스 마커를 사전 및 게시하는 것이 좋습니다. 그러나 추가 마커를 사용할 수 있습니다. 거대한 문학 체는 드레브린과 바순과 같은 다른 단백질의 사용을 시냅스 마커로 사용합니다.
3D SIM 획득 이미지는 재구성된 슈퍼 해결 이미지를 얻기 위해 처리해야 하는 원시 이미지입니다. 원시 이미지를 잘못 재구성하면 샘플 분석에 영향을 주는 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 따라서 재건 매개 변수를 올바르게 선택하려면 큰 주의를 기울여야 합니다.
현미경 재구성 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 이미지를 처리하여 매우 해결된 이미지를 얻습니다. 또는 자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ 플러그인 페어SIM을 사용하여 원시 이미지를 재구성합니다. 현미경 재구성 소프트웨어 또는 ImageJ 플러그인 SIMcheck를 사용하여 슈퍼 해결 된 이미지의 Fourier 변환을 계산합니다.
좋은 재구성 된 이미지는 각 채널, 꽃과 같은 이미지에 대해 반환해야합니다. 재구성된 이미지가 꽃모양 모양을 다시 만들지 못하면 원시 이미지에서 다시 시작하고 선형 필터링, 아포디제이션 및 제로 순서 억제와 같은 재구성 매개 변수를 수정하여 재구성합니다. 미리 보기를 사용하여 매개 변수변경이 최종 해결된 이미지에 미치는 영향을 모니터링하고 매개 변수의 조명 변조 조정 콘트라스트, 고해상도 노이즈 억제 및 초점 억제를 수정합니다.
재구성된 이미지를 분석하여 ImageJ 기반 플러그인인 NanoJ-SQUIRREL을 사용하여 아티팩트를 바이어스방식으로 감지하여 매우 해결된 이미지의 품질을 평가합니다. 공동 현지화 분석에서 우리는 두 가지 접근 방식을 사용했습니다. 첫 번째는 공동 지역화의 단일 이벤트를 표시하고 각 채널의 기여를 식별하는 프로파일 분석을 기반으로 하는 시각적 접근 방식입니다.
시냅스 마커와 관심 있는 단백질 간의 공동 국소화를 연구하는 첫 번째 단계로, 초고결된 이미지를 취하고 단일 궤적을 분석하여 신호 중첩을 결정합니다. 슈퍼 해결 된 이미지에서 단일 궤적을 식별합니다. 관심의 궤적에 형광 신호의 강도 프로파일을 가져옵니다.
프로파일 분석이 단일 궤적 공동 지역화를 제안한 경우 Pearson 및 Mander의 계수를 계산하여 전체 이미지에 대한 보다 일반적인 분석을 수행할 수 있습니다. ImageJ 플러그인인 JACoP를 사용하여 공동 지역화의 두 가지 매개 변수인 Pearson's와 Mander's를 결정합니다. 시스템을 보정하고 재구성된 이미지의 품질을 평가한 후, 우리는 다음으로 MAP2, 신경 마커, PSD-95, 포스트냅틱 마커 및 표적 단백질 SUMO1에 대한 항체로 얼룩진 1차 신경 배양을 분석하기 시작했습니다.
먼저 40X 목표로 4채널 공초점 현미경 검사를 수행하는 샘플을 분석했습니다. 신경 과정을 나타내는 영역을 선택하면 100X 목표로 전환했습니다. 나노J-SQUIRREL로 재건의 질을 평가하고 공동 현지화 분석을 수행하기 위해 같은 지역의 공초점 및 SIM 이미지를 모두 획득했습니다.
시냅스의 구조와 구성을 해명하는 것은 기억과 인식을 조절하는 생리학적 및 병리학적 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 정상적인 상태 시 냅 스에서 메모리의 빌딩 블록, 그들은 또한 복잡 한 신경 장애의 기초, 치 매 알츠하이머 병의 가장 일반적인 형태 중 하나 등. 여기에 설명된 프로토콜은 구조화된 조명 현미경 검사법에게 불린 초해상도 현미경 검사기와 시냅스의 단백질 조성의 연구를 허용합니다.
