تولد الأوعية يلعب دورا هاما في ورم الانبثاث والتقدم. في هذا البروتوكول، سوف نستخدم أسلوب التصوير البيوجيني المزدوج لرصد تطور الورم الديناميكي وتسيس الأوعية الدموية في نموذج فأرة سرطان الثدي. في هذا النموذج، يمكننا تتبع نمو الورم و تسيس الأوعية في وقت واحد في الماوس واحد من خلال لوسيفراز اليراعات ورينيلا لوسيفراز التصوير، على التوالي.
قد يتم تطبيق هذا النموذج على نطاق واسع في فحص الأدوية المضادة للورم وأبحاث الأورام. يمكن استخدام هذا النموذج المزدوج للتخمة الحيوية لتتبع تطور الورم وتراجعه والكشف عن العمليات الجزيئية المرتبطة بالورم استجابة للاستراتيجيات العلاجية. Angiogenesis هو عملية حاسمة من تطور الورم.
لذلك ، من الضروري مراقبة تطور الورم وتولد الأوعية بطريقة مرئية وحساسة لتطوير علاجات الورم الفعالة. وسوف تظهر الإجراءات من قبل كايو تشانغ، تشن وانغ، وشانغ تشن، والطلاب من مختبرنا. للتعبئة والتغليف والبذور إنتاج الفيروس العدسي مرة واحدة 10 إلى السادسة من الخلايا 293T في مليلتر اثنين من DMEM تكملها مع مصل الأبقار الجنين 10٪ في بئر في لوحة ستة جيدا لثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في صباح اليوم التالي مزيج 7.5 ميكرولترات من liposome مع 250 ميكرولترات من الحد الأدنى من الضروري المتوسطة في اثنين من أنابيب منفصلة 1.5 ملليلتر لمدة خمس دقائق الحضانة في درجة حرارة الغرفة. لإعداد حلول الحمض النووي إضافة ناقلات RR فيروس العدس وbnasmids المساعد إلى 250 ميكرولترات من الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية في أنابيب فردية 1.5 ملليلتر كما هو مبين في الجدول. في نهاية الحضانة بلطف إضافة الحمض النووي RR حلول لتعليق liposome بطريقة قطرة الحكيمة والسماح للحمض النووي للارتباط إلى الأغشية الدهنية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في حين أن الخليط هو احتضان، استبدال نابير من ثقافة الخلايا 293T مع ملليلتر واحد من الثقافة الطازجة المتوسطة، وإضافة بلطف 0.5 ملليلتر من خليط الحمض النووي الدهني المناسب لكل بئر. إعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 12 إلى 16 ساعة قبل استبدال المابير في كل بئر بميليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة تكملها المضادات الحيوية. بعد 36 ساعة إضافية من الحضانة، تجمع المابس في أنبوب واحد مخروطي لكل سلالة من فيروسات العدس إلى رواسب الخلايا 293T عن طريق الطرد المركزي.
ثم نقل RR فيروس العدس التي تحتوي على RR كبرى في الفردية 1.5 ملليلتر أنابيب تخزين البولي بروبلين معقمة للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. بالنسبة لتحولات الخلايا العضدية للتعبير الجيني في خلايا الورم الثديي 4T1، استبدل المابير في كل بئر من لوحة ثقافة الخلايا 4T1 ذات الستة بئرًا بميليلتر واحد من ثقافة الخلايا الطازجة المستندة إلى RPMI والمكملة بمصل الأبقار الجنينية ومليلتر واحد من مخزون العدسي. ثم إضافة ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر من بوليبرين إلى كل بئر، وماصة بلطف عدة مرات لخلط.
الطرد المركزي لوحة للمساعدة في زيادة كفاءة النقل، وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع إلى 12 ساعة. في نهاية الحضانة، استبدال نابيرات في كل بئر مع ثقافة جديدة المتوسطة تستكمل مع المصل والمضادات الحيوية لإزالة أي جزيئات العدس وبوليبرين. لتحديد للخلايا التي يسببها فيروس العدس، مرور الثقافات خلية 4T1 المستحثة بنسبة واحد إلى ثلاثة إلى واحد إلى أربعة مع متوسط الاختيار، وتغيير المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام.
بعد سبعة أيام من اختيار ثقافة متوسطة، عرض الثقافات الخلية المستحثة تحت المجهر الفلوري المقلوب المرحلة التباين وحص عدد من أحمر فلورية إيجابية البروتين أو RFP-4T1 الخلايا وجميع الخلايا 4T1 في ثلاثة مجالات الرؤية لتقدير نسبة RFP إيجابية. لإعداد نموذج الماوس الحاملة للورم، غسل 80٪ التقاء الثقافات الخلية المنقولة مع برنامج تلفزيوني قبل فصل الخلايا مع ملليلتر اثنين من التربسين-EDTA لكل لوحة ثقافة 60 ملليمتر. عندما رفعت الخلايا من قيعان لوحة وقف التفاعل مع خمسة إلى 10 ملليلتر من المصل تكمل المتوسطة لكل لوحة.
ونقل الثقافات إلى أنابيب فردية للطرد المركزي 15 ملليلتر للعد. تمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل 100 ميكرولترات من المتوسطة الثقافة دون تركيز المصل. وحقن تحت الجلد 100 ميكرولترات من خط الخلية 4T1-RR في الكتف الأيسر من الماوس نموذج تحمل الورم تخدير، و 100 ميكرولترات من خط الخلية 4T1-RRT في الكتف الأيمن من نفس الماوس.
بعد الحقن، ضع كل فأرة في منطقة استرداد مناسبة مع دعم حراري حتى يتم استردادها بالكامل. بالباتات كتلة الورم كل يوم لمدة سبعة أيام للتأكد من أن الفئران هي تحمل الورم. في اليوم السابع بعد الزرع، يحقن داخل الصفتون 50 ميكروغرام لكل كيلوغرام من غانسيكلوفير في كل فأر يحمل الورم مرتين في اليوم حتى نهاية التجربة.
لنمو الورم، افتح نظام التصوير الحي. تهيئة برنامج التصوير الحية و تهيئة النظام. في حين أن النظام هو تهيئة، واستخدام حقنة الأنسولين لحقن كل فأرة ليكون صورة مع حجم مناسب من coelenterazine في الرجعية.
ضع الفئران المحقونة في غرفة الكاميرا والحصول على الفور عدة صور للماوس dorsally للحصول على إشارات رينيها لوسيفراز من خلايا 4T1 حتى تتلاشى إشارات الإضاءة الحيوية. بعد 10 دقائق من التصوير في رينايلا لوسيفيراز، استخدم حقنة الأنسولين لحقن داخل الصفاق حجم مناسب من D-luciferin في كل. بعد 10 دقائق من حقن D-luciferin، ضع الفئران في غرفة الكاميرا والحصول على عدة صور من دورسال الماوس للحصول على إشارات اليراعات من تولد الأوعية الدموية.
بعد تحويل الفيروس العدسي، أكثر من 99٪ من الخلايا هي RFP إيجابية مع عدم وجود اختلافات في مورفولوجيا ثقافة الخلية لوحظ بين خطي الخلية المستحثة. في وقت لاحق، يكشف تصوير الإضاءة الحيوية للخلايا المستحثة أن كلا الخطين من الخلايا ينبعث من إشارات إنارة حيوية قوية لقوة مماثلة. بعد الحقن تحت الجلد من خطوط الخلايا المستحثة في نموذج الماوس الحاملة للورم، يمكن تقييم نمو الورم الناجم عن تولد الأوعية بواسطة إشارات اليراعات في وجود D-luciferin في نفس الحيوان.
في سبعة أيام بعد زرع, إدارة Ganciclovir يحفز الموت في خلايا 4T1-RRT مما أدى إلى انخفاض كبير في إشارة لوسيفراز رينيه في الأورام التي أنشأتها هذه الخلايا. إشارات اليراعات لوسيفراز زيادة أيضا بالتزامن مع زيادة في التعبير luciferase رينايلا وانخفاض بعد انخفاض لوسيفراز. معا، هذه النتائج تشير إلى أن هناك علاقة مباشرة بين تولد الأوعية الورم ونمو الورم.
في الواقع، قد يؤدي موت الخلايا السرطانية الناجم عن غانسيكلوفير إلى تثبيط تولد الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، المناعة لمستقبِل عامل النمو البطواني المضاد للأوعية الدموية II، كعلامة على تكوين الأوعية الدموية، يكشف عن بنية الأوعية الدموية الدقيقة المنشأة بشكل أكبر في أقسام أنسجة الورم 4T1-RR مما كانت عليه في أقسام من أورام 4T1-RRT، بما يتفق مع الانخفاض في إشارة اليرافلية التي لوحظت بعد إدارة غانتسيلوار. الخطوة الأكثر أهمية من البروتوكول هو استخدام نوعين من لوسيفراز، مثل FLuc وRLuc لتتبع في وقت واحد من الخلايا و الأوعية الدموية.
ويمكن استخدام هذه التكنولوجيا لعلاج الخلايا السرطانية داخل مواقع مختلفة، ويمكن استخدامها على نطاق واسع في نماذج سرطان الفيروس. هذا النموذج الماوس السماح نمو الورم والآثار المضادة للورم من نظام تتبع HSV-ttk/GCV أن تصور بشكل حيوي في حي. مطلوب مرفق من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية لمنع العدوى بفيروس العدس، حيث تحتوي الوسائط على جزيئات فيروس العدس التي يمكن أن تكون ضارة للبشر.
