We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).

<ol>
	<li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes:+evolutionary+conservation+and+divergence.">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li><li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bam+machine:+A+molecular+cooper.">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li><li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex.">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li><li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria.">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li><li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins.">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li><li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+YaeT:+conformational+flexibility+and+substrate+recognition.">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine.">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li><li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher.">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li><li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate.">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li><li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL.">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li><li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins:+a+summary+of+recent+reports.">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li><li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TonB-dependent+transporters:+regulation,+structure,+and+function.">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li><li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+transferrin+bound+iron:+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae.">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li><li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae.">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li><li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway.">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li><li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+V+secretion:+mechanism(s)+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane.">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li><li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G., Engelman, E. H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comprehensive Biophysics. 5, 139-163 (2011).</li><li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia:+implications+for+protein+import.">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li><li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis.">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li><li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors.">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li><li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding.">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li><li>Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+integral+membrane+proteins.">Crystallization of integral membrane proteins.</a> Curr Prot in Prot Science. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).</li><li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method.">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> JoVE. , e3383 (2012).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , e4000 (2012).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , (2011).</li><li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+refolding+of+an+80-kDa+iron+transporter+from+the+outer+membrane+of+Escherichia+coli.">Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli.</a> Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).</li><li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-barrel+proteins+from+bacterial+outer+membranes:+structure,+function+and+refolding.">Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding.</a> Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).</li><li>Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+process+of+folding+proteins+into+membranes:+challenges+and+progress.">The process of folding proteins into membranes: challenges and progress.</a> Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).</li><li>Pautsch, A., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+outer+membrane+protein+A+transmembrane+domain.">Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain.</a> Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).</li><li>Cowan, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+OmpF+porin+in+a+tetragonal+crystal+form.">The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form.</a> Structure. 3, 1041-1050 (1995).</li><li>Ujwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+A+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> PNAS. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif.">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377 (2006).</li><li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not?.">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?.</a> BMC Genomics. 13, 510 (2012).</li><li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles.">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li><li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles.">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies.">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li><li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution.">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li><li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel.">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li><li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor.">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+(SONICC).">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

β-배럴 OMPs는 세균, 미토콘드리아와 엽록체 그람 음성에 필수적인 역할을 제공하고 이러한 각각의 세포 기관의 외부 막에 필수적인 분자 메커니즘에 대한 풍부한 정보를 제공하는 구조 분석을위한 중요한 표적이다. 그러나, 구조 분석을 위해 충분한 샘플을 제조 항상 간단하지 않으며, 따라서, 일반적인 파이프 상세히의 결정 구조의 처리를 설명하는 구조 결정을위한 타겟 β 배럴 OMPs 충분한 양의 생산을 위해 제공된다. 이러한 프로토콜 테스트 및 그람 음성 박테리아에서 가장 OMPs 작동하는 것으로 확인되었지만, 그 한계는 표현과 정제를위한 다른 방법이 필요할 수 있습니다 특히 미토콘드리아와 엽록체에 대한 몇 가지 목표는, 거기에있다. 따라서, 여기에 방법은 대부분의 그람 음성 박테리아에서 OMPs을 포함 프로젝트, 아직 발현 수준에 적용해야정제 된 시료의 양 및 대상 OMP에 따라 달라질 것이다. 구조 연구를위한 β-배럴 OMPs의 발현에 대한 두 가지 일반적인 방법이있다 (1) 직접 체외 폴딩에 대한 봉입체의 외막 (2) 식으로 생체 표현한다. 생체 내 표현 방식의 경우, β-배럴 OMPs는 E.의 외막을 대상으로 그들은 기본적으로 접혀 막에서 직접 분리되어 대장균. 대상이 제대로 접혀 될 가능성이 있기 때문에 막에 발현 선호하는 방법입니다. 이 방법은 일반적으로 전체 단백질의 낮은 수준을 얻을 수 있지만, 때로는 관내 폴딩과 관련된 합병증을 피할 수있다. 많은 β-배럴 OMPs이 성공적으로 구조 결정 4,5,11이 방법으로 표현되었다. 성공은 종종 T7 촉진에서 낮은 수준의 구성 적 발현에 의존하는 시스템을 사용하여 달성R, 유도에 의존하지만 다른 시스템 (즉, IPTG, 아라비 노스) 표현은 일상적으로 성공을 사용한다. 직접 외막에 발현 페리 플라 즘으로 초기 β 배럴 OMP 분비를 들면, 초 translocon에 리보솜 초기 사슬 복합체 지시 N- 말단 신호 서열을 갖는 표적 단백질을 필요로한다. 신호 서열은 내막의 세포질 측에서 절단되기 때문에, 이는 신호 서열은 모든 N 말단 태그가 대상에 추가 선행하는 것이 중요하다. 초기의 β-배럴 OMP는 다음 외막 2,3에 삽입을위한 BAM의 복잡한 페리 플라 즘을 통해 보호자 호위된다. 막으로 과발현 할 수없는 목표를 들어, 다른 방법은 체외은 28 ~ 30 리 폴딩에 대한 봉입체로 표현이다. 이러한 접근법은 전형적으로 높은 수준과 강력한 발현 O 초래표적 단백질 바. 폴딩은 비효율적 일 수 그러나, 조건 폴딩 식별하는 도전 일 수있다. 또한, 타겟은 베타 - 배럴 OMP 올바르게 접혀 때 분석하기 어려울 수있다. 그럼에도 불구하고 성공적으로하는 OmpA 31 AIL 19 OmpF (32), 및 VDAC (33)를 포함하는 구조 연구에 폴딩 된 단백질의 많은 사례가있다. (기본적으로 또는 봉입체에) 전혀 명시 적 또는 표현하지만 막 (기본적으로)로 제대로 조립되지 않는 클론의 경우, 하나는 더 밀접하게 E.의 유사하기 위해 β-배럴 돌연변이 시도 할 수 있습니다 대장균 (34, 35). 배럴 영역의 β 신호의 아미노산 서열은 크게 타겟 β 배럴 OMP 11,34 모두 적절한 생합성 및 발현 수준에 영향을 미칠 수있는 β 신호 시퀀스에서 BAM 착체 및 변형에 의한 인식 및 조립에 중요 35. 대상의 적절한 통합 β-바EL OMP는 열 개질 성 분석 하였다 막 분획 세제 추출율 스크리닝에 의해 모니터링 될 수있다. 세제 미셀의 존재 하에서 막 단백질의 결정화는 가장 오래된 기술이며, 기존의 가용성 단백질 결정화 장비 및 전략에 쉽게 적응을 허용한다. 멤브레인을 세제 분자 매립 영역을 마스킹함으로써, 단백질 (예를 들면, 결정화 모액과 혼합 단백질 강하 저속 탈수시키는 수증기 확산 장치로 묶인) 가용성 단백질과 유사한 방식으로 처리 될 수있는 농축시켰다. 개념 간단하지만, 세제의 특성과 속성은 정상 결정화 도전의 상단에 복잡성의 중요한 레이어를 추가합니다. 구체적으로는, 세제의 분자 특성을 실험적으로 미셀의 크기, 헤드 그룹 극성 (음이온 성, 양이온 성, 비이 온성 또는 포함 주어진 타겟 단백질에 맞추어야양쪽이 온성), 탄화수소 쇄 길이, 이들 각각은 용액 중의 표적 세포막 단백질의 안정성에 영향을 미칠있다. 이 방법의 단점은 비원 화학적 환경 결정 주소록, 세제 농도 문제를 형성 할 수면 영역 어둡게 전위를 포함한다. Bicelles 셀 (36, 37)에있는 세포막과 유사한 이중 막 구조를 모방 개별 입자로 조립하고 양친 지질 (예를 들어, 세제 또는 단쇄 지질)의 혼합물이다. 친 양쪽 성체 마스크는 세제 결정화 미셀과 유사한 방식으로 가장자리에서 노출이 이중층의 소수성 코어. 이것은 표적 단백질을 안정화하는보다 천연 형 환경을 제공한다. 세포막 단백질 표적은 지질 입방 상 (LCP)의 방법 (38)을 결정화 할 수있다. 이 LCP의 지질과 물의 혼합에 의해 형성된 중간상 인연속 이중층 용매 채널 개의 교차하지 않는 네트워크에 의해 투과된다. 이 입체 구조는 주로 천연 형 환경에서 지질 임베디드 막 단백질의 확산을 허용하고 결정 접점이 단백질의 소수성 및 친수성 ​​표면 사이에 형성 할 수 있으며, 그 순서를 강화하면서 결정의 전체 용매 함량을 감소시킨다. 1990 년대에 소개 된 이후로, LCP 기술들은 39, 40 및 41-43의 GPCR을 rhodopsins 같은 많은 어려운 막 단백질 표적의 구조를 결정하는 중요한왔다. 높은 처리량 스크린의 LCP의 사용은 기존의 나노 리터의 액체를 취급하여 처리 할 수없는 통상 LCP 사용 두꺼운 모노 올레 인과 같은 특별한 규정 (즉, LCP 특정 로봇 기밀 주사기 LCP 분배 도구 샌드위치 결정화 플레이트 등)가 필요 로봇. 겔 여과 크로마토 그래피는 매우 중요한 단계이며일반적으로 막 단백질의 결정화는 선택된 세제를 안정화하는 크로마토 그램에 의해 가시화 될 수있는 세포막 단백질의 표적에 대한 방법에 관한 정보를 얻을 수 있기 때문이다. 공극 부피, 체류 시간과 피크의 모양 시료의 양을 비교함으로써 시료의 전체적인 안정성과 단 분산에 액세스 할 수있다. 이상적인 샘플 공극 부피 손실없이 샘플 거의해야 가우시안 분포를 갖는 하나의 대칭 용출 피크를 가질 것이다. 세제 C 8 E 4 (0.8 %), OG (1.0 %), 및 LDAO (0.05 %)을 정기적으로 성공 β-배럴 OMPs의 결정화에 사용하고 시작하는 좋은 것들된다. 이상적으로, 작은 규모의 실험은 결정화에 가장 적합한 결정하는 세제의 여러 세제 또는 이들의 혼합물을 비교하여 수행됩니다. 발견 자들은 대부분 다음 대상 β-BA의 대규모 준비에 사용되는 안정화 될 수 있습니다rrel의 OMP 및 결정화 실험합니다. 결정이 대상 β-배럴 OMP, 납 최적화 형성되면 (즉, 첨가제 선별, 극저온 심사, 세제 첨가제 검사 등) 및 수용성 단백질 표적과 유사한 다른 기술은 약간의 차이로 따라 할 수 있습니다. 그러나, 막 단백질로 작업 할 때 매우 유용하다 최근의 발전이있다. 특히, 세포막 단백질의 결정은 종종 다양한 이유들이 모액 내에 검출 어려울 수있다. 막 단백질은 종종 상대적으로 작은 결정을 형성하고 오탐 (false positive) 크리스탈 최적화를 잘못 안내 할 수 있습니다. LCP의 특히 본 기술의 추가 과제는, 결정이 성장되는 고점도 종종 불투명 환경 주어진. 전략은 이러한 문제 자연스럽게 형광 단백질의 결정 (F)을 구별 할 수 있도록, 광 현미경과 함께 자외선 현미경 (UV)의 사용을 포함하는 어드레스롬 비 형광 소금과 세제 결정 (그림 7). 도전은 침전제의 필드 내에서 형성 단백질 결정의 긍정적 인 인식에서, 그러나 남아있다. 펨토초 레이저 주사 펄스에 의해 촬상 할 때 SONICC 기술 (44)에 의해 구현되는 결정은 대부분 키랄 액정의 주파수 배가 효과 악용함으로써 검출 될 수있다. 이 높은 해상도가 높은 콘트라스트 기술은 불명료하게하는 조건에서 초 미세 결정을 구별하는데 사용될 수있다. 수확 막 단백질은 특히 세제 bicelle 결정화를위한 표준 결정학 기술을 사용하여 수행된다. 루핑은 저배율 현미경 및 결정 장착 고리 (예, 나일론 섬유, 와이어, 또는 중합체)을 사용하여 수동으로 수행된다. 과량의 용매 및 냉동 보호의 심지 전의 β-배럴 OMP 결정을 수확 할 때 또한 극저온 액체에 표준 절차를하는 동결 급락합니다. 그러나 수확LCP 성장 결정의 ING는 결정이 접근하기 어려울 수 있기 때문에, 샌드위치 플레이트에서 직접 수확하고 쉽게 현미경을 통해 관찰 할 수 없습니다 특히, 특정 문제를 제공합니다. LCP의 혼합물을 용이하게 루프 내에서 분리 될 수 없기 때문이다 또한, LCP 성장 결정 때때로 대량 수확한다. β-배럴 OMPs에 대한 데이터 수집은 몇 가지 추가 고려 사항 가용성 단백질의 결정과 같이 수행 할 수 있습니다. 세제 bicelle 방법에 의해 성장 된 결정의 크기는 주로 수용성 단백질로 성장 된 것과 비교 가능한 반면, LCP 방법에 의해 결정 성장은 거의 항상 매우 작다. 샘플 LCP 행렬에서 수확 때문에 또한 종종 하나 diffra 기반으로 체계적으로 결정의 위치를​​ 찾기 위해 전체 루프를 스캔 할 수있는 소형 빔 루프 래스터 화 기능이 싱크로트론 소스를 활용해야 관찰하기 어려운 다수의 결정을 포함ction (그림 7). LCP 결정의 작은 크기는 방사선 손상에 특히 취약한다. 따라서 여러 결정에서 데이터는 종종 완전한 데이터 세트를 수집하기 위해 병합됩니다. 일단 잘 회절 결정이 수득되고 전체 데이터 세트를 수집하고, β 배럴 OMPs위한 구조 결정이 세포막 단백질 결정은 일반적으로 높은 용매 함량을 나타내는 것을 유념 가용성 단백질과 동일한 방법을 사용하여 달성 될 수있다. 모든 결정학 대상과 마찬가지로, 수용성 단백질이나 세포막 단백질 여부, 각각 자신의 도전을 제공하며, 그 이유 단일 파이프 라인은 직접 모든 대상에 적용 할 수 없습니다. 따라서, 그 / 그녀의 프로젝트의 성공을 보장하기 따라서 이러한 일반적인 프로토콜을 맞추는 차 연구원 (들)의 역할이다.

β-배럴 OMPs은 미토콘드리아, 엽록체의 외부 세포막에서 발견, 및 그람 음성 박테리아 1-3 될 수있다. 그들은 α 나선 단백질와 유사한 역할을 제공하지만, 이들은 각 가닥은 속속들이 이웃하는 두 가닥에 연결되면서 8-26 역 평행 β 가닥 범위의 중앙 막 매립 β 배럴 도메인으로 구성된 매우 다른 스크롤을 (도 1 및도 2). β 배럴 영역의 처음과 마지막 스트랜드는 닫고 주위 막에서 β 배럴 영역을 밀봉한다 (미토콘드리아 VDAC 제외)를 역 평행 형태로 거의 독점적으로 서로 상호 작용한다. 모든 β 배럴 OMPs 이러한 루프 때때로 Neisserial의 트랜스페린 검색된 프로 바인딩 75 잔기로 대형 인 상태 리간드의 상호 작용 및 / 또는 단백질 - 단백질 연락처에 중요한 역할을하는 다양한 서열 및 길이의 세포 외 루프가TEIN A (TbpA) 4. β-배럴 OMPs 또한 단백질의 기능적인 목적으로 도메인을 추가로 제공 N- 말단 또는 C- 말단 주변 세포질 확장 할 수 있습니다 (예를 들어, 아저씨 5-7, FadL (10) 8,9, FimD). β-배럴 OMPs 많은 종류의 11 존재하지만,보다 일반적인 유형의 두 분야 (1) TonB 종속 운송 (2) autotransporters 덜 익숙한 사람들을 위해 예로서 아래에 설명되어 있습니다. TonB 종속 전송기 (예를 들면, FEPA, TbpA, BtuB, CIR, 등) 영양 오기 필수적이며, A는 C 말단 β- 22 가닥 안에 꿰매 발견 ~ 150 개의 잔기로 구성된 N - 말단 플러그 도메인을 포함 배럴 도메인 외막 (12) (도 3)에 매립. 이 플러그 도메인 자유롭게 배럴 영역을 통과 기질을 방지하는 동안, 기판은 결합 플러그 내의 도메인 번째 형태 변화를 유도리드에서 (플러그 재 배열하거나 플러그의 부분 / 전체 배출에 의해 하나)를 페리 플라 즘으로 외부 막에 걸쳐 기판 운반을 용이하게 할 수있다 형성 기공합니다. TonB 종속 전송기는 이러한 인간 숙주 단백질 4,13,14에서 직접 철 같은 영양소를 납치 전문 운송을 진화 나이 세리아 뇌수막염으로 그람 음성 박테리아의 일부 병원성 균주의 생존에 특히 중요하다. Autotransporters는에서 분비 또는 제시 중 하나 β-배럴 도메인 (ESTA와 ESPP와 같이 일반적으로 12 가닥)으로 구성 β-배럴 OMPs와 승객 도메인을 그람 음성 세균의 type V 분비 시스템에 속하고 있습니다 셀 (15, 16) (그림 3)의 표면. 이 β-배럴 OMPs는 종종 역할을하는 승객 도메인과 세포 생존 및 독성에 중요한 역할을 역할 중 하나 프로테아제, 어드, 및 / 또는 기타 EF 등fector 그 발병 기전을 매개. 이러한 X 선 결정학, NMR 분광법, 및 전자 현미경 (EM) 우리 차례가 외막에서 작동 정확히 해독하는데 사용할 수있는 원 해상도의 OMPs위한 모델을 결정하도록 허용하는 구성 방법. 이것은 귀중한 정보는 해당되는 경우 약물 및 백신 개발을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 트랜스페린 결합 단백질 A (TbpA)은 나이 세리아의 표면 상에 발견하고 직접 인간 트랜스페린 결합하고 추출 자체 생존 철 수입 때문에 발병 요구된다. TbpA없이, 나이 세리아 인간 호스트로부터 철을 청소할 수 없으며 비병원성 렌더링된다. TbpA 4에 결합 인간 트랜스페린의 결정 구조를 해결 한 후, 두 단백질이 관련된 얼마나 명확하게되었다 TbpA 어떤 영역의 상호 작용을 매개, TbpA 의해 철 추출 중요한 있었는지 잔기 및어떻게 하나 TbpA을 대상으로 나이 세리아에 대한 치료제를 개발하고 있습니다. 따라서, 생존 병인 그람 음성균에 β 배럴 OMPs의 중요성을 고려할뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 기능 및 추가 구조 막 단백질의 독특한 클래스에 대한 정보가 작동하는 시스템에 대한 필요 일반적으로 프로토콜은 표현 및 구조 방법에 의해 특성화에 대한 높은 수준의 목표 OMPs 정화의 전반적인 목표되게됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="804">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:175px;">Crystallization Robot</td>
			<td style="width:159px;">TTP Labtech, Art Robbins</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;">Any should work here, except for LCP crystallization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">PCR thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf, BioRad</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:175px;">Media Shaker</td>
			<td style="width:159px;">New Brunswick, Infors HT</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">UV-vis spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">SDS-PAGE apparatus</td>
			<td style="width:159px;">BioRad</td>
			<td style="width:227px;">1645050, 1658005</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">SDS-PAGE and native gels</td>
			<td style="width:159px;">BioRad, Life Technologies</td>
			<td style="width:227px;">4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">AkTA Prime</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">AkTA Purifier</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Centrifuge (low-medium speed)</td>
			<td style="width:159px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Ultracentrifuge (high speed)</td>
			<td style="width:159px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">SS34 rotor</td>
			<td style="width:159px;">Sorvall</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td style="width:159px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Type 70 Ti rotor</td>
			<td style="width:159px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:227px;">06 435C</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Emulsiflex</td>
			<td style="width:159px;">Avestin</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">D9652</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">LCP tools</td>
			<td style="width:159px;">Hamilton, TTP Labtech</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">VDX 24 well plates</td>
			<td style="width:159px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:227px;">HR3-172</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:175px;">Sandwich plates</td>
			<td style="width:159px;">Hampton Research, Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:227px;">HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Grace Crystallization sheets</td>
			<td style="width:159px;">Grace Bio-Labs</td>
			<td style="width:227px;">875238</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">HiPrep S300 HR column</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:227px;">17-1167-01</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Q-Sepharose column</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:227px;">17-0510-01</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:175px;">Crystallization screens</td>
			<td style="width:159px;">Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Gas-tight syringe (100 mL)</td>
			<td style="width:159px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:227px;">????</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from constructs to crystals &#8211; towards structure determination of &#946;-barrel outer membrane proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

YiuR는 예 르시 니아 페스티에 대해 추정 백신 대상인 TonB 종속 철 수송한다. 원래는 마이크로 어레이 분석을 사용하여 확인 하였다. 여기서, X 선 결정학을 이용 YiuR의 구조를 결정하기 위해 수행 된 단계 (도 9)를 설명한다. 클로닝, YiuR의 DNA 서열 (마이너스 N 말단 신호 서열) PCR은 게놈 DNA의 증폭 및 TEV 단백질 분해 효소 사이트 다음에 N 말단 pelB 신호 서열 및 10 배 - 히스티딘 친 화성 태그를 함유하는 벡터에 서브 클로닝. 표현의 경우, YiuR 포함하는 플라스미드 ~ 0.5 (600) 중독에 BL21 (DE3) 유능한 세포와 5 ml의 스타터 문화를 성장하는 데 사용되는 하나의 식민지로 변신했다. TB 배지 750 ml를 함유 십이 플라스크는 스타터 배양액 1mL를 접종하고 (220 rpm에서 진탕) 20 ºC에서 3 일 동안 성장시켰다. 세포를이어서 약 150-200 생산 수확플래시이었다 총 세포 페이스트의 g는 액체 질소에 냉각 사용할 때까지 -80 ºC에서 보관. YiuR 정화용 세포 20 g의 (1.8 mM의 KH 2 PO 4, 2.7 mM의 KCl을 137 mM의 염화나트륨, pH 7.4의 10 mM의 나트륨 2 HPO 4)의 DNase I로 RT에서 교반 1X PBS 120 ㎖에 재현 탁 및 AEBSF가 추가된다. 용해 균질화 통해 두 과정으로 수행 하였다. 해물은 10 분 동안 12,000 XG에서 (끊어지지 세포와 봉입체를 스핀 다운) 원심 분리 하였다. 상등액을 막 분획 (YiuR)를 포함하는 펠릿과 함께 60 분간 235,000 × g으로 다시 원심 분리 하였다. 멤브레인은 다운스 균질기를 사용하여 1X PBS 100 ㎖에 재현 탁 하였다. YiuR 4 ºC에서 (16 시간까지) 밤새 교반, 5 %의 최종 농도 Elugent를 사용하여 막으로부터 추출 / 가용화이었다. 가용화 막은 다음의 SU로, 60 분간 371,000 × g으로 다시 원심 분리YiuR 포함하는 가용성 분획을 포함 pernatant. YiuR를 분리하기 위해, IMAC는 버퍼 A (1X PBS, 0.1 % DDM) 및 30-50 mM 내지 다졸 농도로 세척하고, 250 ~ 500 mm의 용출 완충액 B (1X PBS, 1 M 이미 다졸, 0.1 % DDM)를 사용하여 수행 하였다 . N- 말단 10 배 - 히스티딘 태그를 제거하려면, TEV와 배양은 HIS 단백질 분해 효소는 1X PBS 버퍼에 투석 중 4 ºC에서 하룻밤을 실시 하였다. 샘플은 농축 투석 통해 다시 IMAC 컬럼을 통해 흐름을 통과 한 다음에 50 mM Tris-HCl, pH 7.5의 이온 교환 컬럼에 0 ~ 1.0 M의 NaCl 구배를 사용하여 추가로 분리 하였다. YiuR을 함유하는 분획을 농축 한 다음, 모아서 25 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 200 mM의 염화나트륨 및 0.05 % LDAO를 이용한 겔 여과 컬럼상에서 실행 하였다. YiuR을 함유하는 분획은 풀링 결정화 10 ㎎ / ㎖로 농축시켰다. 넓은 매트릭스 검사는 수행 된 조건 결정그 몇 가지 초기 회절 결정을 생산했다. 또한 최적화는 고유 X 선 회절 데이터를 수집 하였다 큰 결정되었다. 도 8에 도시 한 결정을 여기에 제시된 방법을 사용하여 얻을 수 결정의 대표이다. 세제 스크리닝 bicelles의 결정은 통상적 수용성 단백질 얻어진 결정만큼 클 수있다; 그러나, LCP에서 사람들은 거의 항상 훨씬 작다. 데이터는 충분 2.65 Å 해상도 결정을 구성하는 분자 주도 교체 사용했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig1.jpg" /> 그림 1. 완벽하게 통합 된 막 단백질의 두 가지 유형의 α 나선과 β-배럴이다. β2 아드레날린 수용체 (PDB 코드 2RH1, α 나선) 및 TonB 종속 수송 BtuB (PDB 코드 1NQE 각각의 예는 여기에 도시 된 바와 같이,β-배럴). 맨 아래 행이 막보기를 표시하면서 상단 행이 세포 외보기를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig2.jpg" /> 그림 2. β-배럴 OMPs는 다양한 기능을 제공하고 다양한 구조를 가질 수있다. α 나선 막 단백질은 하나 이상의 경막 도메인을 포함 할 수 있지만, β 배럴 OMPs는 8-26 가닥에서부터 각 가닥은 밀접한 인접 가닥과 상호 작용한다. 용매와 상호 작용하는 내부 잔기, 일반적으로 극성 친수성 ​​동안 막과 상호 작용하는 외부 잔기는 일반적으로 소수성이다. 상위 행 외을 도시 중간 행은 멤브레인을 도시하고, 바닥 행은 periplasmi를 도시C보기. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig3.jpg" /> 일반적인 β-배럴 OMPs의 두 가지 유형 3. 예를 그림. 왼쪽의 TonB 종속 수송 FEPA (PDB 코드 1FEP)의 구조, 세포 외 (위) 묘사, 막 (가운데) 및 주변 세포질 (아래)보기. 플러그 도메인 마젠타되는 동안 β 배럴 영역이 녹색으로 표시된다. 마우스 오른쪽 단추로, 상기 autotransporter ESTA (PDB 코드 3KVN)의 구조, 세포 외 (위) 묘사, 막 (가운데) 및 주변 세포질 (아래)보기. 승객 도메인이 파란색으로있는 동안 β-배럴 도메인은 금에 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의에. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig4.jpg" /> 도식 β-배럴 OMPs의 생산을위한 복제 및 표현 파이프 라인의 그림 4. 복제 및 (왼쪽) 중 하나를 기본 멤브레인 식으로 목표 OMP를 표현하는 데 사용되는 파이프 라인의 도식 또는 (오른쪽) 폴딩에 대한 봉입체로 발현에 의해. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig4large.jpg" target="_blank">하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig5.jpg" /> 그림 β-배럴 OMPs의 분리를위한 정화 파이프 라인의 5 도식. 옴 직접 표현 된 OMPs의 추출에 사용되는 파이프 라인의 도식. 여기서, 타겟 추출 OMP이어야적절한 세제 용해에 의해 막에서 에드 다음 IMAC에 의해 정제, 이온 교환 크로마토 그래피, 겔 여과. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig6.jpg" /> β-배럴 OMPs의 결정을 성장 결정화 파이프 라인의 그림 6. 회로도. 세 가지 방법은 β-배럴 OMPs의 결정화를 위해 이용 될 수있다 세제 심사, bicelles 및 지질 입방 단계 (LCP) 포함. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig7.jpg" /&gt; 그림 크게 β-배럴 OMPs의 결정 구조에 기여 결정학 7. 새로운 도구. 예를 들면, 결정화 로봇 / LCP 로봇 (A), UV 현미경 (B) 키랄 크리스탈 이차 비선형 영상 (SONICC) 시각화 (C), 로봇 퍽 / 로봇 (D), 래스터 화 / 벡터 / 헬리컬 데이터 수집 방법 (E 포함 ) 및 마이크로 포커스 빔 (F). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig8.jpg" /> 프로토콜로부터 생성 된 결정도 8은 대표적인 이미지. 세제 스크리닝 bicelles에서 결정을 결정만큼 클 수있다일반적으로 수용성 단백질을 얻을; 그러나, LCP에서 사람들은 거의 항상 훨씬 작다. 스케일 바 = 100 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig9.jpg" /> 의 결정 구조에서 그림 9는, 표현, 정화, 복제로 이동하는 단계를 설명, 페스트 균. YiuR의 구조 결정에 사용되는 전체 파이프 라인에서 추정 백신 대상 YiuR에 대한 결정 구조 결정화 및 구조를 해결하기 위해. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig9large.jpg" target="_blank">를 클릭하십시오 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a>

Watch this Scientific Journal Video about From Constructs to Crystals Ã¢â‚¬â€œ Towards Structure Determination of ÃŽÂ²-barrel Outer Membrane Proteins at JoVE.com

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

from-constructs-to-crystals-towards-structure-determination-barrel

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Chemistry

Cellular Processes

Cell Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

13.4K 조회수.  Purdue University. β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

비디오: From Constructs to Crystals – Towards Structure Determination of β-barrel Outer Membrane Proteins

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue located at or near the N-terminus of a helix is often more acidic than that at or near the C-terminus 1-6. Although extensive experimental studies on the acid-base properties of peptides have been carried out in the condensed phase, in particular in aqueous solutions 6-8, the results are often complicated by solvent effects 7. In fact, most of the active sites in proteins are located near the interior region where solvent effects have been minimized 9,10. In order to understand intrinsic acid-base properties of peptides and proteins, it is important to perform the studies in a solvent-free environment.
We present a method to measure the acidities of oligopeptides in the gas-phase. We use a cysteine-containing oligopeptide, Ala3CysNH2 (A3CH), as the model compound. The measurements are based on the well-established extended Cooks kinetic method (Figure 1) 11-16. The experiments are carried out using a triple-quadrupole mass spectrometer interfaced with an electrospray ionization (ESI) ion source (Figure 2). For each peptide sample, several reference acids are selected. The reference acids are structurally similar organic compounds with known gas-phase acidities. A solution of the mixture of the peptide and a reference acid is introduced into the mass spectrometer, and a gas-phase proton-bound anionic cluster of peptide-reference acid is formed. The proton-bound cluster is mass isolated and subsequently fragmented via collision-induced dissociation (CID) experiments. The resulting fragment ion abundances are analyzed using a relationship between the acidities and the cluster ion dissociation kinetics. The gas-phase acidity of the peptide is then obtained by linear regression of the thermo-kinetic plots 17,18.
The method can be applied to a variety of molecular systems, including organic compounds, amino acids and their derivatives, oligonucleotides, and oligopeptides. By comparing the gas-phase acidities measured experimentally with those values calculated for different conformers, conformational effects on the acidities can be evaluated.

The determination of the gas-phase acidities of cysteine-containing oligopeptides is described. The experiments are performed using a triple quadrupole mass spectrometer. The relative acidities of the peptides are measured using collision-induced dissociation experiments, and the quantitative acidities are determined using the extended Cooks kinetic method.

올리고 펩타이드의 가스 단계 산성도의 결정

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

연구

화학

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Towards Biomimicking Wood: Fabricated Free-standing Films of Nanocellulose, Lignin, and a Synthetic Polycation

Woody materials are comprised of plant cell walls that contain a layered secondary cell wall composed of structural polymers of polysaccharides and lignin. Layer-by-layer (LbL) assembly process which relies on the assembly of oppositely charged molecules from aqueous solutions was used to build a freestanding composite film of isolated wood polymers of lignin and oxidized nanofibril cellulose (NFC). To facilitate the assembly of these negatively charged polymers, a positively charged polyelectrolyte, poly(diallyldimethylammomium chloride) (PDDA), was used as a linking layer to create this simplified model cell wall. The layered adsorption process was studied quantitatively using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and ellipsometry. The results showed that layer mass/thickness per adsorbed layer increased as a function of total number of layers. The surface coverage of the adsorbed layers was studied with atomic force microscopy (AFM). Complete coverage of the surface with lignin in all the deposition cycles was found for the system, however, surface coverage by NFC increased with the number of layers. The adsorption process was carried out for 250 cycles (500 bilayers) on a cellulose acetate (CA) substrate. Transparent free-standing LBL assembled nanocomposite films were obtained when the CA substrate was later dissolved in acetone. Scanning electron microscopy (SEM) of the fractured cross-sections showed a lamellar structure, and the thickness per adsorption cycle (PDDA-Lignin-PDDA-NC) was estimated to be 17 nm for two different lignin types used in the study. The data indicates a film with highly controlled architecture where nanocellulose and lignin are spatially deposited on the nanoscale (a polymer-polymer nanocomposites), similar to what is observed in the native cell wall.

The objective of this research was to form synthetic plant cell wall tissue using layer-by-layer assembly of nanocellulose fibrils and isolated lignin assembled from dilute aqueous suspensions.&#160; Surface measurement techniques of quartz crystal microbalance and atomic force microscopy were used to monitor the formation of the polymer-polymer nanocomposite material.

Nanocellulose, 리그닌의 날조 된 자립형 필름, 및 합성 폴리 양이온 : Biomimicking 나무를 향하여

Woody materials are comprised of plant cell walls that contain a layered secondary cell wall composed of structural polymers of polysaccharides and ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

합성 및 디스코 틱 지르코늄 인산염의 각질 제거는 콜로이드 액체 크리스탈을 구하는

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

보존 과학의 X 선 분말 회절 : 문화 예술에 부식 제품의 일상적인 결정 구조 결정을 향해

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While metal-based nanoparticles are associated with synthetic and environmental hassles, cellulose introduces a green, sustainable alternative for nanoparticle synthesis. Here, we present the chemical synthesis and separation procedures to produce new classes of hairy nanoparticles (bearing both amorphous and crystalline regions) and biopolymers based on wood fibers. Through periodate oxidation of soft wood pulp, the glucose ring of cellulose is opened at the C2-C3 bond to form 2,3-dialdehyde groups. Further heating of the partially oxidized fibers (e.g., T = 80 &#176;C) results in three products, namely fibrous oxidized cellulose, sterically stabilized nanocrystalline cellulose (SNCC), and dissolved dialdehyde modified cellulose (DAMC), which are well separated by intermittent centrifugation and co-solvent addition. The partially oxidized fibers (without heating) were used as a highly reactive intermediate to react with chlorite for converting almost all aldehyde to carboxyl groups. Co-solvent precipitation and centrifugation resulted in electrosterically stabilized nanocrystalline cellulose (ENCC) and dicarboxylated cellulose (DCC). The aldehyde content of SNCC and consequently surface charge of ENCC (carboxyl content) were precisely controlled by controlling the periodate oxidation reaction time, resulting in highly stable nanoparticles bearing more than 7 mmol functional groups per gram of nanoparticles (e.g., as compared to conventional NCC bearing &#60;&#60; 1 mmol functional group/g). Atomic force microscopy (AFM), transmission electron microscopy (TEM), and scanning electron microscopy (SEM) attested to the rod-like morphology. Conductometric titration, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance (NMR), dynamic light scattering (DLS), electrokinetic-sonic-amplitude (ESA) and acoustic attenuation spectroscopy shed light on the superior properties of these nanomaterials.

Synthesis schemes to prepare highly stable wood fiber-based hairy nanoparticles and functional cellulose-based biopolymers have been detailed.

매우 안정, 기능 털이 나노 입자와 목재 섬유에서 생체 고분자 : 지속 가능한 나노 기술쪽으로

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid crystals (ILCs). Taking advantages of the high specificity of XB for haloperfluorocarbons and the ability of anions to act as XB-acceptors, we obtained supramolecular complexes based on 1-alkyl-3-methylimidazolium iodides and iodoperfluorocarbons, overcoming the well-known immiscibility between hydrocarbons (HCs) and perfluorocarbons (PFCs). The high directionality of the XB combined with the fluorophobic effect, allowed us to obtain enantiotropic liquid crystals where a rigid, non-aromatic, XB supramolecular anion acts as mesogenic core.
X-ray structure analysis of the complex between 1-ethyl-3-methylimidazolium iodide and iodoperfluorooctane showed the presence of a layered structure, which is a manifestation of the well-known tendency to segregation of perfluoroalkyl chains. This is consistent with the observation of smectic mesophases. Moreover, all the reported complexes melt below 100 &#176;C, and most are mesomorphic even at room temperature, despite that the starting materials were non-mesomorphic in nature.
The supramolecular strategy reported here provides new design principles for mesogen design allowing a totally new class of functional materials.

A protocol for the synthesis of a new type of mesogens, based on the halogen-bonded supramolecular anion [CnF2n+1-I&#183;&#183;&#183;I&#183;&#183;&#183;I-CnF2n+1]&#8722;, is reported.

분자 재료를에서: 할로겐 결합을 통해 새로운 이오니아 액체 크리스탈 엔지니어링

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Photoresponsive 액정의 구조 역학을 관찰을 위한 새로운 기술

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...