단백질 합성은 오류가 발생하기 쉽습니다. 그러나, 오류생리적 스트레스하에서 적응될 수 있다. 우리는 이전에 진균에 있는 특정 번역 오류가 항생 내성에 기여된다는 것을 보여주었습니다.
특정 오류 율을 측정할 수 있다는 것은 우리가 이 박테리아 적응 기계장치를 표적으로 할 수 있게 합니다. 이러한 기술의 주요 장점은 기능의 게인 기자질량 분석법에 의해 감지하기 쉽지 않은 작은 오류 율을 측정에 절묘하게 민감 할 수 있다는 것입니다. Nluc/GFP 분석은 박테리아의 과도한 취급 및 용해를 피하기 때문에 중간 처리량 검사를 허용합니다.
절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생 인 Yue-Meng Chen이 될 것입니다. 오늘 우리는이 비디오를 통해이 두 기자를 사용하는 절차를 시연 할 것입니다. 우선, 야생형으로 7H9 배지의 밀리리터 2개를 접종하고 근균 기자 균주를 돌연변이시켰다.
섭씨 37도에서 1~2일 동안 또는 600 나노미터에서 OD가 고정 단계에 도달할 때까지 흔들어 주세요. 알리쿼트와 희석하여 약 0.5 내지 1의 600 나노미터에서 OD를 얻습니다. 그런 다음 밀리리터당 50 나노그램의 최종 농도에 ATC를 추가합니다.
즉시 잘못된 번역 속도에 미치는 영향을 측정하기 위해 원고에 따라 문화에 ksg의 다른 복용량을 추가합니다. 섭씨 37도에서 4~6시간 동안 흔들리면 배양하세요. 다음으로 세균 배양을 2밀리리터 튜브로 옮는다.
그리고 원심분리기는 실온에서 3, 220배 g에서 5분간 세균을 배출합니다. 원심 분리 단계 후, 상체를 버리고 1x 수동 용해 버퍼의 40 마이크로 리터를 추가하여 박테리아를 방해합니다. 재중단된 세균용 용액을 96웰 플레이트로 옮기고, 시료당 1개잘, 실온에서 20분간 흔들어 줍니다.
각 우물에 80 마이크로리터의 반딧불 기판을 추가합니다. 15초 동안 흔들어 서 발광계로 발광을 측정합니다. 그런 다음, 레닐라 기판80 마이크로리터를 각 우물에 추가합니다.
15초 동안 흔들어 서 발광계에 의해 발광을 측정합니다. 수정된 값을 사용하여 각 조건의 잘못된 번역 률을 계산합니다. 시작하려면 세균 기자 균주와 함께 7H9 배지의 2 밀리리터를 접종합니다.
섭씨 37도에서 1~2일 동안 또는 600 나노미터에서 OD가 고정 단계에 도달할 때까지 흔들어 주세요. 이어서, 7H9 배지의 50밀리리터에서 의 서브컬쳐를 600 나노미터에서 OD가 후기 고정 단계에 도달할 때까지 성장한다. 96웰 플레이트에 박테리아를 알리싱하기 전에, 밀리리터 당 50 나노 그램의 최종 농도에 ATC를 추가하고 잘 혼합.
잘 100 마이크로리터를 둥근 바닥의 96웰 플레이트에 추가합니다. 다음, 선택 된 우물에 ksg의 다른 복용량을 추가 잘못 된 속도에 미치는 영향을 검사. 200 마이크로리터의 멸균물을 접시의 우물에 추가하여 시료 우물에서 증발을 제한합니다.
접시를 밀봉하고, 흔들어서 16~20시간 동안 섭씨 37도에서 시료를 유도합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에서 80 마이크로리터를 사용합니다. 샘플을 검정 바닥 96웰 플레이트로 옮기고 광미계에 의해 GFP 신호를 측정합니다.
GFP 신호를 측정한 후 플레이트를 3, 220배g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음, 상체의 50 마이크로리터를 흰색 바닥 96웰 플레이트로 옮기. 그런 다음 Nluc 기판 50 마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.
잘 섞어서 발광계로 발광을 측정합니다. 마지막으로, 수정된 Nluc 발광 값을 GFP 형광으로 나누어 Nluc/GFP 비율을 결정합니다. 이 작품에서 레닐라 반딧불 기자 시스템은 야생형의 가스가마이신이 존재하고 ksgA가 삭제된 S.Smegmatis의 균주에서 잘못된 번역 속도를 측정하는 데 사용되었습니다.
결과는 ksgA-삭제 균주에 있는 동안 ksg감소 의 명확한 복용량 의존적 인 방법을 보여주었으며, ksg은 덜 강력했고, 가스가마이신에 의한 변조에 대한 저항으로 인해 잘못된 번역 속도의 기준이 높았다. 오역에 대한 Kasugamycin 행동은 또한 Nluc / GFP 기자를 사용하여 측정되었습니다. 레닐라 반딧불과 Nluc/GFP 기자는 모두 루시파라제 활동을 측정하는 것을 포함합니다.
작은 파이펫 팅 오류는 판독에 큰 변동을 일으킬 수 있습니다. 우선, 신뢰할 수 없는 판독을 받을 가능성을 최소화하기 위해 각 복제본수를 늘리는 것이 좋습니다.
