혈관 신생종양 전이 및 진행에 중요한 역할을합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 유방암의 마우스 모형에 있는 동적 종양 진행 및 혈관신생을 감시하기 위하여 이중 생물 발광 화상 진찰 방법을 사용할 것입니다. 이 모델에서는, 우리는 반딧불 루시파라제와 Renilla luciferase 화상 진찰을 통해 단 하나 마우스에서 종양 성장 및 혈관 신생을 동시에 추적할 수 있습니다, 각각.
이 모형은 항종양 약 검열 및 종양학 연구에서 넓게 적용될 수 있습니다. 이 이중 생물 발광 모델은 종양 진행 및 회귀를 추적하고 치료 전략에 대한 응답으로 종양 관련 분자 과정을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 혈관 신생은 종양 진행의 중요한 과정입니다.
따라서 효과적인 종양 치료 개발을 위해서는 시각 및 민감한 방식으로 종양 진행 및 혈관 신생을 모니터링하는 것이 필요하다. 절차는 우리 연구소의 학생인 장카이유, 첸왕, 상첸이 시연할 예정이다. 렌티바이러스 포장 및 생산 종자의 경우 DMEM의 2밀리리터에서 293T 세포의 6분의 1을 10% 태아 소 세럼으로 보충하여 1박 배양용 6웰 플레이트에 37°C와 이산화탄소 5%의 가습된 배양소로 보충하였다.
다음날 아침 리포솜 7.5 마이크로리터와 250마이크로리터의 최소 필수 매체를 실온에서 5분간 배양하는 두 개의 별도의 1.5밀리리터 튜브에 섞어드십시오. DNA 솔루션을 준비하려면 표에 설명된 개별 1.5 밀리리터 튜브에 최소 필수 배지의 250 마이크로리터에 플라스미드 렌티바이러스 RR 벡터 및 도우미 플라스미드를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서 부드럽게 드롭 현명한 방식으로 리포솜 현탁액에 DNA RR 솔루션을 추가하고 실온에서 20 분 동안 지질 막에 결합 DNA를 허용합니다.
혼합물이 배양하는 동안, 293T 세포 배양의 상체를 신선한 배양 배지의 1 밀리리터로 대체하고, 각각의 웰에 적절한 리포솜 DNA 혼합물의 0.5 밀리리터를 부드럽게 첨가한다. 세포 배양 인큐베이터에 세포를 12-16 시간 동안 반환한 후 항생제로 보충된 신선한 배양 배지의 1밀리리터로 각 우물의 상체를 교체한다. 추가 36 시간의 인큐베이션 후, 상류체를 렌티바이러스 균주당 하나의 원뿔 튜브로 풀을 293T 세포를 원심분리에 의해 퇴적시한다.
그런 다음 렌티바이러스 RR 함유 슈퍼나티를 영하 80도에서 보관할 수 있도록 개별 1.5밀리리터 멸균 폴리프로필렌 저장 튜브로 전송합니다. 4T1 유방 종양 세포에서 유전자 발현을 위한 렌즈피바이러스 변환을 위해, 6웰 4T1 세포 배양 판의 각 웰에 있는 상체를 태아 소 혈청으로 보충한 신선한 RPMI 계 세포 배양 배지의 1밀리리터와 렌즈피바이러스 주식의 1밀리리터로 대체한다. 그런 다음 폴리브레네 밀리리터 당 8 마이크로그램을 각 웰에 넣고 몇 번 부드럽게 파이펫을 섞습니다.
플레이트를 원심분리하여 배분 효율을 높이고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 4~12시간 동안 되돌려 줍니다. 인큐베이션의 끝에서, 어떤 렌티 바이러스 입자와 Polybrene을 제거하기 위해 혈청과 항생제로 보충 신선한 배양 매체와 각각의 잘에 있는 상체를 대체합니다. 렌티바이러스-트랜스포동 세포를 선택하기 위해, 선택 배지를 사용하여 1대 3 대 4 비율로 변환된 4T1 세포 배양을 통과하여 매 2~3일마다 배지를 변경한다.
7일간의 선택 배지 배양 후, 형광 반전상 대비 현미경하에서 트랜스포싱된 세포 배양을 보고 적색 형광 단백질 양성 또는 RFP-4T1 세포 및 모든 4T1 세포의 수를 3개의 비전 분야에서 계산하여 RFP 양성 비율을 추정한다. 종양 베어링 마우스 모델을 설정하려면 PBS로 80%의 컨컬컬싱 세포 배양을 세척한 후 60mm 배양 판당 트립신-EDTA 2밀리리터로 세포를 분리합니다. 플레이트 바닥에서 세포가 들어 올려지면 플레이트 당 보충 된 혈청 의 5 ~ 10 밀리리터로 반응을 중지합니다.
그리고 개별 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 문화를 전송하여 계산합니다. 혈청 농도 없이 배양 배지의 100 마이크로리터 당 100 마이크로리터당 세포를 10~6세포로 1회 희석한다. 그리고 4T1-RR 세포주의 마이크로리터 100을 마취된 종양 베어링 모델 마우스의 왼쪽 어깨에 피하시키고, 4T1-RRT 세포라인의 100마이크로리터를 동일한 마우스의 오른쪽 어깨에 주입한다.
주사 후, 완전히 복구 될 때까지 열 지지와 적절한 복구 영역에 각 마우스를 배치합니다. 마우스가 종양 을 베어링하고 있는지 확인하기 위해 7 일 동안 매일 종양 질량을 palpate. 7일째 이식 후, 간시클로비르킬로그램당 50마이크로그램을 실험이 끝날 때까지 하루에 두 번 씩 각 종양 베어링 마우스에 주입한다.
종양 성장을 위해 살아있는 이미징 시스템을 엽니다. 리빙 이미징 소프트웨어를 초기화하고 시스템을 초기화합니다. 시스템이 초기화되는 동안, 각 마우스를 레트로불바르에 적절한 양의 coelenterazine로 이미지하도록 주입하는 인슐린 주사기를 사용합니다.
주입된 마우스를 카메라 챔버에 넣고 생체 발광 신호가 사라질 때까지 4T1 세포로부터 Renilla luciferase 신호를 획득하기 위해 마우스 의 여러 사진을 즉시 얻습니다. Renilla luciferase 이미징 후 10 분, 인슐린 주사기를 사용하여 각 동물에 D-luciferin의 적절한 볼륨을 내분하. D-루시페린 주입 후 10분 후, 마우스를 카메라 챔버에 넣고 혈관신생으로부터 반딧불 루시파래아제 신호를 획득하기 위해 마우스 등대의 여러 이미지를 얻습니다.
렌티바이러스 트랜스듀션 후, 세포의 99% 이상이 RFP 양성이며, 두 개의 트랜스포이드 세포주 간에 관찰된 세포 배양 형태에 차이가 없다. 그 후, 트랜스듀싱된 세포의 생물 발광 이미징은 두 세포주 모두 유사한 강도의 강력한 생물 발광 신호를 방출한다는 것을 밝힙니다. 형질전환된 세포주를 형질종양 베어링 마우스 모델로 피하주사한 후, 혈관신생 유도종양 성장은 동일한 동물에서 D-luciferin의 존재 시공시반파리 루시파라제 신호에 의해 평가될 수 있다.
7일 간의 이식 후, Ganciclovir 투여는 4T1-RRT 세포에서 죽음을 유도하여 이러한 세포에 의해 확립된 종양에서 레닐라 루시파아제 신호의 극적인 감소를 초래합니다. 반딧불 루시파제 신호는 또한 레닐라 루시파라제 발현의 증가와 함께 증가하고 루시파아제 감소 에 따라 감소. 종합하면, 이 결과는 종양 혈관신생과 종양 성장 사이 직접적인 상관관계가 있다는 것을 건의합니다.
실제로, 간시클로비르 유도 종양 세포 죽음은 종양 혈관신생의 억제로 이어질 수 있다. 또한, 혈관 내피 성장 인자 수용체 II에 대한 면역 염색은 혈관 신생의 마커로서, 간치로비르 투여 후 관찰된 반딧불 루시파제 신호의 감소와 일치하는 4T1-RRT 종양의 단면도보다 4T1-RR 종양 조직 섹션에서 보다 더 현저하게 확립된 미세 혈관 구조를 드러낸다. 프로토콜의 가장 중요한 단계는 세포와 혈관 신생의 동시 추적을 위해 FLuc 및 RLuc와 같은 두 종류의 루시파라제를 사용하는 것입니다.
이 기술은 다른 위치 내의 암세포를 취급하기 위하여 이용될 수 있고, 바이러스 암 모형에서 넓게 이용될 수 있습니다. HSV-ttk/GCV 추적 시스템의 종양 성장 및 항종양 효과를 허용하는 이 마우스 모델은 살아있는 동물에서 동적으로 시각화될 수 있다. 미디어에 인체에 해로울 수 있는 렌티바이러스 입자가 포함되어 있기 때문에 렌티바이러스 트랜스페션을 방지하기 위해 생물안전 수준 II 시설이 필요합니다.
