탯줄 혈액 단위에서 조혈 줄기 세포의 전 생체 확장은 재생 의학 및 이식 요법에서 HSC 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 개최. 이 프로토콜은 발프로산 치료와 결합된 사이토카인 칵테일을 사용하여 1차 원시 HSC와 유사한 특성을 가진 많은 기능성 HSC를 빠르게 확장합니다.
이 방법은 현재 사용되는 유전자 수정 프로토콜에 관련있는 기간 내에 더 많은 수의 유전자 변형 세포의 생성에 도움이 될 수 있습니다. valproic acid ex vivo 확장 프로토콜은 상대적으로 간단 하 고 신뢰할 수 있습니다. 세포 분리기 장치와 CD34 양성 세포의 정제는 매우 재현 가능하고 빠른, 고도로 정제 된 CD34 양성 세포의 빠른 복구를 허용.
탯줄 혈액으로부터 CD-34 양성 세포의 격리 24시간 전에, 0.5 개의 어금니 EDTA의 2밀리리터와 7.5%BSA의 33 밀리리터를 1X PBS의 465 밀리리터에 추가하여 분리 완충액을 준비한다. 버퍼를 부드럽게 섞고 섭씨 4도에서 하룻밤을 유지합니다. 정화 당일에는 미디어를 실온으로 데워보실 수 있습니다.
전체 탯줄 혈액 을 75 평방 센티미터 플라스크로 분배합니다. 실온에서 PBS의 동일한 부피로 혈액을 희석하고 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 전체 탯줄 혈액 단위를 처리하는 데 필요한 튜브의 수를 결정합니다.
각 튜브에 밀도 그라데이션 미디어 15밀리리터를 추가합니다. 45도 각도로 튜브를 유지하면서 밀도 그라데이션 위에 희석 된 혈액을 매우 느리게 분배하여 두 층을 만듭니다. 낮은 가속 및 감속 속도로 30 분 동안 400g에서 튜브를 원심 분리합니다.
원심분리 후, 단일핵 세포는 플라즈마와 밀도 그라데이션 미디어 층 사이의 백색 층에 위치하게 된다. 버피 코트 레이어를 새로운 50밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮킨다. 동일한 탯줄 혈액 단위에서 모든 단일 핵 세포를 50 밀리리터 튜브로 수집하여 25 밀리리터에 도달하십시오.
단핵 세포의 25 밀리리터를 포함하는 관에 차가운 PBS의 25 밀리리터를 추가하고 잘 섞는다. 원심분리기는 400g, 섭씨 4도에서 10분 간. 조심스럽게 슈퍼 나티를 흡인하고 차가운 PBS의 50 밀리리터에서 세포 펠릿을 재중단.
그 후 셀 서스펜션의 마이크로리터 20을 제거하여 계수합니다. 자동 세포 카운터를 사용하여 아크리딘 오렌지 또는 프로피듐 요오드로 염색된 세포의 수를 계산하고 단일 핵 세포의 총 수를 계산합니다. 그런 다음 세포를 400g에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리합니다.
첫째, 분리 버퍼 300마이크로리터를 인간 FCR 인간 IgG 100 마이크로리터와 CD34 자성 구슬 100마이크로리터와 혼합하여 CD34 양성 세포를 1,000만 개의 단일핵 세포로부터 분리한다. 다음으로, 이전에 원심분리된 단일핵 세포의 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거한다. 1,000만 개의 세포당 500마이크로리터를 사용하여 자기 비드 용액의 펠릿을 재중단합니다.
부드럽게 섞어서 섭씨 4도에서 30분간 배양하세요. 인큐베이션 중에 저장 액액을 작업 버퍼로 대체하고 세척 프로그램을 실행한 다음 헹구는 프로그램을 실행하여 셀 분리기 장치를 준비합니다. 그런 다음, 튜브가 완전히 채워지도록 세포 혼합물을 포함하는 튜브에 버퍼를 실행하는 콜드 셀 분리기를 추가합니다.
원심 분리는 400g에서 4°C에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 1,000만 개의 세포당 2밀리리터를 사용하여 완충을 실행하는 차가운 분리기에서 셀 펠릿을 흡인하고 재주용한다. 2밀리리터 세포 현탁액 혼합물을 15밀리리터 튜브로 옮기습니다.
3세트의 튜브를 셀 분리기 랙에 적재하여 섭씨 4도까지 미리 냉각됩니다. 튜브의 한 세트는 MmC를 포함, 튜브의 두 번째 세트는 음극을 수집하는 데 사용됩니다, 튜브의 세 번째 세트는 정제 CD34 양성 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 랙을 셀 분리기 장치에 로드하고 미리 설정된 프로그램을 실행합니다.
그 후, 15분 동안 400g에서 400g, 섭씨 4도에서 양수를 포함하는 튜브를 원심분리합니다. 수퍼네티드를 흡습하고 정제된 CD34 양성 세포를 혈청이 없는 매체의 1밀리리터로 재보선다. 그런 다음 자동화된 세포 카운터를 사용하여 아크리딘 오렌지 또는 요오드로 염색된 세포를 계산합니다.
먼저, 밀리리터당 33, 000 세포의 밀도로 정제된 CD34 양성 세포를 플레이트에 충분한 양의 매체를 준비한다. 50, 000 세포의 세포 밀도에서 12웰 플레이트에서 정제된 CD34 양성 세포를 잘 당 1.5 밀리리터에서 플레이트. 16시간 동안 5%의 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다.
최종 농도가 1 밀리머인 배양에 valproic 산을 추가합니다. 추가 7 일 동안 동일한 조건에서 세포를 배양 계속합니다. 이 전 생체 프로토콜에서, 탯줄 혈액으로부터 분리된 CD34 양성 세포로부터 생성된 원시 조혈 줄기 세포의 수가 증가한다.
핵 세포의 총 수는 사이토카인 칵테일로만 처리된 배양에서 상당히 높습니다. 총 핵세포의 수가 증가함에도 불구하고 사이토카인 칵테일을 단독으로 받는 배양에서 조혈 줄기세포의 수는 사이토카인 칵테일과 발프로산으로 치료된 배양에 비해 전체 확장 기간 동안 낮게 유지되고 있다. 가장 많은 수의 조혈 줄기 세포는 사이토카인 칵테일과 발프로산의 조합으로 처리된 배양에서 생성됩니다.
특히, 발프로산으로 치료한 후 5~7일 후에 가장 큰 팽창이 이루어졌습니다. 이 증가된 조혈 줄기 세포수는 발프로산으로 치료한 지 24시간 이내에 주목할 만한 조혈 줄기 세포의 비율의 급격한 증가와 상관관계가 있습니다. 백분율의 증가는 전 생체 문화의 첫번째 4 일 도중 유지되는 동안, 처리의 5 7 일 후에 점진적으로 감소합니다.
그러나, 이 감소는 조혈 줄기 세포의 절대 수의 증가와 반비례한다. valproic-acid-처리 된 배양에서 조혈 줄기 세포의 비율의 급속한 증가는 CD90 표현형의 취득에 기인한다. CD34 양성 세포는 CD90 표현마커를 표현하여 4일 동안 사이토카인 칵테일 및 발프로산으로 처리된 전 생체 배양에서 확장된 세포의 거의 40~50%에 도달한다.
CD90 표현형의 획득은 CD90 마커의 발현이 결여된 고도로 정제된 CD34 양성 세포의 전 생체 확장에 의해 확인된다. 발프로산으로 치료한 지 24시간 이내에, 전 생체내 확장 세포의 거의 75%가 CD90을 발현한다. 이 표현형은 이러한 배양에서 처음 4일 동안 매우 유지됩니다.
희석 된 코드 피는 튜브를 45도 각도로 유지하면서 밀도 그라데이션 위에 매우 천천히 분배되어야하며 두 개의 뚜렷한 층을 만들어야합니다. 이 전 생체 확장 절차에 따라 확장 된 세포는 그들의 기능성 및 이식 잠재력을 테스트하기 위해 myeloablated 면역 결핍 NSG 마우스로 주입 될 수 있습니다. 확장된 세포는 인간과 마우스 HSC의 생물학 과 HSC의 기능적 무결성에 대한 다른 유전자 또는 중요한 플레이어의 역할에 관한 다양한 질문을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
이 기술을 사용하여 인간 탯줄 혈액 단위에서 HSC를 확장 한 ex vivo의 기능은 곧 동종 골수 이식을 필요로하는 혈액 학적 악성 종양 환자의 임상 시험에서 테스트 될 것입니다. 이 기술은 또한 VPA 처리를 가진 전 생체 확장의 기초가 되는 기계장치를 조사하고 원시 HSCs의 생물학에 대한 통찰력을 얻는 것을 허용했습니다.
