동물 연구 지침 및 규정에 명시 된 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 텍사스 A & M 대학에 의해 수행 되었다. 검토 및 생물 안전 요원 또는 위원회에서 승인이 필요할 수 있습니다.
주의: 모든 절차 BSL3 포함을 해야합니다. 직원은 항상 개인 보호 장비를 착용 해야 합니다. 모든 조작은 Biosafety 내각 (BSC) 안에 수행 되 고 모든 sharps sharps 용기에 삭제 됩니다. 작업을 시작 하기 전에, 작업 후 작업 표면 및 BSC 버퍼링 된 페 놀 및 70% 에탄올으로 청소 됩니다. 절차는 일반적으로 결핵균, biosafety 수준 3에서 할 것 이라고 하지만 일러스트 레이 션 및 촬영 목적에 대 한 저자 덜 악성 박테리아와 biosafety 수준 2에서이 절차를 보여.
1. 긴장 조건 문화
참고: M. 결핵 변형 CDC1551는이 연구에 사용 되지만 어떤 M. 결핵 긴장 든 지 같은 방식으로 사용할 수 있습니다.
<ol><li>M-OADC-TW에 박테리아를 성장 (7 H 9 국물 0.5% 글리세롤, catalase, 없이 복잡 한 10% 올레산 포도 당 0.05와 보충 트윈-80%) 0.5 세600 를 37 ° C에 중간 서 (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>M-OADC-TW에 문화를 희석 (1시 10분의 시리즈는 박테리아의 희석). 접시는 박테리아의 희석 (105, 106, 107, 108) CFU의 수 있도록 선택적 7 H 11 접시에 3 중에.</li>
	<li>37 ° C에 또는 식민지 정확 하 게 계산 될 수 있는 때까지 4 주에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>8,534 x g는 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안에 세균성 inoculum 원심 한 번 식 염 수 10 mL와 펠 릿을 세척 (0.9 %NaCl) 염 분의 15 mL에 펠 릿을 다시 중단 (0.9 %NaCl).</li>
</ol>2.에 어로 졸 감염 매디슨 챔버를 사용 하 여 마우스의
<ol><li>1 주일에 대 한 새로운 환경에 적응 하는 쥐를 수 있습니다.</li>
	<li>챔버에 그들을 로드 하기 전에 마우스 무게.</li>
	<li>3 코드 전원 스트립에 연결: 메인 챔버 전원, 진공 펌프와 공기 압축기를 순서 대로.</li>
	<li>유리 용기는 조심 스럽게 나사. 유리 항아리 biosafety 내각에 고 염 분의 15 mL에 도전 inoculum을 추가 (0.9 %NaCl) 달성 하기 ~ 104 -106 CFU 폐에 박테리아의.</li>
	<li>Biosafety 내각에서 유리 항아리의 뚜껑을 닫습니다. 분무기 단위에 항아리를 연결 하 고 (입구) 하단은 항아리에서 액체의 수준 아래 인치의 4 분의 1에 대 한 수직 스테인리스 튜브를 조정.</li>
	<li>챔버로 (챔버는 최대 90 마우스를 수용할 수) 실험에 필요한 모든 동물을 로드 하 고 문을 모든 래치를 닫습니다.</li>
	<li>메인 (룸) 확인 공기 흐름 미터. (공) 부동의 센터 약 50 L/분으로 왼쪽에 규모 측정 실행 확인 하십시오.</li>
	<li>챔버의 제어판에서 시작 단추를 누릅니다. 규모에 4 L/min으로 압축기 공기 흐름 미터 (왼쪽에 작은 미터)를 통해 공기 흐름 속도 설정 합니다. 시각적으로 도전 inoculum는 되 고 nebulized 되도록 확인 합니다.</li>
	<li>15 분 후 제어판의 앞에 빨간 불이 나타나고 음성 신호는 실행의 끝을 나타냅니다 때 타이머를 다시 설정 하려면 제어판의 오른쪽 아래 모서리에 리셋 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>출시 진공 챔버의 문에 작은 빨간 버튼을 누른.</li>
	<li>약 실 문 열고 동물을 제거 합니다. 다시 그들의 감 금 소에는 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>유리 분무기 단지를 제거 하 고, 누설 방지 운송 컨테이너에 배치. 생물 안전 캐비닛 내부의 컨테이너를 놓고 지정된 폐기물 컨테이너에 도전 정지를 삭제.</li>
	<li>생물 학적 가방 안에 사용된 분무기 단지를 놓고는 압력솥에 수송을 위한 부 대를 밀봉 합니다.</li>
	<li>감염 프로시저의 끝에, 버퍼링 된 페 놀 및 70% 에탄올과 챔버의 내부를 스프레이 하 고 10 분 동안 앉아 챔버를 허용 합니다.</li>
	<li>그런 다음 모든 액세스할 수 있는 내부 표면 아래로 매우 철저 하 게 닦아. 모든 오염 된 종이 타 올, 등의 처분. 생물 학적 쓰레기. 압력솥에서 쓰레기 컨테이너를 낭비 하 고 분무기 항아리를 사용.</li>
	<li>영상 시간 포인트까지 제약 실에서 다시 동물을 놓습니다.</li>
	<li>이미징의 날, 이미징 방에 보조 용기에 동물을 전송 합니다.</li>
</ol>3. 동물 마 취
<ol><li>쥐와 isoflurane 사용자 정의 가스 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize.</li>
	<li>각 마 취 단위 위에 있는 두 개의 숯 필터 용기 무게.</li>
	<li>무게는 초기 무게 위에 50 g 경우 새로운 용기를 바꿉니다.</li>
	<li>절차에 대 한 충분 한 isoflurane 되도록 기화 장치를 확인 하십시오.</li>
	<li>챔버 내부에 이미징 코 콘 홀더를 배치 합니다. 코 콘 절차에 필요한 수 놓고 코 콘 차단제와 나머지 오프닝을 밀봉 합니다.</li>
	<li>고압 실린더에서 산소 공급을 켭니다 고 55 psi에 그것을 설정 합니다.</li>
	<li>마 취 단위 있는 피난 펌프를 켜고 8 L/min으로 설정.</li>
	<li>마 취 단위 있는 산소 토글 설정.</li>
	<li>마 취 유도 실 1.5 L/분 차례에 가스의 흐름 가스 흐름을 설정 하에 가스 흐름을 켭니다.</li>
	<li>가스 흐름 0.25 L/분 차례에 가스의 흐름 가스 흐름을 설정 하려면 이미징 챔버를 켭니다.</li>
	<li>켜고 isoflurane 기화 기 2-2.5%에 설정 합니다. 수와 isoflurane 기화 (~ 20 g의 무게는 마우스에 대 한 2-2.5%, 무게 300 g 기니 피그에 대 한 4%)에 다이얼을 회전 하 여 실험을 위해 사용 되는 동물의 무게에 따라 isoflurane 수준을 조정 합니다.</li>
	<li>마 취 약 실에 쥐를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 마 취 유도 약 실에 가스 흐름을 켭니다.</li>
	<li>5-10 분까지 완전히 마 취 마 취 유도 실에서 쥐를 둡니다.</li>
	<li>일단 쥐 취는 이미징 동안 그들을 보호 하기 위해 눈에 광 연 고를 적용.</li>
	<li>그들의 코는 이미징 절차 동안 쥐의 마 취를 촉진 하기 위하여 원뿔에 배치 되도록 복 부 또는 sternal recumbency에 쥐를 놓습니다.</li>
</ol>4. 기자 효소 형광 (REF) 이미징
<ol><li>주사는 감염으로 복 주입 제어 마우스에 의해 기판 (20 µ M, 무게의 2.5 µ L/g). 쥐 1 분 미만 대 한 이미징 챔버 내부 마 취 받고 있다.</li>
	<li>이미징 시스템을 시작 합니다.</li>
	<li>초기화를 클릭 하 여 시스템을 초기화 합니다. 온도 바 녹색으로 바뀝니다 때까지 기다립니다. 참고: 이미징 챔버 이미징 동안 동물의 체온을 유지 하기 위해 온수 플랫폼으로 구성 됩니다.</li>
	<li>영상 수집 설정, 형광을 선택 | 전체 동물에 대 한 트랜스-조명 또는 폐 조직에 대 한 피 조명 수집 컨트롤 패널에서 오버레이 및 구조.</li>
	<li>단일 마우스 및 램프 수준 높은 b 보기의 필드를 설정 합니다.</li>
	<li>780에서 자동, 중간 binning, 2-3 f/정지, 그리고 여기 745 nm 및 방출 필터에 필터에 대 한 노출 시간을 설정 840 nm nm.</li>
	<li>시퀀스 설정에 대 한 시퀀스 설정 클릭, 폐 지역에서 9-12 트랜스 조명 포인트를 선택 합니다.</li>
	<li>이미지 수집에 대 한 취득을 클릭 합니다.</li>
	<li>케이지 후 이미징에 다시 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>완전히 복구 될 때까지 마우스를 모니터링 하거나 실험의 시간 포인트에서 이미징 하는 경우 CFU 측정을 위해 희생. 수정된 Karnofsky 점수 후 이미징 쥐의 모니터링을 수행 합니다.</li>
</ol>5입니다. REF 이미징 분석
<ol><li>이미징 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>찾아보기 아이콘을 클릭 하 여 이미지 파일을 로드 합니다.</li>
	<li>스펙트럼 unmixing 스펙트럼 Unmixing 도구 팔레트에서 클릭을 unmix 하는 데 필요한 스펙트럼을 클릭 합니다. 시작 unmixing 클릭 하십시오.</li>
	<li>광학 표면 재건에 대 한 표면 지형 클릭.</li>
	<li>에 등, 모피 마우스 따라를 선택 하 고, 표면 생성을 클릭 합니다.</li>
	<li>이미지 자르기 그리고 관심 영역에 대 한 임계값 이미지를 설정 합니다. 완료를 클릭 합니다.</li>
	<li>장기 등록에 대 한 3 차원 광학 도구 드롭다운 메뉴에서 등록 탭으로 이동 합니다.</li>
	<li>등록 기관 아틀라스의 장기.</li>
	<li>기관 크기 또는 패널 등록 도구에 있는 온/오프 변환 도구를 사용 하 여 생성 된 표면 지형에 위치를 조정 합니다.</li>
	<li>형광 단층 (휙) 3D 재구성, 이동한 선택 분석 탭 선택 이미지 분석에 대 한 포함 될, 이미지 전송 형광 정규화 (NTF) 효율성을 종류, 시작을 클릭 합니다.</li>
	<li>모든 선택에 확인 하 고 데이터 미리 보기 탭에서 재구성.</li>
	<li>형광 정량화에 대 한 관심의 기관에 투자 수익 큐브 관심 영역 (ROI) 도구를 추가 하 고 관심의 장기를 큐브 크기 조정 이동 합니다. 클릭 3D ROIs를 측정.</li>
	<li>투자 수익 측정 창에서 3D ROI 측정 이동, pmolM-1c m-1을 소스 복 및 측정 단위를 데이터 형식을 선택 합니다.</li>
	<li>저장 하거나 날아다니는 3D 재구성 분석 결과 그림 또는 데이터 파일로 내보내기.</li>
</ol>6입니다. CFU로 박테리아의 정량화
<ol><li>0.1 mL pentobarbital 나트륨 (390 mg/mL)의 복 주입 하 여 쥐를 안락사.</li>
	<li>반사 반응이 있는지 확인 하는 쥐의 발 패드를 압박 하 여 페달 반사를 확인 합니다.</li>
	<li>소독 집게와가 위를 사용 하 여 마우스에서 폐 조직 explant 폐 조직 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1 mL에 균질</li>
	<li>살 균 1 x PBS에서 폐 homogenate의 10 연속 희석을 확인 합니다.</li>
	<li>도금, 대 한 천 배지에서 20 µ L 각의 각각 희석의 3 aliquots 자리.</li>
	<li>세균성 성장 위한 37 ° C와 모니터 인큐베이터에 접시를 품 어.</li>
	<li>수 각 식민지 보육 시간 후 고 CFU로 표현 / mL 및 희석에 대 한 수정 하 여 다음 식을 사용 하 여: CFU / mL (C/V) = M x 어디 C 자리, V 당 식민지 카운트 = = 볼륨 샘플 각 접시 (mL), 및 M 주사 = 곱셈 요인 (희석 사용의 역). 참고: 경우 11 식민지 10-4의 샘플 희석에 0.002 mL의 샘플 볼륨에 대 한 한 자리에서 세 어진다, 방정식를 사용 하 여 식민지 수 산출 될 것 이다로 (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Official+American+thoracic+society/infectious+diseases+society+of+America/+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines:+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children.">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs.">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li><li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli.">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li><li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis.">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li><li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus.">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li><li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence.">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li><li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis,+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate.">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+&#946;-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence.">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with &#946;-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice.">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis.">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase.">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria.">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).</li><li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging.">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).</li><li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+fluorescence+imaging+of+bacterial+infections+in+animal+models.">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).</li><li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bacterial+infection+with+a+fiber+optic+microendoscope.">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging.">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li><li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry.">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li><li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9.">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li><li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+bacterial+infections.">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li><li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis.">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).</li><li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tuberculosis+with+endogenous+&#946;-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice.">Imaging tuberculosis with endogenous &#946;- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li><li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals.">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li><li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+tuberculosis.">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li><li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest:+characteristic+findings+and+role+in+management.">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li><li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography,+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging.">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li><li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET/CT.">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li><li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform.">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li><li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice,+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity.">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo.">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).</li><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe.">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+imaging+of+bacterial+infection+using+endoscopic+excitation+of+&#946;-lactamase+(BlaC)-+specific+fluorogenic+probe.">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of &#946;-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).</li><li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tuberculosis+diagnostics.">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li><li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+in+vivo:+recent+advances.">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li><li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats.">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717 (2017).</li><li>Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,7-disubstituted+cephalosporin+derivatives+as+beta-lactamase+substrates+and+methods+for+their+use+for+the+diagnosis+of+tuberculosis.">2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis.</a> US patent. , (2015).</li><li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Covalent+Reporter+of+&#946;-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria.">A Covalent Reporter of &#946;-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li><li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+&#946;-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus.">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of &#946;-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion:+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT.">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li><li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer:+a+case-control+study.">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li></ol>

REF, 같은 이미징 기술을 사용 하 여 강력 하 고 일관 된 데이터의 생성을 허용 하는 주요 전략 있습니다. 광학 이미징 이후 모든 방향으로 방출 하는 빛을 포착 하기 어려운, 침투의 깊이 영향을 줄 수 있는 조직에 흩어져 빛을 생성 합니다. 사용 근처 적외선 fluorophore (NIR)의 REF 700-900 nm의 Querange에 여기 및 방출 하는 파장을 갖는 이미징에 대 한 기판 포유류 조직에 의해 형광 신호의 최소한의 흡수를 용이 하 게 한다. 사용자 정의 설계 기판 NIR fluorophore, IRDye 800Cw를 끄는에 연결 하 여 건설 되었다 IRDye QC-1, 형광 공명 에너지 전송 기반 냉각 허용 락탐 반지에 의해. IRDye 우수한 조직 침투는 빛 산란 특성 및 포유류36에 분명 어떤 유해한 효과 없습니다, 24 h 형광 혈액과 기관에서 허가 되 고 신호 크게 증가 시작 후 4 h 기판 관리, 관리 후 6 h 레벨 최대에 도달.
세균 감염 복용량, 감염 복용량과 기판의 관리 시간 게시물 감염 파일럿 연구를 수행 하 여 이미징의 포인트의 모드는 크고, 복잡 한, 실험에 착수 하기 전에 표준화 되어야 한다. 파일럿 연구 크게 줄일 수 시간 및 비용 표준 절차 주요 실험 하 고 이전에 최적화 될 수 있기 때문에 동물의 많은 수를 이미징 하는 경우. 세균 중 관심 몸 전체 이미징 트랜스 조명과 epi 조명 신호 소스를 확인 하 고 상관 관계의 품질을 결정을 사용 하 여 폐 이미징 비보 전 을 사용 하 여 다음의 기관/조직에 결정 되어야 한다 박테리아와 함께 현재8번호. 파일럿 연구는 탐지의 문 턱, 기술의 동적 범위 이미징에 대 한 최적의 실험 조건의 결정에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.
그것의 높은 감도 자연 M. 결핵 을 이미지 하는 능력으로 이미징 REF를 사용 하 여의 주요 장점은 다른 형광 및 발광 전략에 비해 긴장. REF 이미징 모든 M. 결핵 임상 격리 및 결핵-복잡 한 긴장에 보존 BlaC 촉매로 강력한 효소를 사용 합니다. REF 이미징의 큰 감도 촉매 그만큼 BlaC의 조합에 주인 세포에 의해 쪼개진된 형광 제품의 유지와 함께 예정 이다. 신호 지속적으로 증가 기판은 결과 감염 된 세포와 조직 내에서 신호의 거의 무한 한 빌드에 사용할 수 있습니다. 이미징 REF의이 증가 된 감도 이미징의 다른 방법에 비해 두 시험관에 M. 결핵 의 특정 검색 허용 한다 vivo에서8,,2324, 29.
REF 이미징 세균 검출 감염 모델, 어느 실험실 동물8,37 또는 인간의 임상 자료29,38 의 직접 응용 프로그램을 사용 하는 유전 수정 없이 사용할 수 있습니다. . REF는 fluorogenic 기판 kinases, 프로 테아 제, β-galactosidases, ureases, 등 BlaC 이외의 수많은 효소 목표를 위해 개발 될 수 있기 때문에 다양 한 병원 체39,40, 이미지를 감지 하 사용할 수 있습니다. 그러나, 주의 생각 있도록 대상에 주어져야 한다 그것은 이미징에 대 한 최적의 특성 표시 합니다. BlaC이이 전략의 성공적인 응용 프로그램을 보장 하는 특성에 대 한 좋은 모델 효소를 나타냅니다. REF 이미징 제공 즉시 읽어 폐에 존재 하는 세균 중에 감염, 시의 결핵 병, 세균성 수의 결심은 일반적으로 3 ~ 6 주, 필요로 하기 때문에 하지만 더에 크게 진행 속도 이 이렇게 훌륭한 제의로 저장할 것 이다 급속 한 성장 하는 생물 시간. REF는 carcinomas 결핵, 결 절 성 병 변 환자41,42의 진단에 중요 한 문제에서에서 차별 또한 사용 수 있습니다. REF 가속 변환 결핵 영상 소설 도구 역할 하 고 심지어 잠재적으로 치료 결과의 빠른 예측을 허용 하는 인 간에 게 적용할 수 있습니다.

M. 결핵 의 느린 성장 속도 결핵1,2,3의 신속한 진단에 주요 장애물입니다. 문화 기반 진단 소요 주 결과를, 반면 acid-fast 얼룩은 어린이5 와 인간 면역 결핍 바이러스6,7공동 감염 환자에서 진단 제한4 . 광학 이미징 기술은 최근 결핵8,9를 위한 전통적인 진단 방법의 대 안으로 인정 되었습니다. 형광 및 생물 발광 광학 실시간10,11,12,,1314, 살아있는 동물에 M. 결핵 의 이미지를 사용할 수 있습니다. 15,,1617,,1819. 광학 이미징 M. 결핵20,,2122감염의 신속 하 고 구체적인 평가의 이점이 있습니다.
우리는 REF를 사용 하 여 라이브 쥐에 M. 결핵 의 광학 이미징에 대 한 세부 정보를 설명 합니다. 이 방법은 매우 구체적이 고 민감한23,24 이며, 다른 광학 방법에 유사한 적은 결핵 (TB) 이미징25, 단층 촬영 (CT)26, 자석 등의 다른 방법 보다 비싼 공명 영상 (MRI)27, 그리고 F-fluorodeoxyglucose 양전자 방출 단층 촬영/CT (F FDG PET/CT)28. REF 세균성 효소에 의해 쪼개 짐에 따라 형광 제품8,29를 생산 하는 사용자 지정 형광 또는 발광 기질을 활용 합니다. 따라서, 재조합 mycobacterial 기자 스트레인30,31를 요구 하지 않기의 이점이 있다. 설명 무서 워 기판은는 형광 색소와 끄는 BlaC (β-lactamase), 자연스럽 게 결핵-복잡 한 진 균8, constitutively 표현에 의해 분해 되는 β 락탐 반지에 의해 연결 된로 구성 32. 박테리아는 직접 많은 크기 순서와 M. 결핵의 민감한 감지에 의해 증폭 수 REF 촉매 활동으로 인해 신호를 생성.
이 연구에 사용 된 REF 기판 생체에 우수한 조직 침투 있으며 감소의 긴 파장 때문에 배경. 이 긴 파장 기판으로 그것은 거의 100의 M. 결핵 에 대 한 탐지의 문 턱을 달성 하는 것 콜로 니 형성 단위 (CFU) 생체 외에서 그리고 < 쥐 vivo에서 (전체 동물)8, 폐에서 1000 CFU 33. REF가 래, 임상 자료와 환자 마이크로 내 시경 시스템16,32,,3334 그것의 높은 감도 및 특이성 때문에 직접 진단 도구로 사용할 수 있습니다. REF는 BlaC, 자연스럽 게 생산된 세균 효소를 사용 하 여 검색 모든 긴장에 때문에 어떤 결핵 임상 스트레인에 적용할 수 있습니다. 이러한 특성 pathogenesis의 분석 뿐만 아니라 REF 일반적 치료 촉진 하기 전 임상 결핵 연구에 유용한 도구를 이미징 및 백신 평가 하지만 또한 궁극적으로 결핵 진단에 적용할 수 있습니다. 환자입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:163px;">VETONE</td>
			<td align="right" style="width:119px;">501027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:216px;">CNIR800</td>
			<td style="width:163px;">Custom synthesized</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fatal Plus solution</td>
			<td style="width:163px;">Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H9 Middlebrook broth</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OADC Middlebrook enrichment</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sporcidin</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;">RE-1284F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H11 Middlebrook Agar</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Madison Chamber</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td align="right">124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XGI-8-gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Living Imaging software</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transparent nose cones</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M. tuberculosis strain CDC1551</td>
			<td style="width:163px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td>
			<td style="width:163px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

기자 효소 형광 (REF) 효소 이미징 또는 형광 또는 생물 발광에 의해 감지에 대 한 관심의 대상 생물에 존재에 대 한 관련 된 기질을 활용 합니다. 우리는 BlaC, constitutively 모든 M. 결핵 종자로 표현 하는 효소를 이용 한다. REF는 감염 된 쥐의 폐에 있는 박테리아의 급속 한 정량화를 허용 한다. 쥐의 동일한 그룹 많은 시간 포인트, 크게 비용 절감, 보다 신속 하 게 박테리아를 열거, 호스트 병원 체 상호 작용에 비 발한 관측을 허용 하 고 통계적 인 힘을 증가 하는 그룹 당 더 많은 동물을 쉽게 유지 됩니다 때문에 몇 군데 있습니다. . REF는 매우 BlaC 효소 기자의 촉매 특성으로 인해 과민 하 고 특정 사용자 지정 flourescence 공명 에너지 전달 (무서 워) 또는 fluorogenic 기판 사용. REF 필요 하지 않습니다 재조합 종자, 일반 호스트 병원 체 상호 작용을 보장. 800에서 최대한 방출 무서 워 기판 사용 M. 결핵 감염의 영상 설명 nm. 기판의 파장 포유동물에 중요 한 깊은 조직 이미지를 수 있습니다. 우리는 어로 졸 감염 M. 결핵, 쥐의 마 취, REF 기판, 광학 이미징의 관리와 쥐의 개요 것입니다. 이 방법은 호스트 병원 체 상호 작용 및 M. 결핵를 대상으로 하는 항생제의 효능 평가를 성공적으로 적용 되었습니다.

REF 감염된 제어 마우스 함께 M. 결핵 감염 쥐의 영상 그림 1A에 나와 있습니다. 감염 된 쥐 생성을 크게 (P = 0.0057) 높은 형광 신호 제어 기판 관리 시에 비해 감염 된 후 6 주에 폐에서. M. 결핵 REF를 사용 하 여에 대 한 치료 효능을 공부 하는 전형적인 시간 코스 1, 2, 4, 6, 15, 그 주에 이미징 수 24 후 감염. 형광 강도 피 조명 폐 조직 (그림 1B)에 대 한 사용 하 여 정량 이다. 감염 된 쥐의 폐에서 주 6 주 2에서에서 일관 되 게 증가 신호 REF 성공적으로 M. 결핵 vivo에서감지할 수 나왔다. 나중에 시간 (그림 1B) 컨트롤 마우스의 배경 신호에 한 방울 몸에 있는 증가에 표시 될 수 수 질량과의 여기 파장 침투를 줄여 6 주 동안 쥐의 볼륨. M. 결핵 감염 된 생쥐에서 형광 소스의 3D 날아다니는 재건은 그림 2A에 표시 됩니다. 이미지 시퀀스는 여러 개의 트랜스 조명 시점에 동일한 여기 및 방출 필터의 시리즈를 사용 하 여 마우스에 획득 됩니다. 이러한 이미지 시퀀스는 동물 주제 내에서 형광 소스 배포를 위한 3D 날아다니는 재건을 위해 사용 됩니다. 그림 2 A-D 마우스 단층 촬영 폐 기관 등록의 서로 다른 방향 (코로나, 화살 및 transaxial)을 보여 줍니다. NTF 효율 재건 품질 그림 2E에서 표시 됩니다 확인 하기 위해 매핑됩니다. NTF 중립 밀도 필터 캡처한 빼서 추가 이미지를 통해 트랜스 조명 이미지에서 배경 빛 누설 수 있습니다. 동일한 방출 필터와 오픈 여기 필터 (그림 2E-시뮬레이션)을 주고 측정 전송 이미지에 특정 여기 필터 (그림 2전자 측정)로 찍은 이미지 정규화 제작한 기판 혼자 신호입니다. 유사한 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율 모두 수평 (그림 2F) 프로필과 거의 0% 비율 오류 (그림 2E % 오류)와 세로 (그림 2G) 프로필 감소 및 향상 된 신호 지역화 유물과 감도와 좋은 품질의 3 차원 재구성의 증거를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> 그림 1 . 참고로 M. 결핵 의 이미징 (A) vivo에서 이미지 마우스 감염 되지 않은 및 2, 4, 그리고 6 주 후 감염에 M. 결핵 감염의입니다. 색상 막대 낮은 (노란색)에서 높은 (레드) c m2 당 초당 광자에 형광 성 신호의 강도를 나타냅니다. (B) 마우스 M.결핵 감염에서 형광 강도의 정량화. 형광 두 컨트롤 (블랙)에 대 한 값을 하 고 감염된 (레드) 각 시간 지점에 대 한 표준 오류와 함께 표시 됩니다. 결과의 의미는 학생 t에 의해 결정 되었다-테스트, p 값의 < 0.05 중요 하 게 고려 했다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> 그림 2 . M.결핵 감염 된 생쥐에서 형광 소스의 3D 날아다니는 재건. 마우스 단층 촬영에서 서로 다른 방향으로; A) 화관, B) 화살, 및 C) transaxial D) 폐 기관 등록. 관심 (ROI) 3D 영역 소스 측정을 위한 폐에서 빨간색 큐브로 표시 됩니다. (E) NTF 효율 측정 및 재건 품질 검사에 대 한 시뮬레이션의 지도. 3D 재구성 (유사한 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율)의 좋은 품질을 제공 하는 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율 프로 파일 비교 되었다. F) 수평 및 G) 수직 신호 대표 측정된 (파란색) 프로필 (빨간색) NTF 효율 곡선을 시뮬레이션 하며 수평 및 수직 빨간 막대는 소스 위치를 나타냅니다. 색상 막대 낮은 (파란색)에서 높은 (레드) c m2 당 초당 광자에 형광 성 신호의 강도를 나타냅니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence at JoVE.com

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

7.3K 조회수.  Texas A&M Health Science Center. 결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.

비디오: Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

의 샘플 준비<em&gt; Mycobacterium 결핵</em핵 자기 공명 Metabolomic의 연구&gt; 압축을 풉니 다

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

연구

면역학 및 감염병학

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

다중 약물 내성을 보여<em&gt; 결핵균</em&gt; 증폭 마이크로 어레이

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

에 대한 기능성 연구를위한 3D 인간의 폐 조직 모델<em&gt; 결핵균</em&gt; 감염

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

18FDG PET/CT 영상 공부 결핵균 감염 및 비 인간 영장류에서 치료 도구로 서의 분석

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...