Name: a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes at JoVE.com

이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회, 퐁드 드 레체슈 뒤 퀘벡 자연 에 테크놀로지, 혁신을위한 캐나다 재단, 맥길 대학 창업 기금에 의해 지원되었다.

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우리는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜에 제시된 HDX-MS 워크플로우는 단백질의 구조적으로 역동적인 요소의 공간 분포를 매핑하고 이러한 역학이 변투(리간드 결합, 효소 돌연변이 발생 등)에 대한 응답으로 어떻게 변화하는지 조사하기 위한 매우 견고한 플랫폼을 제공합니다. HDX-MS는 일반적으로 형성 역학을 조사하는 데 사용되는 다른 구조 생물학 접근 방식에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 보유하고 있습니다. 특히 소량의 단백질만 필요합니다. 본 명세서에 기재된 워크플로우를 사용하여, 1 μM 단백질의 1mL 샘플은 5개의 교환 시간 점을 포함하는 각각의 삼중 화질 HDX 반응에 충분한 물질을 제공한다. 더욱이, 관심있는 단백질에 대한 크기 제한은 거의 없으며, 단백질 복합체는 HDX-MS 접근법에 동등하게 순종한다. 크기 제한은 펩틱 펩티드가 크로마토그래피로 해결할 수 있는 범위와 m/z 및 이온 이동성 치수에 의해서만 제한됩니다. 따라서 많은 단백질/단백질 복합체의 경우 HDX-MS는 단백질-단백질 상호 작용 인터페이스, 리간 드니스트 사이트, 형태 역학 및 알로스터릭 네트워크에 대한 귀중한 정보를 제공할 것입니다. 마지막으로, HDX 반응은 내인성 활동이 보존되는 것을 확인하는 데 도움이 될 것입니다 단백질의 사이트 특정 라벨링 / 엔지니어링에 대한 필요없이 부드러운, 거의 네이티브 조건하에서 수행됩니다. 접근법의 주요 제한사항(관심 있는 단백질에 제공하는 기계성 정보의 관점에서)은 펩타이드 레벨 HDX 데이터가 본질적으로 낮은 공간 해상도라는 것이다. 따라서, 데이터는 이차 구조의 변화가 일어나고 있음을 추론하기에 충분하지만, 구조적 교란의 기계적 영향은 구조, 계산 연구 및/또는 생화학 적 연구를 완전히 해석하기 위해 더 높은 해상도(예를 들어, NMR, 극저온, 또는 X선 결정)를 필요로 한다.
결과의 재현성과 신뢰성을 보장하기 위해 프로토콜의 몇 가지 중요한 측면을 염두에 두어야 합니다. 첫째, HDX 반응 중 중 중수소 교환의 범위와 작업 및 분석 중 백 교환의 정도는 pH, 시간 및 온도에 크게 의존한다. 따라서 버퍼, HDX 반응 및 LC-MS 방법의 제조 절차는 데이터 집합 전반에 걸쳐 이러한 물리적 매개 변수의 변동을 최소화하기 위해 가능한 한 체계적으로 이루어져야 합니다. 가능하면, 비교될 생화학 국가에 대한 HDX 반응은 같은 날에 동일한 연구원에 의해 수행되어야하며, 이러한 샘플에 대한 LC-MS 데이터는 동일한 용매 배치로 연속일 동안 수집되어야합니다. 시간이 지남에 따라 펩신 소화의 효율도 감소하므로 상대적으로 좁은 기간 내에 소화되고 분석되는 것과 비교되는 시료에 최적입니다-특히 펩신 컬럼이 다른 많은 유형의 샘플을 소화하는 데 사용되는 경우. 표준 단백질을 사용하여 펩신 컬럼의 소화 효율을 주기적으로 확인하는 것이 좋습니다. 이를 위해 새로 소화된 샘플을 이전 샘플과 비교하여 동일한 표적 펩타이드 집합이 유사한 강도로 검출되는 경우 전용 HDX 처리 소프트웨어 프로젝트를 설정할 수 있습니다.
이 프로토콜에 제시된 워크플로우는 많은 효소/단백질 시스템에 적합한 데이터를 제공해야 하지만, 몇 가지 잠재적인 최적화 지점이 있습니다. 첫째, HDX 반응의 시간 척도를 수정하여 더 빠르고 느린 역학을 캡처할 수 있습니다. 특히, 많은 효소는 몇 초 안에 완전히 교환되는 매우 역동적인 원소를 포함합니다. 이러한 매우 역동적인 요소가 관심 있는 경우, 사전 정상 상태, 연속 교환 HDX-MS에 대한 방법이문헌(31)에보고되었다. 둘째, LC 방법 조건은 소화 효율(궁극적으로 시퀀스 커버리지를 결정하는) 및 중수소 보존(궁극적으로 방법의 감도를 결정하는)을 변경하도록 쉽게 변경할 수 있다. 펩신 소화의 지속 시간 및 온도를 고려하여, 느린 유량과 높은 온도는 단백질의 더 철저한 소화를 선호합니다. HDX 분석의 단백질 농도는 신호 강도가 너무 낮거나 펩신 소화가 너무 비효율적인 경우 감소될 경우 증가할 수 있다. 분석 C18 컬럼상에 펩틱 펩티드를 분리하는 데 사용되는 아세토닐 그라데이션을 고려할 때, 더 빠른 그라데이션은 중수소 라벨을 보존하지만 소화된 반응 혼합물에 존재하는 펩티드의 크로마토그래피 분해를 희생한다. 더 적은 펩티드가 소화에 존재하는 더 작은 단백질(~200아미노산)의 경우, 더 빠른 LC 그라데이션을 구현하기가 더 쉬울 수 있다. HalM2(~1,000개의 아미노산)와 같은 더 큰 단백질의 경우, 혼합물에서 더 많은 수의 펩티드에 의해 생성된 추가 스펙트럼 복잡성을 해결하기 위해 더 긴 그라데이션이 필요하다. 이 후자의 시나리오에서는 가스 상 이온 이동성 분리를 포함하면 분석의 피크 용량을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이온 이동성 분리의 포함은 소음 비율에 대한 신호가 약간 감소하는 비용으로 제공됩니다. 마지막으로 HDX 샘플에 대한 MS 데이터를 MSE 모드에서 수집할 필요가 없다는 점에 유의해야 합니다. MSE 듀티 사이클의 MSMS 부분(즉, 고충돌 에너지 세그먼트, 단계 3.3.7.2)은 펩티드 목록(프로토콜 섹션 4)을 정의하기 위해 기준 샘플에대해서만 요구된다. 따라서, HDX 샘플은 신호:잡음 비율을 증가시키기 위해 MS 전용 모드에서 분석되어야 한다.
이 프로토콜에 설명된 워크플로우가 제대로 작동하는 경우, 완전히 교환 된 펩타이드는 60%-70 %의 상대 중수소 섭취 값을 나타내야한다. 중수소 섭취량이 이것보다 실질적으로 낮은 것으로 판명되면(용매 노출, 보호되지 않은 펩타이드의 경우), 가장 가능성이 높은 설명은 시료의 pH가 작업/분석의 일부 동안 변화하고 있다는 것입니다. 이 시나리오에서는, 마이크로팁 전극을 사용하여 HDX 분석기의 pH와 담금질 반응 알리쿼트의 pH를 주의 깊게 모니터링해야 한다. LC-MS 용매의 pH도 확인해야 합니다. 이 문제의 발생을 최소화하기 위해 분석에 필요한 모든 버퍼 및 시약의 집중 된 재고 솔루션을 준비하고 저장하는 것이 좋습니다 (프로토콜 섹션 1에 설명된 대로).
최근 몇 년 동안, HDX-MS는 단백질 구조 역학을 조사하는 강력한 분석 도구로 부상했다. HDX 실험에 설계 및 최적화된 상용 LC-MS 시스템의 개발(예: 이 연구에 사용되고 재료에 나열된 시스템)과 강력한 소프트웨어 패키지와 결합하여 HDX-MS 접근 방식을 많은 학술 및 산업 실험실로 확장했으며, 15년 전 틈새 기술이었던 것을 보다 사용자 친화적인 분석 플랫폼으로 탈바꿈시켰습니다. 공간 적 해상도의 한계에도 불구하고 HDX-MS는 단백질 모션에 대한 정량적이고 재현 가능한 측정을 제공하며 다른 접근법으로 조사하기 어려운 구형 동적 효소를 연구하는 데 이상적입니다. 이러한 특성 때문에 HDX-MS는 생물학 및 의학의 많은 근본적인 영역에서 관련성이 있는 무질서하고 역동적인 단백질 시스템의 구조 생물학에서 필수적인 틈새 시장을 채웁니다. 따라서 HDX-MS 분석은 당분간 구조 생물학자의 무기고에서 중요한 도구로 남아 있을 것으로 예상됩니다.

단백질은 펨토초 규모의 결합 진동에서부터 여러 초 동안 발생할 수 있는 전체 단백질 도메인의 재배열에 이르기까지 시간 척도에 따라 다른 적합성을 샘플링하는 구조적으로 역동적인분자입니다. 이러한 형태 적 변동은 종종 효소 / 단백질 기능의 중요한 측면입니다. 예를 들어, 리간드 결합에 의해 유도된 형태 변화는 촉매에 필요한 활성 부위 잔류물을 구성하거나, 순차적 운동 메커니즘에서 기판 결합 부위를 정의하거나, 환경에서 반응성 중간체를 차폐하거나, 알로스티아 네트워크를 통해 효소 기능을 조절함으로써 효소 기능을 조절하는 데 매우 중요합니다. 최근 연구에 따르면 형태 역학은 진화 전반에 걸쳐 보존될 수 있으며 분자 운동을 보존하는 혼란은 기판 특이성의 변화와 새로운 효소 기능2,3의출현과 상관관계가 있을 수 있음을 보여주었다.
최근 몇 년 동안 수소-중수소 교환 질량 분광법(HDX-MS)은 단백질 형성 경관이 리간드 결합 또는 돌연변이 발생4,5,6,7과같은 동요에 어떻게 반응하는지 조사하는 강력한 기술로 급속히부상하고 있다. 전형적인 HDX-MS실험(도 1)에서관심 있는 단백질은 D2O로 제조된 완충제에 배치되어, 이는 신테리아를 가진 용매 교환 성수기의 교체를 유발한다. 펩티드 결합의 아미드 모이티의 교환 속도는 pH, 국소 아미노산 서열 및 아미드8의국소 구조 환경에 크게 의존한다. 수소 결합 상호 작용에 종사하는 아미드 (예 : α-헬릭 및 β 시트에 존재하는 것과 같은)은 대량 용매에 노출되는 단백질의 구조화되지 않은 영역에서 아미드보다 더 느리게 교환됩니다. 따라서, 중수소 섭취의 정도는 효소의 구조를 반영한다. 형태역학적 이거나 리간드 결합 시 구조적 전이를 겪는 효소는 측정 가능한 HDX 응답을 얻을 것으로 예상됩니다.
구조화된 아마이드의 느린 환율에 대한 기계론적 기초는 도 25,8,9로도시된다. HDX를 받기 위해서는, 구조화된 영역은 먼저 전개된 형성을 일시적으로 샘플링해야 하며, 이러한 용매 분자는 특정 산/염기 화학 메커니즘을 통해 HDX 교환을 촉매하는, 교환 가능한 아미드에 접근할 수 있다. 궁극적으로,화학환율(kchem)과접이식 및 재접이식 비율(kopen 및 kclose)의상대적 크기는 실험5,8에서측정된 HDX 속도를 결정한다. 이 간단한 운동 모델에서, 중수소 섭취량의 정도는 기본 형태 역학을 반영할 것이 분명하다 (k열기 및 k닫기에의해 정의). 대부분의 HDX-MS 실험은 상향식 워크플로우에서 수행되며, 교환 반응에 따라 관심 있는 단백질이 펩타이드로 소화되고 각 펩티드에 의한 중수소 흡수량은 질량7의증가로 측정된다. 이러한 방식으로, HDX-MS는 효소 형성 역학에 대한 교란을 펩티드의 로컬 공간 척도에 매핑할 수 있게 하여, 연구자가 동요가 관심 있는 효소의 다른 영역에서 역학을 어떻게 변화시키는지 평가할 수 있게 합니다.
단백질 구조 역학을 해명하기 위한 HDX-MS 접근법의 장점은 다양합니다. 먼저, 이 방법은 사분위구조(10)를가진 시스템에서 소량의 토종 단백질 또는 단백질 복합체로 수행될 수 있다. 분석에서 사용되는 효소 제제는11,12,상향식 HDX-MS 워크플로우가 단백질 서열을 커버하는 충분한 수의 자신있게 확인된 펩티드를 제공하는 한, 고도로 정제될 필요가 없다. 더욱이, HDX-MS는 단일 분자 형광연구에서사용되는 바와 같이 현장별 단백질 라벨링필요 없이 근사 조건하에서 형성 역학에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 조사할 수 있는 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 크기 제한은 없다(핵자기 공명[NMR] 분광법 도전과 같은 접근법을 만드는)7,14. 마지막으로, 시간 해결된 HDX-MS 방법은 X선결정학15,16,17,18로공부하기 어려운 본질적으로 무질서한 단백질을 연구하기 위하여 이용될 수 있다. HDX-MS의 주요 제한사항은 데이터가 낮은 구조적 해상도라는 것입니다. HDX-MS 데이터는 형태 역학이 변화하는 곳을 가리키고 결합된 형태 변화를 드러내는 데 유용하지만 관찰된 변화를 유도하는 정확한 분자 메커니즘에 대한 많은 통찰력을 제공하지는 않습니다. 단백질 HDX-MS 데이터와 전자 포획 해리 방법의 조합에 있는 최근 발전은 단 하나 아미노산 잔류물19에교환 사이트를 매핑하는 약속을 보여주었습니다, 그러나 후속 생화확적인 및 구조 적인 연구는 아직도 HDX-MS 데이터에 의해 전달된 구조 모형에 명확성을 제공하기 위하여 수시로 필요합니다.
아래, HDX-MS 분석기의 개발을 위한 자세한 프로토콜이20을제시한다. 아래에 제시된 견본 준비 프로토콜은 수성 완충제에 있는 좋은 용해도를 전시하는 어떤 단백질든지 일반적으로 적용되어야 합니다. 세제 또는 인지질(21,22,23,24)의존재에서 분석될 필요가 없는 것보다 더 전문적인 시료 제조 방법및HDX-MS 워크플로우를 단백질에 사용할 수있다. HDX-MS 데이터 수집을 위한 기악 설정은 액체 크로마토그래피 시스템에 결합된 고해상도 쿼드러폴 비행 시간 질량 분광계에 대해 설명됩니다. 유사한 복잡성 과 해상도의 데이터는 상업적으로 이용 가능한 다수의 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS) 시스템에서 수집될 수 있습니다. 시판되는 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 처리의 주요 측면도 제공됩니다. 또한 광범위한 HDX-MS 커뮤니티12의권장 사항과 일치하는 데이터 수집 및 분석에 대한 지침을 제시합니다. 기재된 프로토콜은 항균 펩티드천연물(20)의다단계 성숙을 촉매하는 란티펩타이드 합성물인 HalM2의 동적 구조적 특성을 연구하는 데 사용된다. 우리는 HDX-MS가 기판 바인딩 사이트와 이전 특성을 벗어난 알로스터 속성을 공개하는 데 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다. 단백질 HDX-MS에 대한 몇몇 그밖 프로토콜은 최근25,26에서간행되었습니다. 현재 작업과 함께 이러한 초기 기여는 독자에게 실험 설계에 약간의 유연성을 제공해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>formic acid</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidine-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>BioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Hydrochloride</td><td>TRC Canada</td><td>T012500</td><td>peptide was synthesized upon request</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Material/ Equipment&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>version 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>version 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>version 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx&lt;br/&gt; Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>version 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&amp;ouml;dinger</td><td>version 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Material/ Equipment&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument and equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column</td><td>Waters</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column</td><td>Waters</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microtip pH electrode</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn</td><td>Waters</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt G2-Si</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes

수소-황량제 교환 질량 분석법(HDX-MS)은 효소 형태 변화와 효소 기질 상호작용의 생체물리학적 특성화를 위한 강력한 방법입니다. HDX-MS는 소량의 물질만 소비하며, 효소/기질 라벨링 없이 근동 조건하에서 수행할 수 있으며, 큰 효소 및 다단백 복합체에서도 효소 형성 역학에 대한 공간적으로 해결된 정보를 제공할 수 있습니다. 이 방법은D2O에서 제조된 완충제로 관심 있는 효소의 희석에 의해 개시된다. 이것은 중수소 (N-D)를 가진 펩티드 본드 아마이네스 (N-H)에서 프로티움의 교환을 트리거합니다. 원하는 교환 시점에서, 반응 알리쿼트가 담금질되고, 효소는 펩티드로 프로테오리제화되고, 펩타이드는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)에 의해 분리되고, 각 펩타이드의 질량의 변화(중수소용 수소의 교환로 인해)는 MS에 의해 기록된다. 각 펩티드에 의한 중수소 섭취량의 양은 해당 펩티드의 국소 수소 결합 환경에 크게 의존한다. 펩타이드는 효소 교환 중음류의 매우 역동적인 부위에 매우 빠르게 존재하는 반면, 잘 정렬된 지역에서 유래된 펩타이드는 훨씬 더 느리게 교환을 받는다. 이러한 방식으로, HDX 속도 로컬 효소 형성 역학에 대 한 보고서. 다른 리간드가 있는 중수소 섭취량 수준에 대한 혼란은 리간드 결합 부위를 매핑하고, 알로스터 네트워크를 식별하고, 효소 기능에서 형성 역학의 역할을 이해하는 데 사용될 수 있다. 여기에서, 우리는 우리가 더 나은 lanthipeptides에게 불린 펩티드 천연 제품의 모형의 생합성을 이해하기 위하여 HDX-MS를 이용한 방법을 보여줍니다. Lanthipeptides는 전통적인 구조 생물학 접근으로 공부하기 어려운 크고 다기능, 형태역학적 효소에 의해 번역 후 변형되는 유전자 로코딩된 펩티드입니다. HDX-MS는 이러한 유형의 효소의 기계적인 특성을 조사하기 위한 이상적이고 적응력이 뛰어난 플랫폼을 제공합니다.

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A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

7.9K 조회수.  McGill University. Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

연구

화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

생물학

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks of Parkinson's disease. Yet, much of its biological activity, as well as its aggregation, centrally involves the soluble monomer form of the protein. Elucidation of the molecular mechanisms of aSyn biology and pathophysiology requires structurally highly resolved methods and is sensitive to biological conditions. Its natively unfolded, meta-stable structures make monomeric aSyn intractable to many structural biology techniques. Here, the application of one such approach is described: hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry (HDX-MS) on the millisecond timescale for the study of proteins with low thermodynamic stability and weak protection factors, such as aSyn. At the millisecond timescale, HDX-MS data contain information on the solvent accessibility and hydrogen-bonded structure of aSyn, which are lost at longer labeling times, ultimately yielding structural resolution up to the amino acid level. Therefore, HDX-MS can provide information at high structural and temporal resolutions on conformational dynamics and thermodynamics, intra- and inter-molecular interactions, and the structural impact of mutations or alterations to environmental conditions. While broadly applicable, it is demonstrated how to acquire, analyze, and interpret millisecond HDX-MS measurements in monomeric aSyn.

The structural ensemble of monomeric alpha-synuclein affects its physiological function and physicochemical properties. The present protocol describes how to perform millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry and subsequent data analyses to determine conformational information on the monomer of this intrinsically disordered protein under physiological conditions.

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...