크로마틴 도메인의 동적 형성을 평가하는 시스템을 간략하게 설명합니다. 우리는 이 시스템을 활용하여 세포내 중화크로마틴 도메인의 모집과 확산을 따릅니다. 프로세스는 언제든지 일시 중지하여 진행 중인 이벤트를 분석할 수 있습니다.
이 시스템은 주어진 셀룰러 프로세스의 동적 변화를 모니터링하도록 준비될 수 있으므로 크로마틴 도메인 형성을 추적하는 데 국한되지 않습니다. 먼저 CRISPR 디자인 도구를 사용하여 마우스 배아 줄기 세포에서 배아 자궁 발달 또는 EED의 내인성 사본의 엑슨 10 및 11을 삭제하도록 가이드 RNA를 설계하여 시작합니다. 원고 의 지시에 따라 가이드 RNA를 CRISPR / Cas9 플라스미드로 복제합니다.
6웰 플레이트 포맷에서, transfect 200, 000 마우스 배아 줄기 세포, 또는 mESC, 제조 업체의 지침에 따라 트랜스 페이션 시약을 사용하여 각 가이드 RNA의 하나의 마이크로 그램. 변환 후 24시간 후에 미디어를 변경합니다. 전환 후 이틀 후 FACS를 사용하여 GFP 양성 세포를 분리합니다.
경질 효율은 약 10~30%까지 다양하므로 약 500, 000개의 세포를 정렬하여 도금에 충분한 GFP 양성 세포를 포획합니다. 격리된 GFP 양성 세포를 콜로니 따기용 0.1%젤라틴으로 미리 코팅된 15센티미터 플레이트로 플레이트합니다. 단일 식민지가 보일 때까지 ESC 배지에서 세포를 약 1주일 동안 성장시켜 2일마다 미디어를 변경합니다.
20 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 최소 48개의 콜로니를 선택하여 식민지를 긁어내고 심기동안 긁어냅니다. 식민지를 단일 세포로 분해하지 않고, 아쿠타아제 함유 96웰 플레이트로 옮긴다. 식민지를 섭씨 37도에서 10분간 배양하여 세포를 분리합니다.
그런 다음 멀티 채널 파이펫으로 각 웰에 200 마이크로 리터의 ESC 미디어를 추가합니다. 잘 섞어서 세포를 두 개의 분리된 96웰 플레이트로 플레이트합니다. 지노티핑을 위해 플레이트 중 하나를 사용하고, 지피가 끝날 때까지 다른 플레이트를 계속 성장시다.
상용 시약을 사용하고 제조업체의 지시를 따르는 플레이트에서 DNA를 추출합니다. 삭제된 부위에 걸쳐 있는 지노티핑 프라이머를 사용하여 Taq DNA 폴리머라제로 지평PCR을 수행합니다. 야생 형 세포에 비해 균질 제거를 가진 세포에서 낮은 분자량의 DNA 생성물을 관찰하십시오.
디자인 가이드 RNA는 CRISPR 디자인 도구를 사용하여 EED의 엑손 9다음 인트론 내에서 컷을 도입하고 원고 의 방향에 따라 CRISPR / Cas9 플라스미드로 복제합니다. 내인성 유전자 서열에 대하여 모두 역방향으로, 엑슨 9 후 EED cDNA 서열을 포함하는 기증자 템플릿 DNA를 설계하고, T2A-GFP 서열의 C-말단 플래그-HA 태그 상류로, 모두 역방향으로 설계한다. 스플라이스 수용체와 이종 반전 된 loxP 사이트 사이에 중첩 된 폴리 아데닐레이션 서열로 카세트를 측면으로 하고 각 끝에서 적어도 500 개의 기본 쌍을 포함합니다.
기증자 템플릿을 gBlocks 유전자 조각의 두 세그먼트로 분할하고 제조업체의 지시에 따라 깁슨 복제를 사용하여 PCR Blunt 벡터로 조립합니다. 6웰 플레이트 포맷으로, 가이드 RNA의 마이크로그램 1개와 기증자 템플릿의 1마이크로그램을 가진 transfect 200, 000 mESC. 그런 다음 FACS를 사용하여 GFP 양성 세포를 격리합니다.
원고 의 지시에 따라 지평을 위해 개별 식민지를 분리합니다. 혈류 세포측정을 사용하여 mESC가 GFP의 새는 발현이 없는지 확인하고, 그렇게 하는 경우 실험을 시작하기 전에 FACS에 의한 GFP-음수 세포를 분리한다. 세포를 5개의 15센티미터 플레이트로 확장하고, 0시간에서 8일까지 5개의 다른 시간 동안 5-마이크로몰러 4-하이드록시타목시펜을 투여하여 야생형 또는 케이지 돌연변이 EED의 발현을 유도한다.
그 보다 더 오래 지속 하는 치료에 대 한 12 시간 후 미디어를 변경 합니다. GFP를 사용하여 FACS에 의해 성공적으로 재결합된 세포를 분리하고, H3K27me2 및 H3K27me3에 대한 ChIP-seq를 수행하여 야생형 또는 케이지 돌연변이 EED의 재발현에 대응하여 크로마틴에 대한 현세적 증착을 조사한다. 유도할 수 없는 야생식 구조 및 유도 돌연변이 구조 시스템의 유효성을 검사하기 위해, 웨스턴 블롯은 4-하이드록시타목시펜 처리로 야생형 또는 케이지 돌연변이 EED를 유도한 후 전체 추출물에 수행되었다.
유동 세포측정 분석은 4-하이드록시타목시펜 처리 전후i-WT-r 세포에서 T2A-GFP 발현의 효율을 확인하기 위해 사용되었으며, 이는 반전된 카세트의 성공적인 플립을 보여 준다. H3K27me3의 ChIP-seq는 야생형 또는 케이지 돌연변이 EED의 재발식 후에 수행되었다. H3K27me3의 출현은 이산 핵형성 부위에서 야생형 EED 발현 후 12시간 후에 관찰된 다음 초기 핵형성 부위로부터 먼 지역에서 24시간 후에 관찰된다.
ChIP-seq는 또한 H3K27me3 증착앞에 나타나는 H3K27me2의 시간적 증착을 추적하는 데 사용되었다. H3K27me3 포시와 그 성장은 또한 형광 현미경검사법으로 시각화되었습니다. 야생형 EED 발현의 12시간 후에, H3K27me3 포시 형성의 증거가 있다.
이러한 foci수와 크기가 24시간 증가하고 결국 36시간 동안 핵의 큰 영역으로 확산됩니다. DNA 구조의 정확한 설계는 원하는 유도 구조 시스템을 생성하는 것이 매우 중요합니다. 이 방법은 마우스에 있는 단백질의 돌연변이의 시간 적이고 특별한 통제를 제공할 수 있습니다.
이런 식으로, 하나는 특정 조직 또는 개발의 특정 단계에서 돌연변이의 효력을 결정할 수 있었습니다. 우리는 현재 다른 크로마틴 도메인, 폴리 콤 억압 복합 체형 의 동적 설립을 모니터링하기 위해이 시스템을 사용하고 있습니다.
