이 방법은 Drosophila melanogaster에 있는 바이러스성 감염을 효과적으로 설치하는 방법에 관하여 바이러스 호스트 상호 작용 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 나노 주입 방법은 바이러스의 감염 복용량의 정확한 제어를 허용하고 쉽게 다른 미생물 병원균과 감염에 적용 할 수있다. 1시간 동안 25도의 이산화탄소없이 완전한 슈나이더의 Drosophila 배지10 밀리리터가 있는 10센티미터 세포 배양 접시에서 밀리리터당 7번째 가능한 S2 항성 세포를 10번 씩 성장시키는 것으로 시작하십시오.
인큐베이션 도중, 완전히 된 매체의 1 밀리리터에서 0.01의 감염의 복합성에 새로 해동된 Drosophila C 바이러스 또는 DCV를 다시 중단하고 세포 배양 요리에 바이러스 해결책을 추가합니다. 그런 다음 접시를 섭씨 25도인큐베이터로 3~5일 간 반납합니다. 바이러스는 세포 형태가 흐릿해 보이고 배양 매체가 세포 파편을 나타내는 검은 입자로 가득 차있을 때 수집 할 준비가되어 있습니다.
전체 세포 배양을 영하 80도에서 숙주 세포의 용해용 15 밀리리터 튜브로 옮기기 전에 몇 번 파이프팅하여 상체를 섞는다. 바이러스의 작업 농도를 생성하려면, 원심 분리에 의해 세포 파편을 펠렛하기 전에 일정한 흔들림과 섭씨 25도 수조에서 세포 현탁액을 해동. 그런 다음 체신을 새로운 멸균 15 밀리리터 튜브로 전송하여 튜브당 최대 200 마이크로리터의 바이러스 용액을 소용돌이 및 알리쿼트합니다.
평균 바이러스 조직 배양 감염 용량을 결정하기 위해, 첫 번째 종자 10 내지 5 개의 S2 스타 세포에 100 마이크로 리터의 완전한 배지는 96 웰 플레이트의 12 행에서 열 당 8 개의 우물로. 그런 다음 접시를 섭씨 25도 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 영하 80도 저장에서 바이러스의 5 개의 튜브를 무작위로 선택합니다.
세포가 침전되는 동안, 멸균 1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브를 멸균 완전 배지 450마이크로리터로 채우고, 12일까지 10배의 현탁액을 희석시키는 멸균 완전 배지 450마이크로리터를 함유한 최초의 1.5 밀리리터 튜브에 50마이크로리터의 바이러스 스톡을 첨가한다. 인큐베이션의 끝에서, 바이러스의 각 튜브에 적절한 우물에 각 희석의 50 마이크로 리터를 추가하고 음의 제어로 열 당 하나의 잘 바이러스없이 배양 배지의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 3 일 동안 섭씨 25도 인큐베이터에 플레이트를 놓고 매일 20배 배율로 브라이트 필드 현미경으로 각 바이러스 주식의 세포 병증 효과를 평가합니다.
세포가 흐릿해 보이고 배지가 양성 우물로 조각이 가득 하고 세포 형태가 음수로 정상인 우물로 분류합니다. 번식하기 전에 테트라사이클린 밀리리터 당 50 마이크로리터 400마이크로리터를 4그램의 신선한 표준 옥수수밀 플라이 푸드와 철저히 섞어 하룻밤 사이에 음식을 섭씨 4도에 놓아 에탄올을 증발시킵니다. 다음날 아침, 음식을 실온으로 데우고 20명의 암컷과 10명의 수컷이 사육 유리병으로 날아가서 섭씨 25도, 습도는 정상의 빛/암울한 주기하에서 60%의 습도를 유지합니다.
충분한 계란이 놓여지면, 이산화탄소의 가벼운 흐름하에서 새로 폐쇄 된 성인 파리를 수집하고 드로소필라를 다시 두 번 더 번식시다만 입증했습니다. 3대에 걸친 테트라사이클린 처리 후, 이산화탄소의 가벼운 흐름 하에서 5개의 파리를 수집하고 250마이크로리터의 이중 증류수와 0.5mm의 멸균 세라믹 구슬로 파리를 균질화합니다. 1분 후, 섭씨 영하 80도에서 샘플을 동결하기 전에 2X 버퍼 A의 250 마이크로리터를 샘플에 첨가합니다.
다음으로, 섭씨 25도의 수조에서 영하 80도의 샘플을 빠르게 해동한 다음, 표준 프로토콜에 따라 중합체 연쇄 반응에 따라 게놈 DNA를 추출하고 중합체 연쇄 반응으로 DNA를 증폭시키기 전에 섭씨 70도의 수조에서 30분 간 배양됩니다. 표준 프로토콜에 따라 젤 전기포고증에 의한 각 플라이 균주에 Wolbachia 16 개의 작은 RNA 및 wsp의 부재를 확인합니다. 그런 다음 볼바키아프리 플라이 스톡을 표준 옥수수 밀 플라이 푸드에 기르고 있습니다.
바이러스 감염의 경우 먼저 스테레오 현미경과 얇은 집게를 사용하여 유리 모세관 바늘의 끝을 나노 주입에 적합한 직경으로 부수습니다. 인젝터를 조립하려면 천장 O 링과 흰색 스페이서를 인젝터의 금속 플런서에 놓고 큰 보조기가 바깥쪽으로 향합니다. 30 게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 유리 바늘을 미네랄 오일로 채우고 바늘을 칼라를 통해 놓습니다.
더 큰 O-링을 바늘의 무딘 끝에서 약 1mm 정도 칼라의 베이스 주위에 놓고 바늘을 인젝터의 플런저에 장착합니다. 플런저에 바늘을 고정하고 빈 버튼을 눌러 가청 신호가 들릴 때까지 마이크로 인젝터의 플런저를 확장합니다. 이제 플런저를 5밀리미터 후퇴시키고 바늘을 100플라형성 유닛 바이러스 현탁액에 담급니다.
울바키아가 없는 남성 드로소필라(Drosophila)의 바이알 1개 또는 적어도 3개의 바이알을 사출 접시에 부드럽게 흔들어 줍니다. 남성 부여 파리는 짝짓기 중에 선호되며 번식은 여성에게 영향을 미칠 수 있습니다. 그런 다음 각 비행의 흉부에 50.6 나노리터의 바이러스 용액을 메소플라와 프테로플라우라 사이의 약간 밝은 색 부위에 주입하고 지상 파리에서 세포병증 효과 분석 및 정량적 RT PCR에 의해 DCV 부하를 측정합니다.
주사 후, 조심스럽게 신선한 유리병에 파리를 전송하고 마취에서 회복하는 동안 매체에 집착에서 파리를 방지하기 위해 수평 위치에 유리병을 배치합니다. 주사는 시간이 많이 걸리지만 DCV 복제는 매우 빠르기 때문에 각 유리병에서 파리의 모든 파리가 주입되면 튜브에 정확한 시간을 기록하는 것이 매우 중요합니다. 바이러스 감염은 세포 용해및 세포병증 효과를 유도할 수 있으며 감염 후 3일 후에 관찰된다.
Wolbachia 16s rRNA 및 wsp 프라이머는 입증된 바와 같이 울바키아와 드로소필라의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. Wolbachia-free 파리는 DCV 감염 후 및 복용량 의존적인 방식으로 현저하게 감소된 생존율을 나타낸다. DCV는 디저-2 돌연변이 파리의 생존율 감소 및 증가된 바이러스 부하에 의해 입증된 바와 같이 드로소필라에서 항바이러스 감염에 중요한 호스트에 있는 항바이러스 신호 경로를 활성화합니다.
이 절차를 시도하는 동안, 울바키아 유전자형으로 오염이 DCV 감염으로 날아가는 Drosophila 멜라노가스터의 감수성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 더 큰 규모의 유전 스크린 같이 그밖 방법은 바이러스 감염 또는 항 바이러스 반응에 요구된 정의된 호스트 유전자의 밑에 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 Drosophila melanogaster 모형에 있는 풍토성 인간 바이러스성 감염의 근본적인 발발을 탐구하기 위하여 인간 적인 바이러스성 질병의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
바이러스로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
