Ringraziamo il Medical Research Council UK per core (U105115237) di finanziamento per RRK.

1. preparazione delle cellule e materiali
<ol><li>Coltivare le cellule sia su piastre di agar di SM in combinazione con batteri come Klebsiella aerogenes, o in mezzo nutritivo come HL5 come descritto23. Nota: Crescita mutanti knockout che sono difettosi nella Macropinocitosi sui batteri aiuta a prevenire l'accumulo di mutazioni secondarie che possono aumentare il tasso di Macropinocitosi. Mantenere il numero di passaggio inferiore a 4 dopo il placcaggio cellule dalle scorte per ottenere risultati ottimali. Mutanti devono essere memorizzati come gli stock congelati appena possibile dopo l'isolamento.</li>
	<li>Per coltivare le cellule su piastre di agar di SM, crescere K. aerogenes alla confluenza nel mezzo di SM. Aggiungere 200 – 300 μL di batteri su una piastra di agar di SM e diffondere. Prendere un'ansa sterile delle cellule (durante il trasferimento da un'altra piastra batterica) e la diffusione ad un orlo della piastra. Incubare a 22 ° C per fino ad una settimana.</li>
	<li>Sciogliere il destrano isotiocianato (TRITC-) Tetra-metil-rodamina a 50 mg/mL in acqua, filtrare utilizzando 0,22 μm filtri in aliquote di 1ml e conservare a-20 ° C. Le aliquote possono essere conservate a tempo indeterminato. Nota: 155 kDa è la dimensione tipica utilizzata con questo metodo, come si può acquistare a buon mercato all'ingrosso, ma più piccoli destrani misurano Macropinocitosi altrettanto efficacemente in Dictyostelium24. Destrani non estinguibile differenti, come il blu cascata o Alexa-647, sono alternative se diversi fluorofori sono necessari.</li>
</ol>2. conversione di misure Qualitative in quantitativi (opzionale)
<ol><li>
Eseguire un'analisi di assorbimento fluido usando le cellule in sospensione.
	<ol>
<li>A pellet di cellule axenically crescente a 300 x g per 3 min, scartare il surnatante e risospendere in mezzo nutritivo a 1 x 107 cellule/mL. Aggiungere TRITC-destrano a 0,5 mg/mL e agitare a 180 giri/min, 22 ° C.</li>
		<li>Diluire 0,8 mL campioni in 0,7 mL di KK ghiacciata2 a 0, 30, 60, 90, 120 min lavare una volta in 1,5 mL di gelida KK2 buffer23 in una centrifuga da banco, risospendere a 1 mL nello stesso buffer e memorizzare sul ghiaccio. Nota: immediatamente o una volta che tutti i campioni sono stati raccolti lavatrice produce risultati equivalenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinare il volume di fluido interiorizzato da parte delle cellule.
	<ol>
<li>Impostare il fluorimetro per misurare la fluorescenza usando una lunghezza d'onda di eccitazione di 544 lunghezza d'onda nm ed emissione di 574 nm con una fessura nm 10. Impostare una serie di diluizioni di TRITC-destrano e usarlo per misurare la fluorescenza per dato volumi di destrano. Creare una curva di calibrazione.</li>
		<li>Misurare la fluorescenza interiorizzata dalle cellule nella sezione 2.1 utilizzando 0,9 mL della sospensione delle cellule. Calcolare il volume di fluido interiorizzato per cella utilizzando la curva di calibrazione24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluire il resto delle cellule da ogni punto di tempo separatamente in 0,5 mL di ghiaccio freddo KK2. Filtrare con un colino di cella 70 µm in provetta 5 mL in polistirolo flusso cytometry. Impostare il citometro a flusso, in modo che le celle da ogni punto di tempo sono distinte gli uni dagli altri e registrare la loro fluorescenza (vedere paragrafi 3.4 e 3.5).</li>
	<li>Misurare la fluorescenza dei branelli di calibrazione nel citometro a flusso utilizzando le impostazioni di cui sopra e registrarlo. Nota: Questo è il riferimento per tutte le misure di fluorescenza futuri sul citofluorimetro: prima di usare nuovamente eseguire le perline e regolare le impostazioni in modo che hanno la stessa fluorescenza. Questo vi darà un picco definito molto stretto. Mettere un cancello intorno alla vetta di fluorescenza può rendere questo più facile.</li>
	<li>Ripetere tre volte e tracciare i dati di fluorescenza delle cellule ottenuti nelle sezioni 2.2 e 2.3 contro l'altro. Tracciare una retta di regressione e utilizzare l'equazione per convertire i dati qualitativi da flusso cytometry in unità quantitativa.</li>
</ol>3. l'assorbimento fluido di misura
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> Figura 1: schematico di alto-rendimento misura della Macropinocitosi. (A) Grow Dictyostelium su una piastra di SM seminato con batteri K. aerogenes (giallo). Raccogliere le cellule dalla parte anteriore d'alimentazione (arancione), evitando le cellule che sono già state sviluppate (verde), in 25 mL di tampone2 KK. Vortice a dissociarsi, pellet mediante centrifugazione di 3 min a 300 x g, quindi lavare 3 volte in 50 mL di tampone2 KK, scartare il supernatante ogni volta. Risospendere e 1 x 105 cellule/mL in HL5 crescita medio e aggiungere 50 µ l in tre pozzi per campione di una piastra a 96 pozzetti fondo piatto. Incubare a 22 ° C per 24 h. (B) diluire TRITC-dextrano a 1 mg/mL in HL5 crescita medio da una soluzione madre di 50 mg/mL. Aggiungere 50 µ l di ciascun campione (escluse i pozzetti di controllo assorbimento 0 min) e incubare a 22 ° C per 1 h, dopo di che aggiungere il destrano al controllo assorbimento 0 min. (C) decantare immediatamente i mezzi di comunicazione, pat la piastra su un panno per rimuovere eccesso di terreno e immergerlo in un bagno di tampone di2 KK ghiacciata, riempire i pozzetti per lavare. Decantare il buffer e asciugare tamponando nuovamente. Aggiungere 100 µ l di 5mm azoturo di sodio disciolto in KK2MC per staccare le cellule. Prendere per citometro per misura della fluorescenza interiorizzata di flusso. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>
Impostare una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto a coltura tissutale (Figura 1A). Utilizzare le cellule coltivate su batteri e di trasferirli in HL5 medie (da 100 µ g/mL di diidrostreptomicina, 100 µ g/mL ampicillina e kanamicina 50 µ g/mL) 24 h prima del dosaggio; in questo modo Macropinocitosi essere aumentata rispetto ai livelli bassi visto in cellule coltivate su batteri24. In alternativa, diluire le cellule direttamente da coltura, incubare per 24 h prima del saggio, per ridurre gli errori dovuto le cellule essendo diluite da diverse densità.<ol>
<li>Raccogliere le cellule dalla parte anteriore d'alimentazione in 25 mL di KK2 in una provetta da centrifuga 50 mL. Dissociare le cellule di Vortex e pellet a 300 x g per 3 min. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet lavare 3 volte a 300 x g per 3 minuti in 50 mL di KK2, scartare il supernatante ogni volta a rimuovere i batteri.</li>
		<li>Determinare la densità delle cellule (utilizzando un emocitometro o altra cellula sistema di conteggio) e diluire in HL5 contenenti antibiotici a 1 x 105 cellule/mL. Pipettare 50 μL in ogni pozzetto, utilizzando tre pozzi per ogni condizione. Incubare a 22 ° C per 24 h. ricordarsi di impostare un controllo di assorbimento 0 min. Nota: Un'alternativa medi, ad es. SIH, VL6 può essere utilizzato invece.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Celle di carico con TRITC-destrano (Figura 1B).
	<ol>
<li>Diluire il destrano a 1 mg/mL in mezzo utilizzato (questo può essere aumentato a 2,5-5 mg/mL nel valutare le cellule con l'assorbimento molto basso). Aggiungere 50 μL in ogni pozzetto (dando una concentrazione finale di 0,5 mg/mL TRITC-destrano) e restituire la piastra a 22 ° C per 1 h, come questo consente accumulo significativo destrano ma esocitosi di destrano non è ancora iniziata. Nota: una pipetta a ripetizione permette questo passaggio essere fatto più velocemente, riducendo l'errore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare le celle per citometria a flusso (Figura 1).
	<ol>
<li>Immediatamente prima del lavaggio, è necessario aggiungere 50 μL contenente destrano media per i controlli di assorbimento 0 min.</li>
		<li>Decantare il mezzo e asciugateli su un tessuto. Lavare immergendo la piastra nella gelida KK2, poi decantare. Nota: alcuni ceppi con difetti di adesione potrebbero staccarsi durante questo passaggio, ad esempio un knockout di entrambi gli omologhi della Talin (talA-/ sara -)25. Usare cautela quando si lavora con linee cellulari che attaccano male e aspirare media se necessario.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di 5mm ghiacciata azoturo di sodio disciolto in KK2MC (KK2 + 2mm MgSO4 e 100 μM CaCl2). Attenzione: La sodio azide è estremamente tossica. Utilizzare una maschera antipolvere e occhiali protettivi quando si lavora con la polvere. Indossare sempre guanti e camice da laboratorio. Evitare il calore e non mescolare con acido. Nota: Le cellule rapidamente scollegare ed esocitosi è impedito24. Un microscopio può essere usato per controllare questo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assorbimento fluido di misura tramite flusso cytometry
	<ol>
<li>Se pensando di convertire valori relativi a quelli assoluto, usare le perline per standardizzare le impostazioni di cytometer di flusso (vedere sezione 2). In alternativa, utilizzare cellule caricato con destrano come sezione 2 per assicurarsi che il forward scatter e dispersione laterale sono impostate in modo appropriato per isolare le cellule (Figura 2A), assicurando che la macchina non è bloccata, (Figura 2B) e regolare i parametri al misurare la fluorescenza interiorizzata (Figura 2).</li>
		<li>Collegare il sistema di campionamento ad alta velocità e aggiungere piastra. Istituire un protocollo per misurare la fluorescenza (per TRITC-destrano utilizzare un laser giallo-verde per eccitare e misurare nel canale 582 nm o simili) di fino a 65 μL della sospensione cellulare ed Esegui.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analizzare i risultati di citometria a flusso
	<ol>
<li>Cancello delle celle utilizzando forward scatter e dispersione laterale (Figura 2A). Calcolare la mediana fluorescenza delle cellule utilizzando l'opzione di statistiche. Impostare questi parametri utilizzando un campione e si applicano a tutti i campioni. Nota: I profili di forward scatter/side scatter possono variare tra i campioni quando si utilizza diversi mutanti o inibitori.</li>
		<li>Determinare la media dei tre pozzi per ogni condizione e sottrarre il controllo di assorbimento 0 min. O convertire in valori quantitativi utilizzando l'equazione determinata nella sezione 2 o normalizzare al controllo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. di tempo di assorbimento fluido-corsi
<ol><li>Impostare le celle come descritto in sezione 3, con tre pozzi per ogni punto nel tempo e sforzo/condizione.</li>
	<li>Aggiungere mezzo etichettati destrano pozzetti diversi in sequenza. Un tipico corso di tempo misura l'assorbimento fluido a 0, 30, 60, 90, 120 e 180 min aggiungere il dextrano contenenti terreno per i pozzi 180 min tempo punto, seguita dopo 60 min aggiungendolo ai pozzetti per il punto di tempo 120 min, ecc (Figura 3A).</li>
	<li>A 0 min, aggiungere 50 μL di dextrano contenenti medie e immediatamente decantare e lavare la piastra come sezione 3.3. Analizzare come descritto nella sezione 3.5.</li>
</ol>5. dose Response Curve
<ol><li>Impostare le celle come descritto nella sezione 3, con tre pozzi per ogni ceppo e condizione.</li>
	<li>Diluire il composto di interesse in mezzo contenente destrano 1 mg/mL a doppio la concentrazione finale di massima desiderata del composto. Preparare una seconda provetta contenente mezzo con destrano con la stessa proporzione del veicolo come il primo. Vortice di mescolare.</li>
	<li>Creare una serie di diluizioni del composto di maggiore interesse del dextrano 200 μL contenente mezzo per campione (Figura 4A). Vortice di mescolare. Aggiungere 50 μL del mezzo a ciascun campione bene per 1 h.</li>
	<li>Lavare e analizzare come descritto nella sezione 3.3 in poi.</li>
</ol>6. fagocitosi e l'assorbimento della membrana
<ol><li>Per misurare l'assorbimento della membrana, preparare le celle come descritto nella sezione 3. Aggiungere 50 μL di mezzo contenente 20 μM FM 1-43 per una concentrazione finale di 10 μM. Dopo il caricamento, lavare e preparare le celle per citometria a flusso come sezione 3.3. Misurare nel canale di 585 nm o simili, utilizzando un laser blu per eccitare. Nota: Come traffico di membrana è più rapida di quella fase fluida, 10 min è un punto di tempo più appropriato da utilizzare oltre 1 h26. Coloranti alternativi che reagiscono solo quando incorporati nella membrana possono essere utilizzati invece.</li>
	<li>
Utilizzare perline fluorescente etichettati o batteri per misurare fagocitosi. Fluorescente lievito non può essere utilizzato, come essi sono inseparabili da Dictyostelium da avanti e lato dispersione24. Impostare le celle come descritto nella sezione 3 e analizzare come descritto27.<ol>
<li>Per misurare la fagocitosi di perline aggiungere etichettati perline come descritto nella sezione 3.2 per una concentrazione finale di 5 x 107 perline/mL (1,75 e 2 μm) o 1 x 108 perline/mL (1 e 1,5 μm) per 1 h prima di lavare e preparare per citometria a flusso come in giallo-verde sezione 3.3. Misurare nel canale 525 nm o simili, utilizzando un laser blu per eccitare. Nota: Le più alte concentrazioni porterà al distacco delle cellule.</li>
		<li>Per misurare la fagocitosi dei batteri, aggiungere che Texas-Red etichettati Escherichia coli bioparticelle come descritto nella sezione 3.2 a 1 x 108 batteri/mL per 1 h prima di lavare e preparare per citometria a flusso come sezione 3.3. Misurare nel canale 610 nm o simili, utilizzando un laser di colore giallo-verde per eccitare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).</li><li>Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+stop+shop+for+everything+Dictyostelium:+dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center+in+2012.">One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Considerando che altri metodi per valutare l'assorbimento fluido sono basso throughput, lavare le cellule in situ e l'uso di sodio azide per staccare le cellule sono i punti critici in questo metodo, che consentono la misurazione ad alta produttività di Macropinocitosi, l'assorbimento della membrana, o fagocitosi di Dictyostelium. Come le cellule sono attaccate ad una superficie e il mezzo non è, possono essere lasciati aderenti mentre il mezzo intorno a loro in primo luogo è stato gettato fuori e poi cambiati per immersione nel buffer e gettati fuori nuovamente. Sodio azide, che impoverisce ATP cellulare e depolarizza la membrana30, viene quindi utilizzato per staccare le cellule e previene anche esocitosi senza influire sulle cellule vitalità24.
Mentre mediante citometria a flusso per misurare Macropinocitosi di Dictyostelium dà una misura molto accurata dell'assorbimento fluido molto rapidamente, per stabilire il motivo perché un particolare ceppo o condizione ha alterato l'assorbimento fluido, ulteriore indagine utilizzando la microscopia è necessari24. Inoltre precisiamo che i risultati precedentemente pubblicati hanno, in alcuni casi, mostrato una differenza nell'assorbimento del fluido di ceppi mutanti coltivato sia su una superficie (come in questo caso), o in agitazione sospensione (come il protocollo standard)31. Utilizzando questo metodo può significare che, in rari casi, l'assorbimento fluido apparenti difetti sono mancanti. Inoltre, quando si misura la fagocitosi, possono essere utilizzate solo basse concentrazioni di particelle. Il tasso massimo di fagocitosi che può essere determinato con questa tecnica è molto inferiore a quella massima reale, anche se è ancora possibile misurare differenze rilevanti nella fagocitosi tra ceppi e condizioni24. Per determinare il tasso massimo di fagocitosi, l'assorbimento deve essere misurata in agitazione la sospensione di un protocollo alternativo27. Le cellule che hanno phagocytosed perline hanno aumentato la dispersione laterale, quindi questo dovrebbe essere corretto per conseguenza quando si imposta il citometro a flusso.
Citometria a flusso può essere utilizzato per misurare l'assorbimento fluido in cellule di mammifero32, tuttavia la percentuale più alta di liquido fase l'assorbimento di altre vie di endocitosi quanto visto in Dictyostelium è una preoccupazione. Inoltre, le cellule in genere sono staccate usando tripsina a 37 ° C, permettendo ulteriori endocitico progressione di destrano interiorizzato. Ghiacciata sodio azide non causa i macrofagi staccare da una superficie (Williams, inedito osservazione), rendendo questa tecnica non applicabile per cellule di mammifero senza ulteriore ottimizzazione.
Alta velocità effettiva misura di Macropinocitosi ha il potenziale per essere utilizzato per lo screening rapido ed economico per gli effetti degli inibitori, mutazione genetica o atterramento di gene in cellule di Dictyostelium . Mutanti devono sempre essere confrontati con loro padre diretto solo. Se il lettore non ha alcuna preferenza preventiva per ceppo di Dictyostelium , non axeniche ceppi come DdB o NC4 sono più "wild-type" rispetto a quelli axeniche e possono essere manipolati efficacemente come ceppi axeniche33. In caso contrario, sono l'axeniche Ax2 ceppi ceppi con il minor numero genoma duplicazioni34, mentre molti ceppi di Ax4 sono KO A Talin e dovrebbero essere evitato se possibile23. Più sforzi precedentemente pubblicati possono essere ordinati dal Dicty Stock Center35.
Questa tecnica permette maggiori possibilità d'indagine di quanto fosse possibile in precedenza sugli effetti delle diverse condizioni, inibitori e mutazioni su Macropinocitosi di Dictyostelium.

Su larga scala non specifico assorbimento fluido da Macropinocitosi è importante in diversi contesti biologici1, tra cui il campionamento di antigene di immunitario cellule2, entrata del patogeno in host celle3, cancro delle cellule di proliferazione4 e il diffusione di malattie da prioni5. In cellule di Dictyostelium e mammiferi, actina6,7, PI (3.4.5) P38,9,10 (anche se l'esatta natura del lipido differisce tra i due11), attivato RAS12,13e attivato Rac14,15 sono importanti per l'assorbimento fluido efficiente di Macropinocitosi, anche se restano molte domande senza risposta su come è la patch macropinocytic formato, organizzato e infine interiorizzato. Alla scoperta di altre proteine importanti per Macropinocitosi e la determinazione di come essi sono importanti nei diversi contesti biologici, darà una comprensione più completa della Macropinocitosi e potenzialmente consentire lo sviluppo di trattamenti mirati per una gamma di condizioni.
Dictyostelium è un sistema modello ideale per studiare Macropinocitosi. L'alto livello di Macropinocitosi costitutiva nei ceppi di laboratorio standard significa che l'assorbimento fluido è superiore al 90% dovuto Macropinocitosi6. In questo modo Macropinocitosi essere misurata esclusivamente determinando l'assorbimento fluido, a differenza delle cellule di mammiferi dove la percentuale di assorbimento fluido dovuto Macropinocitosi è molto più bassa. Che Macropinocitosi sono così ben definito e facilmente visualizzati12 in questo sistema allo stesso modo offre vantaggi distinti per indagare conservate componenti del macropinosome core rispetto ad altri sistemi dove ci possono essere più segnali regolatori 16 , 17.
La tecnica standard utilizzata per misurare Macropinocitosi dalle cellule di mammiferi coinvolge cellule di fissaggio dopo pulsare con destrano per un breve periodo di tempo seguita da microscopia per determinare l'area di una cella che è occupata da vescicole di destrano-positivi18. Questa tecnica non tiene tuttavia conto per la possibilità di macropinosomes restringimento entrando nella cellula, che è stata segnalata in Dictyostelium19e prende in considerazione solo singoli aerei della cella, che significa il volume interiorizzato non è chiaro. Una tecnica alternativa, di contare il numero di macropinosomes interiorizzato in un dato tempo, ha la stessa nota stonata20. L'utilizzo di Dictyostelium evita questi problemi; Tuttavia, tecniche esistenti per misurare l'assorbimento fluido di Dictyostelium sono relativamente laboriosa, utilizzando una grande quantità di cellule e di destrano21. Le cellule sono scossi ad alta densità in campioni rimossi a vari intervalli di tempo per la determinazione della fluorescenza interiorizzata utilizzando un fluorimetro e destrano fluorescente. Preparati in questo modo le cellule possono essere analizzate tramite flusso cytometry per ottenere la singola cella, piuttosto che il livello di popolazione, risoluzione22, anche se questo rimane basso-velocità di trasmissione.
Qui, la tecnica standard per misurare interiorizzato fluido utilizzando destrano fluorescente come un'etichetta è adattata a un formato di piastra a 96 pozzetti, con campioni analizzati tramite citofluorimetria usando un allegato di campionamento ad alta velocità (HTS). Le cellule sono alimentate non estinguibile destrano fluorescente per un predeterminato periodo di tempo, lavati per immersione nel buffer ghiacciata e staccata utilizzando 5 mM sodio azide, che ferma anche esocitosi. Cellule in ciascun pozzetto vengono poi analizzate tramite flusso cytometry. Questo metodo è stato progettato per superare i limiti dei metodi di cui sopra e consentire un confronto simultaneo dell'assorbimento fluido di un gran numero di ceppi/condizioni, utilizzando meno risorse e riducendo il lavoro coinvolti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LSR_II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran (155 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1287</td>
			<td>Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5 medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HLGCFG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrostreptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Formdium</td>
			<td>AMP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103694M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25169.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phopshate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.04877.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.05104.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>LS 50 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>15702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>09719-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17687-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>09847-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red E. coli bioparticles</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>E2863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow-set fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6607007</td>
			<td>Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>SMACFG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Elkay Laboratory Products</td>
			<td>E25-PS22-50S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td>Use a tube that will fit onto your flow cytometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeating pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4-SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL repeating pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>70920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry

Su larga scala non specifico assorbimento fluido da Macropinocitosi è importante per la proliferazione delle cellule tumorali sicure, campionamento di antigene, invasione della cellula ospite e la diffusione delle malattie neurodegenerative. I ceppi di laboratorio comunemente usati dell'ameba Dictyostelium discoideum hanno tassi estremamente alto assorbimento fluido se coltivate in terreno di coltura, oltre il 90% dei quali è dovuto Macropinocitosi. Inoltre, molti dei componenti di base conosciuta di mammiferi Macropinocitosi sono anche presenti, rendendolo un sistema eccellente modello per studiare Macropinocitosi. Qui, la tecnica standard per misurare interiorizzato fluido utilizzando destrano fluorescente come un'etichetta è adattata a un formato di piastra a 96 pozzetti, con campioni analizzati tramite citofluorimetria usando un allegato di campionamento ad alta velocità (HTS).
Le cellule sono alimentate non estinguibile destrano fluorescente per un predeterminato periodo di tempo, lavati per immersione nel buffer ghiacciata e staccata utilizzando 5 mM sodio azide, che ferma anche esocitosi. Cellule in ciascun pozzetto vengono poi analizzate tramite flusso cytometry. Il metodo può anche essere adattato per misurare l'assorbimento della membrana e la fagocitosi dei batteri o perline fluorescenti.
Questo metodo è stato progettato per consentire la misurazione dell'assorbimento fluido di Dictyostelium in modo efficiente ad alta produttività, manodopera e risorse. Permette il confronto simultaneo di più ceppi (ad es. mutanti di knockout del gene) e condizioni (ad esempio cellule nei mezzi differenti o trattate con diverse concentrazioni dell'inibitore) in parallelo e semplifica corsi di time.

Una volta che è stata eseguita la tecnica e le cellule sono caricati con destrano e pronti per l'analisi (Figura 1), verificare che il citometro a flusso non sia ostruito e regolare il profilo di dispersione di forward scatter/lato a guardare come le cellule mostrate nella Figura 2A. Se la macchina è bloccata, apparirà più come quello illustrato nella Figura 2B e deve essere sbloccato prima di continuare. Garantire i parametri Visualizza controllo axeniche cellule hanno fluorescenza alta destrano interiorizzato a intervalli di tempo più lungo e bassa fluorescenza interiorizzato a quelli più brevi (Figura 2).
Quando alla ricerca di differenze tra mutanti, è probabile che ci sarà uno dei tre fenotipi. I mutanti potrebbero avere normale assorbimento fluido, potrebbero avere un difetto parziale o l'assorbimento fluido potrebbe essere completamente abolita. Figura 2D Mostra un ceppo con il normale assorbimento fluido, in questo caso il ceppo di laboratorio standard Ax2, un mutante con un ~ 50% diminuzione nell'assorbimento del fluido (Ax2 rasG-14) e uno con abolito l'assorbimento fluido (Ax3 gefB-28). Ottenere l'assorbimento fluido mediano medio (sezione 3.5) e utilizzarlo per calcolare il volume di fluido interiorizzato (come in Figura 3B) o confrontare i dati a un controllo (come in Figura 4B e 4C).
Quando si esegue un corso di tempo di assorbimento fluido, come in Figura 3A, la fluorescenza interiorizzata dovrebbe aumentare per 60-90 min, dopo di che il destrano comincia ad essere exocytosed e un plateau è raggiunto (Figura 3B). Utilizzando 60 min come punto di tempo standard quando confrontando Macropinocitosi in diverse mutanti/condizioni di conseguenza permette un buon segnale essere raggiunto, e nessun segnale viene perso a causa di esocitosi. Mutanti dove esocitosi è gravemente ostacolato potrebbero richiedere più tempo per raggiungere un altopiano29.
Quando il trattamento delle cellule con inibitori che sono efficaci contro Macropinocitosi in Dictyostelium (impostato come in Figura 4A), il destrano interiorizzato in 1h andrà giù a quasi nulla alle più alte concentrazioni dell'inibitore nella maggioranza dei casi (Figura 4B). Alcuni inibitori potrebbero non essere efficace al 100%, tuttavia, ad esempio nocodazole inibisce solo fino al 50% dell'assorbimento fluido di Macropinocitosi quando aggiunto acutamente (Figura 4). Se gli inibitori non sono efficaci, le cellule saranno interiorizzare una quantità simile di destrano come il controllo, e non si vedrà una diminuzione in fluorescenza. Questa tecnica permette una vasta gamma di diversi inibitori e le concentrazioni dell'inibitore da sottoporre a screening per gli effetti sull'assorbimento fluido di Macropinocitosi molto rapidamente, riducendo i tempi di ottimizzare il trattamento inibitore.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> Figura 2: Set up dei dati del flusso cytometer e rappresentante. (A) il forward scatter (FSC) e profili di dispersione (SSC) laterali delle cellule devono essere impostati in modo le cellule possono essere facilmente distinti. È riportato un esempio di come dovrebbero apparire le cellule Ax2. (B) se il citometro a flusso è bloccato, come in questo esempio, le cellule hanno a dispersione molto low-side. Il laser non entusiasmeranno i fluorophores correttamente e la macchina deve essere sbloccata prima di continuare. Devono essere eliminati qualsiasi dati ottenuti mentre la macchina è stata bloccata. (C) la fluorescenza deve essere impostata affinché un campione di assorbimento 0 min ha bassa fluorescenza, che aumenta quando le cellule sono state incubate per più tempo nel mezzo di fluorescente, come mostrato in questo esempio tratto da Williams & Kay 201824. (D) esempi di cellule che sono state incubate con destrano TRITC per 1 h con normale Macropinocitosi (Ax2, verde), ridotto Macropinocitosi (Ax2 rasG -, HM172614, arancione) e abolito Macropinocitosi (Ax3 gefB -, HM177628, blu). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> Figura 3: esecuzione di corsi di assorbimento fluido time in piastre da 96 pozzetti. (A) destrano deve essere aggiunto a ogni set di campioni in sequenza, con lo stesso tempo di finitura. Quindi lavare i pozzetti, staccare e misurare la fluorescenza interiorizzata da citometria a flusso. Orari di esempio per aggiungere il destrano sono indicati qui. (B) l'assorbimento fluido tempo-corso di cellule Ax2 eseguita in piastre da 96 pozzetti. Scattata da Williams & Kay 201824, barre di errore indicano l'errore standard di tre esperimenti indipendenti. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> Figura 4: curve di assorbimento fluido dose risposta. (A) aggiungere il composto di interesse, in questo caso la PI3K inibitore LY294002, HL5 contenente 1 mg/mL TRITC-destrano al doppio la concentrazione massima finale desiderata. Mescolare con HL5 crescita medium + destrano 1mg/mL contenente solo in varie proporzioni per generare una serie di diluizioni di 200 mezzo µ l a condizione di veicolo. Aggiungere ai pozzetti come normale per 1 h prima di lavaggio e misurare fluorescenza interiorizzato. (B) curva dose-risposta l'assorbimento fluido per Ax2 cellule incubate con il mezzo contenente LY294002 dalla A. Adattato da Williams & Kay 201824. L'assorbimento fluido è normalizzato per un controllo non trattato. Barre di errore indicano l'errore standard di tre esperimenti indipendenti. (C) curva dose-risposta l'assorbimento fluido per Ax2 cellule incubate con il nocodazole. Adattato da Williams & Kay 201824. L'assorbimento fluido è normalizzato per un controllo non trattato. Barre di errore indicano l'errore standard di tre esperimenti indipendenti. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocitosi, su larga scala non specifico di assorbimento fluido, sono importante in molti settori della biologia clinica tra cui immunologia, infezioni, cancro e nelle malattie neurodegenerative. Qui, le tecniche esistenti sono state adattate per consentire la risoluzione di alto-rendimento, cella singola misura di Macropinocitosi nel Macropinocitosi modello organismo Dictyostelium discoideum mediante citometria a flusso.

Misurazione di alto-rendimento di Dictyostelium discoideum Macropinocitosi tramite flusso Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

high-throughput-measurement-dictyostelium-discoideum-macropinocytosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

7.7K Views.  MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK. Macropinocitosi, su larga scala non specifico di assorbimento fluido, sono importante in molti settori della biologia clinica tra cui immunologia, infezioni, cancro e nelle malattie neurodegenerative. Qui, le tecniche esistenti sono state adattate per consentire la risoluzione di alto-rendimento, cella singola misura di Macropinocitosi nel Macropinocitosi modello organismo Dictyostelium discoideum mediante citometria a flusso.

Video: High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: Immunoprecipitazione rilevato mediante citometria di flusso

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

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Biologia

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

High-Throughput misurazione e classificazione di P organici in campioni ambientali

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Indagare la funzione di Coronin A nel precoce fame di risposta<em&gt; Discoideum Dictyostelium</em&gt; Per aggregazione Dosaggi

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...