L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare come combinare l'uso della micro fluidica con array di micro elettrodi per generare la piattaforma adatta allo studio della comunicazione neuronale e della propagazione del segnale assonale. Ciao, sono Paulo Aguiar e sono il PI del Neuro engineering and Computation Neuroscience Lab dell'INEB, utilizzato per codificare per l'ingegneria biomedica presso l'Università di Porto, in Portogallo. Comprendere la trasmissione di informazioni nei circuiti neurologici rimane una delle maggiori sfide nelle neuroscienze.
Oggi vi mostrerò come possiamo combinare i singoli array di micro attuatori con micro fluidatrici e strumenti software sviluppati qui nel nostro laboratorio, per rilevare e caratterizzare i potenziali di azione propagazione. Usiamo questa configurazione in una varietà di studi, vale a dire codifica neurale e decodifica, e nelle comunicazioni tra neuroni sensoriali e altri tipi di cellule. Riteniamo che la dimostrazione visiva di questo protocollo sia fondamentale.
Poiché l'assemblaggio di array di micro fluidi e micro elettrodi è quella difficoltà nella gestione e difficile da riprodurre semplicemente riproducendo protocolli. Per il mercato, le vendite cultary su questa piattaforma non sono semplici, come gli ABA convenzionali, e richiede un'attenzione speciale per la roba da seduta cellulare e i magneti di coltura. Questa configurazione ci consente di studiare diverse proprietà relative alla comunicazione, come la velocità e la direzione di propagazione, in un ambiente ben controllato.
Sebbene la procedura di registrazione sia semplice, l'analisi dei dati richiede la conoscenza e l'uso dei giusti strumenti computazionali. Il giorno prima della seduta cellulare, iniziare preparando i dispositivi micro fluidici, pulendo con nastro vinile. Premere delicatamente il nastro contro il dispositivo per raggiungere tutte le aree del micro fluidico.
Il plasma d'aria pulisce il MEA per tre minuti per pulire la superficie e renderla più idrofila. All'interno di una cappa a flusso laminare, immergere la micro fluidica nel 70% di etanolo. Lasciare asciugare all'aria.
Mettere ogni MEA in una piastra di Petri e sterilizzare di 15 minuti di esposizione alla luce UV. Quindi, vai nell'area centrale di MEA con 500 microlitri di soluzione PEI. Incubare per almeno un'ora.
All'interno di una cappa di flusso laminare, aspirare la soluzione di rivestimento PEI dalla superficie MEA. Quindi, lavare i MEA quattro volte con un millilitro di acqua sterile. Con l'aiuto di un microscopio sterile, posto all'interno della cappa di flusso laminare.
Centrare il chip MEA e aggiungere un millilitro di acqua sterile all'area centrale del MEA. Quindi, posizionare il dispositivo micro fluidico sopra la superficie MEA e allineare attentamente la griglia micro attiva dei microgrooves del MEA. Aspirare l'acqua eccessiva e incubare durante la notte a 37 gradi, per consentire un fissaggio completo.
Il giorno successivo, caricare i pozzi con laminina e incubare di nuovo. Dopo aver raccolto i sussedi dell'embrione, procedere alla dissezione della corteccia prefrontale. Inizia esponendo attentamente il cervello, usando un paio di forcep.
Quindi, rimuovere delicatamente il cervello dalla sua cavità. Coprirlo con H-HBSS freddo. Quando presente, rimuovere e scartare i bulbi olfattivi.
Infine, sezionare la corteccia prefrontale. Assicurarsi la completa rimozione delle meningi. Ripetere questa procedura per entrambi gli emisferi.
Per il numero di cervelli necessari per il tuo studio. All'interno di una cappa di flusso laminare, raccogliere i frammenti della corteccia precedentemente sezionati in un totale di cinque millilitri di H-HBSS. Quindi, trasferire questi frammenti in un tubo cronico sterile da 15 millilitri.
Pipetta, e hanno 2,3 millilitri di soluzione di triptina appena preparata al tubo contenente i frammenti di corteccia. Mescolare la sospensione e incubare a 37 gradi per 15 minuti. Agitate ogni cinque minuti.
Quindi, scartare il supernatante contenente la tripina, aggiungere H-HBSS contenente FBS, per inattivare la tripina rimanente. Agitare delicatamente. Lascia che i frammenti della corteccia si sistemino e scarta il supernatante.
Lavare due volte con H-HBSS, per rimuovere l'FBS, e scartare di nuovo il supernatante. Aggiungere il mezzo basale neurale integrato e dissociare meccanicamente i tessuti tubazioni lentamente su e giù. Scartare il tessuto rimanente filtrando la sospensione del sale attraverso un colino cellulare.
Quindi, mescolare 20 microlitri di sospensione cellulare con 20 microlitri di tripano blu. Trasferire 10 microlitri in una camera Neubauer e contare il numero di cellule vitali. Immediatamente prima della seduta cellulare, rimuovere la laminina da tutti i pozzi del micro EF. Quindi, aggiungere il piccolo volume di mezzo supernatante ad ogni pozzo del compartimento assonale.
Semina lentamente cinque microlitri di sospensione cellulare nel compartimento somalo. Incubare a 37 gradi per un'ora per consentire l'attacco cellulare al substrato. Dopo un'ora, riempire delicatamente ogni bene con mezzo integrato caldo.
Aggiungere piccoli volumi per evitare il distacco delle celle. Quindi, trasferire il micro FE in un incubatore. Qui viene mostrata una cultura a cinque giorni in vitro.
Dopo una settimana, le culture iniziano a mostrare attività spontanea. Prima di eseguire le registrazioni, utilizzare un regolatore di temperatura per mangiare la piastra di base del fuoco preampere. Quindi, posizionare il micro EF sul preamplificatore e chiudere e agganciare il coperchio.
Per registrare, aprire il software sperimentale multicanale. Impostare la frequenza di campionamento su 20 kilohertz. Trascinare il filtro e le caselle registrate e collegarle in sequenza per registrare dati non elaborati e filtrati.
Avviare l'acquisizione dei dati per visualizzare i segnali e registrare rapidamente. I dati registrati possono essere esplorati rapidamente utilizzando l'analizzatore multicanale. Qui, la propagazione del segnale lungo i microgroovi è già chiara.
Per identificare e caratterizzare questi eventi di propagazione, apri la registrazione nel cacciatore di micro punte. Fare clic sul pulsante informazioni file per accedere alle impostazioni di registrazione e selezionare il set di microelettri elettrodi per l'analisi. Impostare la soglia per la propagazione del rilevamento degli eventi.
E leggere rapidamente i dati. Il software elencherà tutte le sequenze rilevate. L'utente può quindi valutare la velocità di propagazione come informazione, tra coppie di micro elettrodi e in base alla loro inter distanza e correlazione incrociata.
Lo strumento grafico chemio consente all'utente di stimare manualmente la velocità di propagazione. Qui viene mostrato un evento di propagazione. Rilevato lungo quattro micro elettrodi all'interno di un microgroove.
Questi eventi possono essere rappresentati in un complotto Rasser. Ecco l'attività di propagazione lungo 11 microgroovi per i primi due minuti di registrazione. Il microgroove ad alta e bassa attività si colora di giallo e rosso, rispettosamente.
Si noti la sincronizzazione dell'attività lungo gli 11 microgroovi. La sincronizzazione è indipendente dal tasso di attività. Come si può vedere nelle variazioni del tasso di cottura istantaneo dei due microgroovi.
I microgroovi funzionano anche come amplificatori di segnale assonali, come mostrato nella scatola e nella trama dei baffi. Vi abbiamo mostrato come combinare la micro fluidica con i MEA e come colturare i neuroni su di essi. Inoltre, come registrare ed estrarre dati significativi da tali registrazioni.
Speriamo che questa dimostrazione sia utile per la tua ricerca, perché potresti voler studiare la comunicazione nei circuiti neurali.
