Ex vivo expansion de la cellule souche hématopoïétique de l’unité de sang de cordon ombilical tenir une grande promesse pour l’application HSC dans la médecine régénérative et la thérapie de transplantation. Ce protocole utilise un cocktail de cytokine combiné avec le traitement d’acide valproïque pour étendre rapidement un grand nombre de HSCs fonctionnels avec des caractéristiques qui ressemblent étroitement aux HSCs primitifs primaires. En raison des effets prompts du traitement d’acide valproïque, cette méthode a également le potentiel de surmonter la perte de HSCs liée à l’édition de gène.
Cette méthode pourrait être bénéfique pour la génération d’un plus grand nombre de cellules génétiquement modifiées dans un délai qui est pertinent pour les protocoles de modification génétique actuellement utilisés. Le protocole d’expansion de l’acide valproïque ex vivo est relativement simple et fiable. La purification des cellules CD34 positives avec le dispositif de séparateur cellulaire est hautement reproductible et rapide, permettant la récupération rapide des cellules CD34-positives fortement purifiées.
24 heures avant l’isolement des cellules cd-34 positives du sang de cordon ombilical, préparer le tampon de séparation en ajoutant deux millilitres de 0,5 molaire EDTA et 33 millilitres de 7,5%BSA à 465 millilitres de 1X PBS. Mélanger délicatement le tampon et le maintenir toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour de la purification, réchauffer les médias à température ambiante.
Distribuez toute l’unité de sang du cordon ombilical dans un flacon de 75 centimètres carrés. Diluer le sang avec un volume égal de PBS à température ambiante et mélanger délicatement. Ensuite, déterminez le nombre de tubes nécessaires au traitement de toute l’unité de sang du cordon ombilical.
Ajouter 15 millilitres de supports de gradient de densité à chaque tube. Distribuez le sang dilué très lentement sur le dessus du gradient de densité tout en maintenant le tube à un angle de 45 degrés pour créer deux couches. Centrifuger le tube à 400 g pendant 30 minutes avec un faible taux d’accélération et de décélération.
Après la centrifugation, les cellules mononucléaires seront situées dans la couche blanche entre les couches de plasma et de gradient de densité des médias. Transférez soigneusement la couche de pelage chamois dans un nouveau tube de 50 millilitres. Recueillir toutes les cellules mononucléaires de la même unité de sang de cordon ombilical dans un tube de 50 millilitres jusqu’à atteindre 25 millilitres.
Ajouter 25 millilitres de PBS froid au tube contenant 25 millilitres de cellules mononucléaires et bien mélanger. Centrifugeuse à 400 g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Aspirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire en 50 millilitres de PBS froid.
Après cela, retirez 20 microlitres de la suspension cellulaire pour compter. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour compter le nombre de cellules tachées d’iodure d’acridine ou de propidium et calculer le nombre total de cellules mononucléaires. Puis, centrifuger les cellules à 400 g et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.
Tout d’abord, mélanger 300 microlitres de tampon de séparation avec 100 microlitres d’IgG humain FCR humain et 100 microlitres de perles magnétiques CD34 pour isoler les cellules CD34-positives de 10 millions de cellules mononucléaires. Ensuite, retirez soigneusement le surnatant d’un tube de cellules mononucléaires précédemment centrifugées. Resuspendez la pastille dans la solution de perle magnétique à l’aide de 500 microlitres pour 10 millions de cellules.
Mélanger délicatement et incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant l’incubation, préparez le dispositif de séparateur cellulaire en remplaçant la solution de stockage par le tampon de travail et en exécutant un programme de lavage suivi d’un programme de rinçage. Ensuite, ajouter le séparateur de cellules froides en cours d’exécution tampon au tube qui contient le mélange cellulaire jusqu’à ce que le tube est complètement rempli.
Centrifuger le tube à 400 g et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Aspirer le supernatant et résusquer la pastille cellulaire dans le séparateur froid en cours d’exécution tampon en utilisant deux millilitres pour 10 millions de cellules. Transférer le mélange de suspension cellulaire de deux millilitres dans des tubes de 15 millilitres.
Chargez trois ensembles des tubes dans la grille du séparateur cellulaire, qui a été pré-refroidi à quatre degrés Celsius. Un ensemble de tubes contient des CMM, le deuxième ensemble de tubes sera utilisé pour recueillir la fraction négative, et un troisième ensemble de tubes sera utilisé pour recueillir les cellules CD34-positives purifiées. Chargez le rack dans le dispositif séparateur cellulaire et exécutez le programme de prédéfini.
Après cela, centrifugeuse les tubes contenant la fraction positive à 400 g à et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules CD34-positives purifiées dans un millilitre de médias sans sérum. Ensuite, utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules tachées d’orange acridine ou d’iodure de propidium.
Tout d’abord, préparez un volume suffisant de médias pour plaquer les cellules CD34-positives purifiées à une densité de 33 000 cellules par millilitre. Plaquez les cellules CD34-positives purifiées dans une plaque de 12 puits à une densité cellulaire de 50 000 cellules dans 1,5 millilitres de médias par puits. Incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié de dioxyde de carbone de 5 % pendant 16 heures.
Ajouter de l’acide valproïque aux cultures de sorte que la concentration finale est d’un millimlaire. Continuer à faire la culture des cellules dans les mêmes conditions pendant sept jours supplémentaires. Dans ce protocole ex vivo, le nombre de cellules souches hématopoïétiques primitives générées à partir de cellules CD34 positives isolées du sang de cordon ombilical est augmenté.
Le nombre total de cellules nucléées est significativement plus élevé dans les cultures traitées avec le seul cocktail de cytokine. Malgré le nombre plus élevé de cellules nucléées totales, le nombre de cellules souches hématopoïétiques dans les cultures recevant le cocktail de cytokine seul reste faible pendant toute la période d’expansion, comparé aux cultures traitées avec le cocktail de cytokine et l’acide valproïque. Le plus grand nombre de cellules souches hématopoïétiques est généré dans les cultures traitées avec une combinaison du cocktail cytokine et de l’acide valproïque.
En particulier, la plus grande expansion est atteinte après cinq à sept jours suivant le traitement avec de l’acide valproïque. Ce nombre accru de cellules souches hématopoïétiques est corrélé avec une augmentation rapide du pourcentage de cellules souches hématopoïétiques, ce qui est notable dans les 24 heures suivant le traitement avec de l’acide valproïque. Bien que l’augmentation du pourcentage soit maintenue au cours des quatre premiers jours de la culture ex vivo, elle diminue progressivement après cinq à sept jours de traitement.
Cependant, cette diminution est inversement corrélée avec une augmentation du nombre absolu de cellules souches hématopoïétiques. L’augmentation rapide du pourcentage de cellules souches hématopoïétiques dans les cultures traitées à l’acide valproïque est due à l’acquisition du phénotype CD90. Les cellules CD34 positives exprimant le marqueur phénotypique CD90 atteignent près de 40 à 50% des cellules développées dans des cultures ex vivo traitées avec le cocktail cytokine et l’acide valproïque pendant quatre jours.
L’acquisition du phénotype CD90 est ensuite confirmée par l’expansion ex vivo des cellules CD34 positives hautement purifiées qui n’ont pas d’expression du marqueur CD90. Dans les 24 heures suivant le traitement à l’acide valproïque, près de 75 % des cellules ex vivo élargies expriment le CD90. Ce phénotype est fortement conservé pendant les quatre premiers jours dans ces cultures.
Le sang de cordon dilué doit être distribué très lentement au-dessus du gradient de densité tout en tenant le tube à un angle de 45 degrés pour créer deux couches distinctes. Après cette procédure d’expansion ex vivo, les cellules élargies peuvent être injectées dans les souris NSG myéloablated immunisées déficientes pour tester leur fonctionnalité et potentiel d’engraftment. Les cellules élargies peuvent être utilisées pour tester une variété de questions concernant la biologie du HSC humain et de souris et le rôle des différents gènes ou acteur critique sur l’intégrité fonctionnelle des HSC.
La fonctionnalité de hsc ex vivo étendu de l’unité humaine de sang de cordon ombilical, utilisant cette technique, sera bientôt examinée dans un essai clinique dans le patient présentant des malignités hématologiques qui exigent la transplantation allogenic de moelle. Cette technique nous a également permis d’étudier le mécanisme sous-jacent à l’expansion ex vivo avec le traitement VPA et d’obtenir des aperçus de la biologie des HSC primitifs.
