We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.

<ol><li> 시간 경과 현미경에 의해 Dictyostelium의 discoideum의 초기 기아 응답을 관찰한다. <ol><li> HPO 4 5 g의 proteose 펩톤 5 g thiotone의 E 펩톤 10 g 글루코스, 5 g의 효모 추출물, 0.35 g이 나트륨 : 1 L에 대해 HL-5 매체 (함유의 Erlenmayer 플라스크 DH1.10 세포 또는 CORA 결핍 세포 성장 * 7H 2 O, 0.35 g의 KH 160 rpm의 회전 진탕 배양기에서 22 ° C에서 2 PO 4, 0.05 g의 dihydrostreptomycin - 황산, 산도 6.6). 0.01 × 106 세포 / ㎖, 2 × 106 세포 / ml 사이의 밀도로 세포를 유지한다. </li><li> 수확 로그 단계 성장 DH1.10 셀 (21) 또는 22 ° C에서 HL-5 매체와 문화를 흔들어 성장 코라 결핍 셀 DH1.10 배경에서 발생 (10)에 의해, 세포 응집을 검사합니다. 이를 위해 400 XG에서 3 분 동안 세포 (통상 10 내지 50 ㎖), 원심 분리기의 적당량을 취하고 BSS (10 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 두 번 세포를 씻어2.5 mM의 CaCl2를, pH가 6.5). </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 계속해서, (5, 10, 20, 40)의 밀도로 접시의 세포를 24- 웰 플레이트에 104 세포 / cm × 2. 그들이 BSS에서 22 ° C에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다. </li><li> 이미지마다 135 초를 복용, 10 전에 설명 된 바와 같이 시간 경과 현미경에 의해 집계를 시각화합니다. 설정 5X 목적과 적절한 소프트웨어에 의해 자동으로 전자 승산 전하 결합 소자 카메라를 구비 한 생균 이미징을 사용하여 (재료 표 참조). </li></ol></li><li> 기아 동안 Dictyostelium의 discoideum 세포의 캠프 펄스. <ol><li> 세포를 수확하여 DH1.10 셀 21 DH1.10 CORA 결핍 셀 (10)의 개발에 대한 외부로부터인가 된 cAMP 펄스의 효과를 조사한다. 이렇게하려면 400 XG에 3 분 동안 적절한 세포의 양 (보통 10 ~ 50 ㎖), 원심 분리기를 가지고 BSS에 두 번 씻는다. </li><li> COUBSS에서 1 × 107 세포 / ml의 농도로 세포를 혈구를 사용하여 재현 탁 NT 세포. 펄스를 적용하기 전에 2 시간 동안 22 ° C에서 배양 (160 rpm으로)를 흔들어. 타이머 제어 연동 펌프를 사용하여 캠프 펄스를 추가합니다. 5 시간에 걸쳐 5 초 펄스 50 nM의 캠프 (최종 농도) 15 μL 매 6.5 분을 제공하는 펌프를 프로그래밍. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 계속해서, (5, 10, 20, 40)의 밀도로 세포를 플레이트를 24- 웰 플레이트에 104 세포 / cm × 2. BSS에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다. </li><li> 5 배 목표를 사용하여 밝은 필드 현미경으로 22 ° C에서 16 시간 후 집계를 시각화합니다. </li></ol></li><li> 에어컨 매체에 노출을 통해 Dictyostelium discoideum 개발 유도. <ol><li> (22) 한 바와 같이 신선한 컨디셔닝 매체를 준비합니다. 숭배를 흔들어에서 로그 상 DH1.10 세포 21 DH1.10 코라 결핍 셀 (10)를 수집400 XG에서 3 분 동안 피펫, 원심 분리기를 이용하여 22 ° C에서 HL-5 매체와 URES 및 PBM에서 세포를 세 번 씻어 (0.02 M 인산 칼륨, 10 μM 염화칼슘 2, 1 ㎜의 MgCl 2, pH를 6.1). </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 카운트 ml의 1 × 10 7 세포 /의 밀도로 PBM에서 다음을 재현 탁하고 110 회전 / 22 ° C에서 20 시간 동안 흔들어. </li><li> 3 분 동안 400 × g에서 원심 분리 후 조정 배지를 수집하고 4 ℃에서 15 분 동안 8,000 × g에서 원심 분리하여 명확히. </li><li> 0.45 μm의 필터를 통해 필터 에어컨 매체 (재료 표 참조) PBM에서 배를 희석. </li><li> (5, 10, 20, 40)의 밀도 혈구 접시를 사용하여 세포를 카운트 24- 웰 플레이트에 104 세포 / cm × 2. 그들이 22 ° C에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다. </li><li> 이전에 제조 된 배지로 교환 세포 상등액. </li><li> 집계 a를 시각화5 배 목표를 사용하여 밝은 필드 현미경에 의한 따고 16 시간. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium.">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li><li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum:+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development.">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+80+x+10(3)+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium.">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li><li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation.">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li><li>Mehdy, M. C., Firtel, R. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li></ol>

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coronin 단백질은 진핵 계통 군의 대부분 분류군에서 발견된다. Dictyostelium의 discoideum의 coronin A는 포유류 coronin (1)의 동체는 세포 초기 발달 동안 응집 중심을 형성 할 수없는 A-결핍을 coronin 때문에, 초기 기아 반응에 관여 사이클 10. 정량적으로 정확하게 균주 개발 사이의 지연을 평가할 수 있도록, 자동 스테이지 컨트롤러 현미경 생균 촬상 설정 필수적인 도구이다. D. discoideum는 수명주기 1-4의 여러 단계에서 필수적인 신호 전달 분자로 캠프를 이용한다. 캠프 요구되는 중에 체크 포인트 중 하나는 다세포 구조의 형성을 단일 셀로부터의 전환이다. 기아 ~ 6 시간이 세포에 의해 감지 및 집계 센터 (5)을 향해 이동하는 주화 신호를 제공 한 후 캠프 파의 개시. 이 캠프파도가 굶주리고 D.을 펄스에 의해 실험적으로 모방 할 수있다 캠프와 discoideum 세포 5 시간 8,9의 기간 동안 매 6.5 분. 이 절차를 사용하여이 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 캠프 펄스를인가하기 전에이 2h까지 위해 세포를 굶하는 것이 중요하다. 설정이 실험을 활용하여 우리는 이러한 외부 적으로 적용 펄스가 코라 결핍 세포의 개발 구조로, 캠프 신호의 상류 역할을하는 coronin A를 표시 할 수 있었다 (그림 3, 5). 이러한 결과는 또한 coronin A는 초기 기아 응답 검출에 필수적인 역할을 보이는 반면, 그와 같은 화학 주성 및 세포 응집 자체 10 공정 비용 소비임을 나타낸다. 집계 분석 자체는 Dictyostelium의 discoideum의 초기 개발을 연구하는 강력한 방법이다. 그러나, 이러한 전자의 재현성에 영향을 미칠 수있는 여러 함정 존재xperiments, 그리고 여러 가지 요인이 고려되는 것이 중요하다 : CORA 결핍 세포 분석시 세포의 연령은 중요한 역할을한다. 이 세포는 약 그들이 해동 된 지점에서 이주 후 표현형 및 재 집계를 보상하는 경향이있다. 시그널링 결함이 아닌 표시 셀 화성 결함으로 인해 조기 기아 인자의 증가 된 농도보다 높은 농도에서 응집 경향 하듯 세포의 밀도뿐만 아니라 매우 중요한 요소이다. 이러한 분석에서 세포의 정확한 카운트와 희석액의 중요성은 과장 될 수 없다. 다른 균주를 들어, 세포 밀도, 부착시, 현상 시간 등의 분석의 여러 변수의 조절이 요구 될 것이다. 모든 세포가 서로 다른 화합물을 사용하여 고갈되거나, 현상 자극 또는 억제 할 수있다 : 여기에서 기술 된 바와 같이 응집 분석은 다른 질의에 맞게 변형 될 수있는 다용도 기술이다응집 특정 변조 때문에. 바이어스 방식 일찍 개발에 중요한 유전자 또는 요소의 식별뿐만 아니라, 초기 발달 결함 균주를 식별하기 위해 여기에 설명 된 설정도 허용한다. 또한이 방법의 주요 단점이다 응집 분석 완전한 개발 사이클의 축소 된 버전이다. 따라서, 개발주기의 후반부에 영향을 표현형 분석에 적합하지 않다. 상기 응집 분석은 시간 및 자원 절약에 대한 개발보다는 것으로 판명 48- 웰 플레이트에서 자동화 된 촬상 동안 기록 개발 16 시간으로 : 주요 장점은 응집 대규모로 분석하고 자동 포맷을 채택 할 가능성 한천 플레이트. 우리는 외부에서인가 된 cAMP 펄스를 사용하여 초기 기아 응답을 무시하는 실험에서는 coronin A는 &lt;분비 인자의 검출과 연관되어 있음을 보여 주었다EM&gt; 기아에 따라 Dictyostelium 세포. 초기 기아 응답 동안 coronin의 A-매개 신호의 정확한 메커니즘은 불분명 남아있다. 개발이 단계에서 관련된 여러 가지 요인 특히 컨디셔닝 매체 인자 (CMF) 25, 26에서 연구되고있다. 그러나, CMF 자체 또는 공동 요인으로 작용 불분명 남아 있고 그 신호 캐스케이드는 부분적으로 만 이해된다. Dictyostelium 세포의 응집 용량을 사용 침지 조건은 현재 개발 포지티브 판독로서 기술 하에서 한천 표면에 응집 분석법에 비해 시간이 효율적인 방식으로 대규모 스크리닝 실험을 수행 할 수있다. 그러나, 침수 조건에서 집계 분석은 세포가 초기 집계 단계에서 체포되는 바와 같이, 전체 개발주기를 이행하지 않는 단점이있다 않습니다. 따라서, 여기에 설명 된 기술은 나중에 proce을 발달의 검사에 적합하지 않다SSES. 요약하면, 여기에 설명 된 실험 방법은 초기 기아 응답에 coronin의 A-종속 항목을 유도하는 잠재적 인 초기 기아 인자 (들)의 추가 특성을 허용 할 수있다.

단백질의 coronin 제품군은 높은 진핵 생물에 걸쳐 보존됩니다. 이 단백질은 아미노 말단 트립토판 아스파 테이트 (WD) 반복 함유 카르복시 말단 꼬인 코일 도메인 (13, 14)에 접속 된 고유 영역 다음 영역 (도 1)의 존재를 특징으로한다. Coronins는 골격 조절 및 신호 전달 (12)을 포함한 세포 기능의 다양성에 연루되어왔다. 포유 동물에서, 최대 6 개의 짧은 coronin 분자 (coronin 1-6)뿐만 아니라 7 coronin는 &#39;텐덤&#39;, 12,15 공동 발현 될 수있다. Coronin 1은 가장 광범위하게 연구 가족 구성원이며, 병원균 파괴, T 세포 및 신경 세포의 생존 시그널링에 관여하는 것으로 나타났다. 어떻게, 정확히, coronin 1은 이러한 활동을 수행하는 것은 확실하지 않다. 1 coronin하는 칼슘 및 캠프 종속 신호뿐만 아니라 F - 굴지으로 세포 골격 변조 16-18, 잠재적 인 협력을 조절하는 것으로 나타났다 동안포유 동물에서 최대 7 가족의 -expression는 도전으로 인해 잠재적 중복에, 이러한 시스템에 coronins의 분자 기능을 공부했다. 포유 동물의 생물과는 달리, 낮은 진핵 생물의 Dictyostelium의 discoideum은 분명히 비 중복 기능 15,19,20 만이 coronin 가족 (coronin의 A, 포유 동물 coronin 1 coronin B의 ortholog, 포유 동물 coronin 7의 ortholog)을 표현한다. 이 사실은 Dictyostelium의 discoideum에게 coronins의 기능을 연구하는 강력한 모델을 만든다. Dictyostelium의 discoideum에서 coronin A의 역할을 연구하기 위해, 우리는 10 coronin 결여 야생형 세포 또는 세포를 사용하여 평형 염 용액 (BSS) 버퍼를 포함하는 조직 배양 플레이트에 기아로 발달주기를 유도. 우리는 coronin 부족한 세포가 기아에 따라 다세포 집계를 형성 할 수없는 것으로 나타났다. 이 본 표현형의 정확한 정량 평가이 프로토콜에 설명 된 자동화 라이브 세포 이미징은 중요한 도구입니다. 을 coronin 부족한 세포에서 초기 기아 응답의 시작에 결함이 캠프 폭포의 상류 행위를 coronin 것을 제안, 캠프의 펄스를 공급하여 구조 할 수 있습니다. 발전 개시를 시뮬레이트 된 cAMP 펄스 외인성 출원은 과거 8,9 여러 실험실에서 이용되고있다. 그러나,이 절차는 세포 밀도 및 타이밍에 크게 의존하는 것으로 알려져있다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 재현성의 높은 수준을 보장하기 위해 이러한 가변성을 감소시키는 것을 목적으로한다. 종합하면, 이들 연구에 이용 된 기술은 Dictyostelium의 discoideum의 개발주기의 초기 단계에서의 단백질의 기능을 조사하기 위하여 강력한 도구를 제공하고, 업 식별뿐만 아니라 기능 coronin 하류 이펙터 할 가능성이있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4&#8727;2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiotone E peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8727;2H2O</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrostreptomycin-sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1954000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 &#956;M CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m Filtropure S filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-tissue-culture-plates-23/087721h">08-772-1H</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellobserver microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC Microprocessor&#8211;controlled dispensing pump</td>
			<td>ISMATEC</td>
			<td>ISM 931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 135M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>491237-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Shaker</td>
			<td>Inforst HT Minitron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the function of coronin a in the early starvation response of dictyostelium discoideum by aggregation assays

Dictyostelium의 discoideum의 아메바는 박테리아에 먹이 토양에서 발견된다. 음식 공급원이 부족해질 때, 그들은 단일 세포 집계 센터 1-4 향해 chemotax 동안 다세포 개발 프로그램을 시작하는 인자를 분비. 이 과정은 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) (5)의 분리에 의존한다. 캠프는 아데 닐 레이트 사이 클라 제와 포스 포의 공동 작업을 통해 파도에서 생산, 및 G 단백질 결합 된 cAMP 수용체 6,7 결합된다. 널리 사용되는 분석은 잠긴 상태에서 8,9 세포 응집의 관찰에 기초 하부의 진핵 Dictyostelium discoideum의 개발주기와 관련된 메커니즘을 분석한다. 이 프로토콜은 평형 염 용액 (BSS) (10)에 잠긴 조직 배양 플레이트에 기아로 발달주기 coronin A의 역할의 분석을 설명한다. Coronin A는 광범위하게 보존 된 PR의 구성원활동 (11, 12)의 다양한 연루되어 coronins의 otein 가족.를 coronin 부족한 Dictyostelium 세포는 다세포 응집체를 형성 할 수없는, 이러한 결함은 제안 된 cAMP의 펄스를 공급하여 구출 될 수의 상류 작용 coronin 캠프는 10 계단식. 이러한 연구에서 설명 된 기술은 캠프 캐스케이드의 상류 Dictyostelium discoideum의 개발주기의 초기 단계에서의 단백질의 기능을 조사하기 위하여 강력한 도구를 제공한다. 따라서이 집계 분석을 이용하여 함수를 coronin의 추가 연구를 허용하고 coronin 생물학에 대한 우리의 이해를 진행할 수있다.

초기 개발에 쇼에게 결함을 coronin 결핍 세포 (그림 2). 세포 coronin의 부재 Dictyostelium의 discoideum의 발달주기 동안의 초기 단계 다세포 응집체를 형성 할 수 없다. 따라서, coronin A는 초기 기아 응답 및 / 또는 캠프 신호 동안 역할을 나타납니다. 실제로 coronin A의 부재 하에서 다세포 골재 형성의 결여는 감소 캠프 10 시그널링을 수반한다. 그러나, 외인성 cAMP를 펄스의인가 완전히 야생형 표현형 (도 3)를 복원한다. 이것은을 coronin보다는 직접 캠프 신호, 캠프 폭포의 상류 기능 (그림 5)에 포함되는 것을 연루. Dictyostelium 세포는 굶어 조건에 노출되면 그들은 초기 기아의 분비가 22, 23 인자 유도한다. 최고의 체인지 중 하나초기 기아 응답에 참여 cterized 요인 매체 인자 (CMF) (22)를 조절한다. 이러한 결과에 기초하여, 우리는 coronin 것은 어느 이러한 초기 기아 인자의 분비를 조절하거나 이들 인자에 의해 유도되는 신호 전달에 관여하는 것으로 가정 하였다. 위해 우리는 매체 실험을 조절 수행이 두 가지 효과를 구별 할 수 있습니다. 야생 형 또는 코라 결핍 세포는 굶주린 야생 형 또는 코라 결핍 셀 (10) (그림 4) 중 하나에서 상층 액에 노출되었다. 이 상층 액은 다세포 집계 형성의 강력한 개시제이며, 따라서 캠프 신호를 포함하는 하류 발달 신호 경로를 시작 요소가 포함되어 있습니다. 우리의 결과는 야생형 세포로부터의 상등액의 경우는 (도 4)이었던 것에 CORA 결핍 세포 상등액 개발을 유도 동등 할 것을 나타낸다. 이것은 그 코라 연루 -결핍 세포 생성 및 야생형 제어 유사한 수준으로 초기 기아 인자를 분비 할 수있다. 그러나 CORA 결핍 세포는 모두 자신의 상등액도 야생형 세포 (도 4)로부터 제공되는 상등액에 응답 할 수있다. 따라서, coronin A는 오히려 발현 / 분비 (10) (그림 5)보다, 초기 기아 요인에 의해 유도 된 신호 전달 경로에 관여하는 것으로 나타납니다. 일반적으로, 더 개발주기를 유도 Dictyostelium 세포 배고파 분비 신호를 조사 할 수있는, 침지 조건 하에서 응집 분석은 강력한 판독된다. 자발적으로 집계 인해 필요한 모든 신호의 풍부에 의지 높은 밀도에서 시드 셀. 그러나, 낮은 농도로 조정 배지의 첨가가 세포 응집을 유도 할 것이다 (도 4) (22, 24) </suP&gt;. 따라서,이 절차는 조정 배지를 분별 이른 기아 응답 중 자신의 활동에 대한 별개의 구성 요소를 연구하는데 이용 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig1.jpg" /> 도 1 : 포유류 Dictyostelium의 discoideum 존재 Coronin 단백질 coronin 가족 고유 도메인과 C 말단 꼬인 코일 영역 다음에 N 말단 WD 반복 영역의 존재를 특징으로한다.. 포유류 7 coronin 단백질 (A)를 표현하지만, Dictyostelium의 discoideum는 자신의 기능을 연구 할 때 덜 중복의 위험을, 두 가족 (B)가 포함되어 있습니다. Coronin A는 포유류 coronin 1 coronin B의 ortholog가 coronin 7. 요약과 동일한 도메인 구조 도시이다 CC, 코일 된 코일 도메인; UD, 고유 한 도메인; WD는 트립토판을 반복<html> -aspartate 반복. 길이는 아미노산 (AA)에서 마우스 서열 (A)에 대해 설명한다. 피에 터스 외. 2013 년 12에서 수정. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig2.jpg" /> 그림 2. CORA - Dictyostelium discoideum 이른 기아 반응 동안에 응집없는 야생형 (A) 또는 CORA 결핍 (B) Dictyostelium 세포를 2 × 105 세포 / ㎠의 밀도로 멀티 웰 플레이트에 접종하고, BSS의 결핍, 및 20 시간에 걸쳐 이미지화. 스케일 바 = 100 μm의..JPG &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig3.jpg" /> . 그림 3 : 외부 캠프가 코라의 초기 발달 결함을 구출 펄스 적용 - Dictyostelium discoideum을 식물 야생 형 (A와 B)와 코라 결핍 세포 (C와 D)는 B (와 펄스 전에 세척하고 2 시간 동안 굶어했다 및 D) 또는 5 시간 정지의 모든 6.5 분 동안 A와 C) 50 nM의 캠프 (없이. 세포를 재현 탁 BSS 세정 및 / cm 2 내지 10 × 104 세포의 밀도로 배양 접시에 두었다. 이미지는 세포의 파종 후 20 시간을 촬영했다. 스케일 바 = 100<html> μm의는. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig4.jpg" /> 그림 4 : 코라 결핍 Dictyostelium의 discoideum는 (개발 유도에 필요한 모든 요소를 생산할 수 있지만 응답 할 수없는 급격하게 야생형 성장과 코라 결핍 세포가 PBM에서 세척의 밀도로 멀티 웰 플레이트에 접종 하였다. 5, 10, 20, 40)은 야생형 (A) 또는 CORA 결핍 배고파 세포 (B)에서 수득 된 배지에서 배양 / cm 2 × 104 세포를 X. 이미지는 세포 파종 후 16 시간을 촬영 하였다. 스케일 바 = 100 μm의.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig5.jpg" /> 그림 5 :. Coronin의 현재 모델 Dictyostelium의 discoideum에서 기능 Coronin A는 캠프 캐스케이드의 유도 및 발달주기를 통해 진행으로 이어지는 초기 기아 응답 중에 분비 인자 (들)의 신호 전달에 참여하고있다. 에서 Vinet 등. 수정 된 2014 년 (10). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

의 조기 기아 응답에 Coronin (A)의 기능 조사<em&gt; Dictyostelium의 discoideum</em&gt; 집계 분석 실험에 의해

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

investigating-function-coronin-early-starvation-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

7.2K 조회수.  University of Basel. The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

비디오: Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

인터뷰 - 마이트의 H​​indgut에서 미생물 커뮤니티를 조사

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

연구

생물학

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...