RNA 면역침전은 시퀀싱, 또는 RIPiT-Seq에 선행된 탠덤의 RNA 면역침전은, RNA의 특정 한 쌍의 RNA 결합 단백질에 의해 결합되는 RNA의 어떤 지구를 확인하는 방법이다. RIPiT의 가장 독특한 장점은 두 가지 정제에서 두 가지 단백질을 표적으로 하는 능력입니다. 이것은 다른 복합체에서 조성으로 구별되는 RNA 단백질 복합체를 위해 풍부하게 하는 강력한 방법을 제공합니다.
또한, RIPiT-Seq는 UV-크로스링크 독립적이며, 직접적으로 결합하지 않고 RNA에 작용하는 많은 단백질에 적용될 수 있다. 이 방법은 치료 또는 진단쪽으로 직접 확장되지 않는 동안, RNA 결합 단백질 및 RNA 처리는 신경병증과 암 같이 몇몇 질병과 연관되었습니다. RIPiT-Seq는 질병 관련 RNA 결합 단백질의 기능을 연구하기 위한 도구를 제공합니다.
RIPiT-Seq는 에피토프 태그 단백질을 발현할 수 있는 시스템이 필요합니다. HEK293 세포에서만 테스트되었으며 세포 배양에 가장 순종합니다. 그러나 이제 CRISPR을 사용하여 단백질에 태그를 붙일 수 있는 RIPiT-Seq는 다양한 현대 시스템에 적용할 수 있습니다.
RIPiT의 성공은 두 가지 효율적인 면역 침전도에 따라 달라지므로 사용되는 항체에 대한 면역 침전 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. 또한 RNA로 작업하려면 적절한 예방 조치가 필요하므로 RNA 추출 중 및 후에 RNase 가없는 시약을 사용해야합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실대학원생인 로렌 우드워드가 될 것입니다.
15센티미터 플레이트당 15밀리리터의 냉장 PBS로 단층 세포를 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 세포를 PBS 30 밀리리터로 긁어 50 밀리리터 원내 튜브로 수집합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 400g에서 원심분리하여 세포를 펠렛하고, 상류부를 폐기한다.
얼음 차가운 저혈압 용해 버퍼 4 밀리리터를 추가하고 P1000 파이펫을 사용하여 세포를 다시 일시 중단합니다. 용양을 5밀리리터 튜브로 옮기고 얼음에 10분 간 배양합니다. 얼음 욕조에 lysate를 놓고 원고 의 지시에 따라 초음파 처리합니다.
그런 다음 염분 농도를 150 밀리머로 조정하기 위해 염화 나트륨 5개중 108마이크로리터를 첨가합니다. 이어서, 12, 000g에서 100g의 리세지를 섭씨 4도에서 원심분리하고, 서부 블롯 분석을 위해 20마이크로리터를 수집한다. 사전 세척 플래그 아가로즈 구슬 원고 방향에 따라 5 밀리리터 튜브에 구슬의 750 마이크로 리터에 남아있는 슈퍼 너티드를 적용합니다.
플래그 아가로즈 구슬을 셀 추출물과 함께 4°C에서 1~3시간 동안 부드러운 믹싱으로 배양합니다. 인큐베이션 후, 4°C에서 1분 동안 400g의 원심분리로 구슬을 펠릿하고, 서부 블롯 분석을 위해 20마이크로리터를 수집한다. 남은 상체를 버리고 이소 세척 버퍼 4밀리리터로 재보설하여 구슬을 씻으십시오.
구슬을 다시 펠릿하고 상체를 제거합니다. RNase I를 원고 방향에 따라 이소 세척 버퍼750 마이크로리터에 희석하고 플래그 아가로즈 구슬에 추가합니다. 부드러운 혼합과 섭씨 4도에서 혼합물을 배양한 다음 구슬을 원심분리로 펠릿합니다.
서부 얼룩 분석을 위해 20 마이크로리터의 상체를 수집하고 나머지는 폐기하십시오. 그런 다음, 앞서 설명한 대로 이소 세척 버퍼로 구슬을 씻는다. 다음으로, 구슬에 용출 버퍼 375 마이크로리터를 추가하고, 1~2시간 동안 섭씨 4도에서 부드럽게 혼합물을 흔들어 친화성 용출을 수행한다.
인큐베이션 후, 구슬을 펠릿과 서쪽 블롯 분석을 위한 용출의 15 마이크로리터 알리쿼트를 수집한다. 친화성 용출이 진행되는 동안 자기 비드 항체 연상을 수행하십시오. 이소 세척 버퍼의 1 밀리리터에 자기 구슬 50 마이크로 리터를 세척하여 시작합니다.
구슬을 100 마이크로리터의 인주화 완충제에서 재보중단하고 적절한 양의 항체를 첨가한다. 그런 다음 실온에서 구슬을 10 분 이상 배양하십시오. 자기 구슬을 컨쥬게이션 버퍼로 두 번 세척하고 RIPiT 희석 버퍼의 375 마이크로 리터에서 구슬을 재연하십시오.
면역 침전될 때까지 구슬을 얼음에 보관하십시오. FLAG 선호도 용출을 항체 결합 마그네틱 구슬에 적용하고 섭씨 4도에서 1~2시간 동안 부드러운 혼합으로 인큐베이션을 적용합니다. 자석으로 마그네틱 구슬을 캡처하고 서부 블롯 분석을 위해 15 마이크로리터의 상피리터를 수집합니다.
그런 다음, 이소 세척 버퍼로 구슬을 7 번 씻는다. 투명 시료 버퍼 100마이크로리터에서 자기 구슬을 재연하고 10분 동안 얼음에 현탁액을 배양하여 용출을 제거합니다. 인큐베이션 중에 주기적으로 구슬을 쓸어 다시 보입니다.
자석에 자기 구슬을 캡처하고 서쪽 얼룩 분석을 위해 용출의 15 마이크로 리터를 수집합니다. 남은 용용을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮는다. RNA를 추출하려면 RNase 가 없는 물 320마이크로리터와 400마이크로리터의 페놀 클로로폼 이소아밀 알코올을 RIPiT 용출에 추가합니다.
혼합물을 소용돌이시키고 원심분리기는 12, 000g에서 5분간 분리합니다. 수성 상 350마이크로리터를 별도의 튜브로 수집합니다. 아세테이트 나트륨, 염화 마그네슘, 글리코겐 및 에탄올을 수집된 샘플에 넣고 밤새 음수 섭씨 20도에서 혼합물을 배양합니다.
다음 날, RNA는 12, 000g에서 30분간 섭씨 4도에서 원심분리로 RNA를 환전하여 70%에탄올로 세척합니다. 에탄올 세척 후, ATP 없이 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 또는 PNK로 RNA를 치료하고 원고 방향에 따라 페놀 클로로포름 정제를 수행한다. RNase 가 없는 물의 4.5 마이크로리터에서 깨끗한 RNA를 다시 중단합니다.
RNA 수율을 정량화하기 위하여는, 원고 지침에 따라 AtPs를 표시한 PNK 및 32P로 RNA를 라디오 라벨. 크기 및 수량 표준에 대해 저거리 DNA 사다리와 20~40개의 뉴클레오티드 합성 올리고를 사용합니다. 26%의 우레아 폴리아크라이아미드 젤로 표지된 RNA를 해결한다.
원고 의 지시에 따라 젤을 건조하고 적절한 신호가 감지 될 때까지 인스크린에 젤을 노출. 이 기술은 엑슨 접합 복합체 또는 EJC의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다. RIPiT 절차의 각 주요 단계에서 정제된 단백질의 서양 얼룩 분석은 정제된 EJC가 EIF4A3과 MAGOH를 모두 포함하고 있음을 보여줍니다.
음의 대조군 HNRNPA1은 용출에서 검출되지 않는다. RNA 발자국 신호의 강도는 RNA 단백질 상호작용의 양과 상관관계가 있다. RIPiT가 RNA에 EJC 점유율을 증가 puromycin로 처리된 세포에 RIPiT가 수행될 때 더 강한 발자국이 관찰됩니다.
RIPiT가 효과적이도록 하려면 서부 얼룩별로 IP의 효율성을 테스트하는 것이 중요합니다. 심층 시퀀싱을 진행하기 전에 RNA의 양과 품질을 평가하는 것도 중요합니다. 2018년 Singh 연구소는 이 기술을 사용하여 엑슨 접합 복합체의 두 가지 구성적으로 뚜렷한 변이를 정화하고 RNA 결합 패턴을 식별했습니다.
연구원이 사인 방사선 사진으로 RNA 발자국을 검출하기로 결정하면 모든 적절한 방사선 안전 절차 및 프로토콜을 따라야합니다.
