편견없는 샘플링 프로토콜은 전자 현미경 검사에 매우 중요합니다. 특정 뇌 영역에서 시냅스 또는 기타 구조물의 수치 밀도에 정량화하려는 경우, 우리의 기술의 주요 장점은 편견이 없으며 최소한의 사용자 개입으로 전자 현미경 그래프를 자동으로 생성할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 신경망의 강도를 평가하는 데 사용할 수있는 신경 과학과 같은 다른 연구 분야에서도 유용합니다.
우리의 프로토콜을 적용하기 위해, 시료 준비 및 전이 전자 현미경 의 작동과 같은 전자 현미경 기술에 있는 경험이 필요합니다. 우리의 절차를 시연하는 것은 박사 스테판 Wernitznig, 내 실험실에서 포스트 닥터가 될 것입니다. 이 프로토콜은 전자 현미경 검사법을 위한 두뇌 견본을 준비하고, 얇은 단면도의 쌍을 절단하는 것으로 이루어져 있습니다.
다음으로, 관심 영역에서 정의된 수의 전자 현미경 그래프를 자동으로 생성하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 카운트 프레임을 사용하여 구조 피처의 숫자 밀도를 평가합니다. 시작하려면 관심 있는 샘플을 포함된 수지에 포함시켜 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따르도록 합니다.
그런 다음 샘플을 초미세토메에 배치하고 55나노미터 초박형 직렬 섹션을 생성합니다. 피올라 형태로 코팅된 1밀리미터 의 치수로 슬롯 그리드에 섹션을 배치합니다. 그런 다음 슬롯 그리드의 초박형 단면을 30분 동안 2%의 우라일 아세테이트를 사용하고 실온에서 30초 동안 구연산이 이어진다.
그리드를 TEM에 넣고 낮은 배율을 사용하여 TEM을 사용하여 그리드의 단면을 검사하여 섹션의 품질을 방향을 지정하고 평가합니다. 그런 다음 TEM 직렬 섹션 소프트웨어를 시작하고 섹션을 선택하고 삽입을 선택하여 참조 및 조회 섹션의 모서리 점을 추가합니다. 팝업 창의 지침을 따릅니다.
참조 섹션으로 시작한 다음 조회 섹션을 계속합니다. 1점과 2점을 입력할 때 섹션의 가장자리가 다음 섹션과 평행한지 확인합니다. 다음으로 낮은 배율 하에서 참조 섹션을 시각화하여 관심 영역을 식별합니다.
기준 단면도의 TEM 영상 분석을 ROI의 여러 코너 포인트로 이동하여 ROI의 윤곽을 만듭니다. 랜덤 포인트 샘플링 소프트웨어를 사용하여 결과 다각형의 좌표를 기록합니다. 이를 위해 섹션의 ROI 윤곽을 설명하는 데 필요한 다각형의 각 지점에서 랜덤 포인트 샘플링 소프트웨어의 대화 상자에 좌표를 추가합니다.
다음으로 샘플링 영역과 영역 사이의 거리와 랜덤 포인트 샘플링 소프트웨어에 적합한 크기를 정의하고 입력합니다. 그런 다음, 라스터 계산을 눌러 다각형 내에서 현미경 의 위치에 대한 체계적이고 균일하며 무작위적인 방식으로 좌표를 생성합니다. 랜덤 포인트 샘플링 소프트웨어및 TEM 직렬 섹션 소프트웨어를 사용하여 참조 및 조회 섹션에 샘플링 점을 저장합니다.
이들은 나중에 기록되는 몽타주들의 좌표입니다. 랜덤 포인트 샘플링 소프트웨어에서 다음 위치로 이동하여 현미경 스테이지를 참조 섹션의 각 샘플링 영역의 x, y 좌표로 이동합니다. 그런 다음 위치를 선택하고 참조 섹션의 TEM 직렬 섹션 소프트웨어에서 이러한 좌표를 가져올 삽입을 선택합니다.
모든 좌표에 대해 이 것을 반복합니다. 참조 섹션의 좌표를 조회 섹션에 반영하려면 섹션을 선택하고 섹션으로 이동을 선택합니다. 대화 상자 창에서 조회 섹션 수를 입력합니다.
몽타주 기록의 경우 앞에서 설명한 참조 섹션과 조회 섹션 사이를 전환하고 위치가 있는 참조 섹션의 위치를 변경하고 숫자로 이동합니다. 대화 상자 창에서 다음 좌표를 선택합니다. SerialEM 몽타주의 경우 각 샘플링 좌표에서 파일로 이동하여 드롭다운 메뉴에서 새로운 몽타주를 선택합니다.
대화 상자 창에서 적절한 타일 수와 겹치는 백분율을 선택합니다. 본 연구에서는 5000의 배율은 연구에서 시냅스 특징을 인식하기에 충분합니다. 그러나 CCD 카메라의 제한된 시야는 두 개의 이미지로 몽타주를 만들어야했습니다.
몽타주들은 시리얼EM으로 만들어집니다. 각 몽타주를 녹음하기 전에 포커스를 재조정하거나 레코딩 소프트웨어에서 자동 초점 옵션을 활성화합니다. 폴더를 선택하여 몽타주 파일을 저장하고 직렬EM의 왼쪽에 있는 몽타주 하위 메뉴에서 시작을 눌러 몽타주 녹음을 시작합니다.
마이크로디스섹터를 시작하고 카운팅 프레임의 크기와 필요에 따라 세그먼트 수를 정의합니다. 디스섹터 매크로를 사용하여 시냅스 밀도를 계산합니다. 도구 모음에 있는 멀티 포인트 도구를 사용하여 해분의 두 개의 금지된 줄과 교차하는 시냅스를 제한하지만 반대 수락 줄에서 시냅스를 계산합니다.
참조 섹션에 표시되지만 조회 섹션에는 표시되지 않는 카운팅 프레임 내에 모든 시냅스를 표시하고 타원형 선택과 함께 표시합니다. 시냅스 매개 변수를 측정하기 위해 참조 섹션에 있는 단면에 있는 시냅스 갈라진 방향으로 시냅스만 선택합니다. 이는 디스섹터에 사용되는 것과 동일한 이미지 프레임 내에 있어야 합니다.
다음으로, 플러그인으로 이동 한 다음 분석하고 드롭 다운 메뉴에서 플러그인 ObjectJ를 시작합니다. ObjectJ 드롭다운 대화 상자에서 새 프로젝트를 열어 사용자가 마커 도구로 구조물을 윤곽을 그리고 표시할 수 있는 창을 엽니다. 먼저, 마커 도구를 사용하여 구조를 따라 선을 그려 시냅스 전 멤브레인 및 시냅스 후 밀도 길이의 길이를 측정한다.
이어서, 시냅스 갈라진 의 평균 폭을 다각형으로 그려서, 시냅스 전 및 시냅틱 멤브레인을 모두 덮는다. 도킹된 소포의 수를 결정하려면, 하나의 소포 직경 이하의 사전 시냅스 멤브레인에서 최대 거리가 있는 모든 소포를 계산합니다. 그런 다음 동일한 시냅스에서 도킹된 소포 또는 다른 도킹되지 않은 소포로부터 직경 1개의 최대 거리를 가진 소포를 계산하여 도킹되지 않은 소포의 수를 결정합니다.
프로토콜의 적응된 버전은 초박형 단면 내에서 바이어스없이 얻은 위치에서 원소 분석을 허용합니다. 이를 위해 TEM 이미징 모드에서 직렬EM을 시작하고 새 프로젝트를 엽니다. 그런 다음 Navigator를 열고 카메라와 스크립트 컨트롤에서 카메라의 설정을 확인하여 보기 및 녹화 및 뷰를 시작합니다.
초박형 섹션의 모서리 맵을 만들려면 네비게이터 창에서 점 추가를 선택합니다. 그런 다음 초박면 모서리 모서리를 설정합니다. 오른쪽 마우스 키를 누르고 스테이지를 코너 포인트로 이동합니다.
섹션의 모서리에 도달하면 왼쪽 마우스 클릭으로 코너 포인트를 추가합니다. 절차를 반복하여 세 개의 코너 포인트를 추가합니다. 네비게이터 창에서 모서리 점에 대한 상자 C가 저장된 점에 대해 체크되어 있는지 확인합니다.
모퉁이 몽타주를 시작하려면 시리얼EM 메뉴 바의 네비게이터로 이동하여 드롭다운 메뉴에서 몽타주 그리드와 셋업 코너 몽타주를 선택하십시오. 네비게이터 창에서 다각형 추가를 선택하고 여러 마우스 클릭으로 관심 영역을 간략하게 설명합니다. 다음으로 네비게이터 드롭다운 메뉴에서 점 그리드 추가를 선택하고 점 사이의 거리를 정의합니다.
EFTEMSerialEM 스크립트를 시작하고, 스크립트 명령을 따르고, 네비게이터에 표시된 대로 그리드 포인트 수를 입력하고 획득 지점 수를 입력합니다. 그런 다음 스크립트가 그리드 막대를 피할 수 있도록 조명 임계값을 설정합니다. 스크립트 명령을 따르고 스테이지를 수동으로 이동하여 그리드 막대의 1/4까지 뷰 필드를 덮습니다.
표시된 값에 따라 표시된 값보다 높은 임계값을 입력합니다. 획득 지점이 선택되고 조리 루틴이 완료될 때까지 기다립니다. 이 작업은 시간이 오래 걸리며 하룻밤 사이에 완료할 수 있습니다.
에너지 필터링된 TEM 원소 분석을 설정한 후 요소별 설정이 있는 원소 맵을 획득합니다. 편견없는 샘플링 접근 방식은 특정 뇌 영역에서 시냅스 특징을 계산하고 분석하는 데 유용합니다. 또한 SerialEM 소프트웨어용 EFTEMSerialEM 스크립트를 사용하면 이러한 각 지점에서 에너지 필터링전자 현미경 그래프를 획득하는 것을 목표로 전체 초박형 섹션에서 획득 지점을 임의로 선택할 수 있습니다.
스크립트는 채점으로 표시된 사용자가 미리 정의한 여러 점을 임의로 선택했습니다. 테스트 현미경 그래프를 생성하고 성적 수준을 확인하여 선택한 점이 섹션의 표시 부분에 있는지 확인하여 그리드 막대에 착륙한 점을 거부합니다. 대부분의 워크플로우는 스크립트에서 처리되었으며 사용자의 상호 작용이 최소화되었습니다.
그러나 샘플이 여기에 표시되어 있는 가운데 SerialEM의 자동 초점 루틴에 대해 너무 적은 빛이 있었습니다. 따라서 스크립트가 스테이지를 각 지점으로 이동하자마자 포커스가 조정되고 원소 맵이 철로 만들어졌습니다. 관심 영역을 신중하게 선택하고 동일한 수의 샘플링 포인트가 관심 있는 각 영역에 속하는지 확인하는 것이 중요합니다.
표본 제제에 사용되는 많은 화학 물질이 독성이라는 것을 잊지 마십시오. 그래서 실험실 코트와 보호 장갑을 착용하고 연기 커버에서 작동합니다.
