이 프로토콜의 전반적인 목표는 마이크로 유체와 마이크로 전극 어레이의 사용을 결합하여 신경 통신 및 축산 신호 전파를 연구하는 데 적합한 플랫폼을 생성하는 방법을 입증하는 것입니다. 안녕하세요, 나는 파울로 아구아르이고 나는 INEB에서 신경 공학 및 전산 신경 과학 연구소의 PI입니다, 포르투 대학에서 생물 의학 공학을 코딩하는 데 사용, 포르투갈. 신경 회로에서 정보 전송을 이해하는 것은 신경 과학에서 가장 큰 과제 중 하나입니다.
오늘, 나는 우리가 우리의 실험실에서 여기에서 개발 된 마이크로 유체 및 소프트웨어 도구와 개별 마이크로 액추에이터 어레이를 결합하여 전파 작업 잠재력을 감지하고 특성화 할 수있는 방법을 보여 드리겠습니다. 우리는 다양한 연구, 즉 신경 코딩 및 디코딩, 감각 뉴런과 다른 세포 유형 간의 통신에서이 설정을 사용합니다. 우리는이 프로토콜의 시각적 데모가 중요하다고 생각합니다.
마이크로 유체 및 마이크로 전극 어레이 조립은 관리에 어려움이 있고 프로토콜을 재현하는 것만으로는 재현하기가 어렵기 때문에. 시장의 경우, 이 플랫폼의 컬트 판매는 기존의 ABA로서 간단하지 않으며, 세포 앉아 물건과 배양 자석에 특별한주의가 필요합니다. 이 설정을 통해 잘 통제된 환경에서 전파 속도 및 방향과 같은 여러 통신 관련 특성을 연구할 수 있습니다.
기록 절차는 간단하지만 데이터 분석에는 지식과 올바른 계산 도구의 사용이 필요합니다. 세포 가 앉아 전날, 비닐 테이프로 청소하여 마이크로 유체 장치를 준비하여 시작합니다. 장치에 테이프를 부드럽게 눌러 마이크로 유체의 모든 영역에 도달합니다.
공기 플라즈마는 표면을 청소하고 더 친수성 만들기 위해 3 분 동안 MEA를 청소합니다. 라미나르 플로우 후드 내부에 미세 유체를 70% 에탄올에 담급합니다. 공기를 건조하게 하십시오.
각 MEA를 페트리 접시에 놓고 15분간 UV 광 노출로 소독합니다. 그런 다음 500 마이크로리터의 PEI 솔루션이 있는 MEA의 중앙 지역으로 이동하십시오. 적어도 한 시간 동안 배양하십시오.
라미나르 플로우 후드 내부에 는 MEA 표면에서 PEI 코팅 용액을 흡인시합니다. 그런 다음, 멸균 수의 1 밀리리터로 MEA를 네 번 씻으시다. 멸균 현미경의 도움으로, 라미나르 흐름 후드 내부에 배치.
MEA 칩을 중앙에 두어 MEA의 중앙 영역에 멸균 수분 1밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 마이크로 유체 장치를 MEA 표면 위에 놓고 MEA의 마이크로홈 마이크로 액티브 그리드를 신중하게 정렬합니다. 과도한 물을 흡인하고, 37도에서 하룻밤 을 배양하여 완전한 부착을 허용합니다.
다음 날, 라미닌으로 우물을 적재하고 다시 배양합니다. 배아 수고를 수집한 후 전두엽 피질 해부로 진행한다. 조심스럽게 뇌를 노출하여 시작, 집게의 쌍을 사용하여.
그런 다음, 부드럽게 그것의 구멍에서 뇌를 제거합니다. 차가운 H-HBSS로 덮습니다. 있는 경우 후각 전구를 제거하고 폐기합니다.
마지막으로 전두엽 피질을 해부합니다. 수막의 완전한 제거를 확인합니다. 두 반구에 대해 이 절차를 반복합니다.
연구에 필요한 뇌의 수에 대한. 라미나르 플로우 후드 내부에는 이전에 H-HBSS의 총 5밀리리터로 해부된 피질 조각을 수집합니다. 그런 다음 이러한 단편을 멸균 15 밀리리터 만성 튜브로 이송합니다.
파이펫은 피질 파편을 포함하는 튜브에 2.3 밀리리터의 갓 준비된 트립신 용액을 가지고 있다. 서스펜션을 혼합하고 37도에서 15분간 배양합니다. 5분마다 동요합니다.
그런 다음 트립신을 포함하는 상체를 버리고 FBS를 포함하는 H-HBSS를 추가하여 나머지 트립신을 비활성화합니다. 부드럽게 동요합니다. 피질 파편이 정착하고 상체를 폐기하십시오.
H-HBSS로 두 번 세척하고 FBS를 제거하고 상체를 다시 폐기하십시오. 보충 신경 기저 매체를 추가하고 천천히 위아래로 파이프를 통해 조직을 기계적으로 해리시화합니다. 세포 여과기를 통해 소금 현탁액을 필터링하여 나머지 조직을 폐기하십시오.
그런 다음 셀 서스펜션 20 마이크로리터를 트라이판 블루 20 마이크로리터와 혼합합니다. 10 마이크로리터를 노이바우어 챔버로 옮기고 실행 가능한 셀수를 계산합니다. 세포가 앉기 직전에 마이크로 EF의 모든 우물에서 라미닌을 제거하십시오. 그런 다음 축산 구획의 각 웰에 소량의 상체 매체를 추가합니다.
셀 서스펜션 5마이크로리터를 소말 구획에 천천히 시드합니다. 기판에 세포 부착을 허용하기 위해 1 시간 동안 37도에서 배양하십시오. 1시간 후, 따뜻한 보충 매체로 각 웰을 부드럽게 채웁니다.
셀 분리를 피하기 위해 작은 볼륨을 추가합니다. 그런 다음 마이크로 EF를 인큐베이터로 전송합니다. 여기에 시험관 내 5 일 에서 문화를 보여 주었다.
1주일 후, 문화는 자발적인 활동을 하기 시작합니다. 녹음을 수행하기 전에 온도 컨트롤러를 사용하여 프리 앰프 화재 베이스 플레이트를 먹습니다. 그런 다음 마이크로 EF를 프리앰프에 놓고 뚜껑을 닫고 래치합니다.
기록하려면 멀티 채널 실험 소프트웨어를 엽니다. 샘플링 속도를 20킬로헤르츠로 설정합니다. 필터와 기록된 상자를 드래그하고 순차적으로 연결하여 원시 데이터와 필터링된 데이터를 모두 기록합니다.
데이터 수집을 시작하여 신호를 시각화하고 빠른 레코드를 설정합니다. 기록된 데이터는 멀티 채널 분석기를 사용하여 신속하게 탐색할 수 있습니다. 여기서 마이크로홈을 따라 신호 전파가 이미 명확합니다.
이 전파 이벤트를 식별하고 특성화하려면 마이크로 스파이크 사냥꾼에서 녹음을 엽니다. 파일 정보 버튼을 클릭하여 기록 설정에 액세스하고 분석을 위해 마이크로 전극 세트를 선택합니다. 이벤트 검색 전파를 위한 임계값을 설정합니다.
그리고 빠른 읽기 데이터. 소프트웨어는 모든 감지 된 시퀀스를 나열합니다. 그런 다음 사용자는 마이크로 전극 쌍 사이의 정보로 전파 속도를 평가하고 상호 거리와 교차 상관 관계를 기반으로 평가할 수 있습니다.
화학 그래프 도구를 사용하면 사용자가 전파 속도를 수동으로 추정할 수 있습니다. 전파 이벤트가 표시됩니다. 마이크로그루브 내의 4개의 마이크로 전극을 따라 검출되었습니다.
이러한 이벤트는 Rasser 플롯으로 나타낼 수 있습니다. 다음은 기록의 처음 2 분 동안 11 마이크로 그루브를 따라 전파 활동입니다. 높은 활성 마이크로 그루브는 정중하게 노란색과 빨간색으로 표시됩니다.
11 마이크로홈을 따라 활동의 동기화를 확인합니다. 동기화는 활동 속도와 독립적입니다. 두 마이크로그루브의 순간 발사 속도의 변화에서 볼 수 있듯이.
마이크로그루브는 또한 상자와 수염 플롯에 표시된 바와 같이 축상 신호 증폭기역할을 합니다. 우리는 MEA와 마이크로 유체를 결합하는 방법을 보여 주었다, 그들에 뉴런을 배양하는 방법. 또한 이러한 기록에서 의미 있는 데이터를 기록하고 추출하는 방법도 있습니다.
우리는이 데모가 당신의 연구에 유용 할 수 있기를 바랍니다, 왜 당신은 신경 회로에서 통신을 공부하고 싶었을 수 있습니다.
