아프리카 trypanosomes는 인간 아프리카 trypanosomiasis, 또는 잠자는 질병 및 동물 아프리카 trypanosomiasis에 책임 있습니다. 잠자는 질병을 일으키는 원인이 되는 trypanosomes는 사하라 사막 이남아프리카에 있는 많은 지리적 인 foci에 존재하는 tsete 비행 전송된 protist 기생충입니다. 기생충의 검출은 진단, 처리 및 후속을 위해 필수적입니다.
세로고는 거짓 긍정과 불행하게도, 거짓 부정적인 결과를 줄 수 있습니다. 혈액의 검출을 돕기 위해, trypanosomes는 집중되어야 합니다. 다양한 기생충 농도 기술이 사용되었습니다.
가장 민감한 방법은 음이온 교환기의 컬럼에 의해 혈액에서 기생충의 분리입니다, DEAE 셀룰로오스 다음 원심 분리 및 현미경 관찰. 따라서 DEAE 셀룰로오스 방법은 가장 우수하며 현재까지 남아 있으며, 특히 현장 조건에서 인간 아프리카 트라이파노소미아증 진단을 위해 혈액으로부터 기생충을 시각화하고 격리하는 기준 방법입니다. 이 방법은 아프리카 trypanosomiasis에 대한 가장 적합한 진단은 또한 면역학, 생물학, 생화학, 제약 및 분자 생물학적 조사를위한 정제 된 기생충을 제공합니다.
실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 부합하는 모든 조사는 프랑스 당국으로부터 입수되었으며 사용된 모든 프로토콜은 현지 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 서면 프로토콜에 따라 각 물질을 계량합니다. 증류수를 추가하고 다음과 같은 완충 된 용액, 농축 인산염 완충식 2X를 만들기 위해 칼륨 이수소 인산염으로 pH 8에 정확하게 조정합니다.
인산염 완충식식염 포도당을 위해 증류수와 포도당을 추가하십시오. 용출 완충제 의 100 밀리리터의 경우 페니실린 밀리리터 당 100 단위, 연쇄상 구균의 밀리리터 당 100 마이크로 그램, 인산염 완충식 염료에 페놀 레드의 5 마이크로 그램 밀리리터를 추가하십시오. DEAE 셀룰로오스 100그램은 먼저 증류수 3리터로 세척한 다음 정착상태로 남겨집니다.
미세 입자는 폐기됩니다. 세퍼는 상체가 명확해질 때까지 반복됩니다. 농축 인산염 완충식식염 2X가 첨가되고 DEAE 셀룰로오스가 교반됩니다.
pH는 1개의 어금니 칼륨 인산염으로 8로 조정됩니다. 셀룰로오스는 증류수로 두 번 세척하고 인산염 완충식식염포도당으로 두 번 세척됩니다. DEAE 셀룰로오스 및 인산염 완충식식염 포도당은 동일한 부피로 혼합된다.
합금분기 및 실온 또는 4섭씨 또는 영하 20도에서 장기간 보관할 수 있습니다. Trypanosome 감염된 혈액은 액체 질소에 저장됩니다. 실온에서 1 밀리리터의 합금 쿼트가 해동됩니다.
기생충은 바늘과 1 밀리리터 주사기를 사용하여 냉동 튜브에서 조심스럽게 수집됩니다. 해동 된 기생충의 생존력은 감염 전에 가벼운 현미경 관찰에 의해 시각화된 운동성에 의해 평가됩니다. 기생충은 마우스 당 2개의 마우스, 500 마이크로리터의 복막 구멍으로 주입됩니다.
매일 감염 후, 기생충은 바늘로 꼬리에서 혈액 한 방울을 수집하고 현미경 검사에 의해 검사하여 평가됩니다. 기생충증이 적당한 수준에 있을 때, 감염된 혈액은 집합됩니다. 클램프 또는 홀더에 10 밀리리터 주사기가 지원되며 미리 절단된 필터 용지가 추가됩니다.
준비된 DEAE 셀룰로오스는 8밀리리터 수준까지 주사기에 부어집니다. 열은 용출 버퍼로 세척됩니다. 감염된 혈액의 2 밀리리터는 조심스럽게 기둥 위에 배치되고 trypanosomes는 50 밀리리터 원심 분리 튜브에서 열 용액에 수집됩니다.
용출 버퍼는 trypanosomes의 운송에 따라 정기적으로 추가됩니다. 컬럼을 통한 trypanosomes의 이동은 일정한 간격으로 열 을 한 방울씩 복용하고 가벼운 현미경 을 사용하여 trypanosomes를 관찰하여 검사됩니다. 시험용액이 용액에서 더 이상 관찰되지 않는 경우, 원심관은 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 800배 G에서 원심분리됩니다.
상체는 폐기되고 팔레트의 trypanosomes는 혈전계로 계산됩니다. 수집된 trypanosomes는 이후에 계획된 조사에 필요한 매체로 희석됩니다. 이 방법은 아프리카 trypanosomiasis에 대한 가장 적합한 진단은 면역학, 생물학적, 생화학, 제약 및 분자 생물학적 조사를위한 정제 된 기생충을 제공합니다.
이러한 연구는 DEAE 셀룰로오스 정제 기생충이 자연스럽거나 실험적으로 감염된 호스트, 특히 설치류로부터 대량으로 쉽게 얻을 수 있기 때문에 개발되었습니다. 제약 에이전트의 존재에 trypanosome 생존은 현미경 관찰에 의해 평가됩니다. 기생충 생존력은 운동성과 연관되고 그러므로, 40배 이상의 배율에서 광 현미경의 밑에 눈으로 검사될 수 있다.
기생충 생존력은 운동성 형태의 백분율을 측정하여 평가됩니다. 시험 화합물의 희석은 제어 우물이 치료되는 동안 96 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물에 추가됩니다. 각 농도는 삼중에서 평가됩니다.
각 희석에 대한 실행 가능한 기생충의 수는 제어 우물의 기생충 수와 비교됩니다. 인간 아프리카 트라이파노소미증 요법에 사용되는 참고 약물인 펜타미드의 효과가 이 그림에 표시됩니다. Trypanosome 대식세포 공동 배양은 세포 수준에서 호스트 기생충 상호 작용의 조사를 허용합니다.
대식세포 기생충 공동 배양에서, 여분의 세포 trypanosomes는 오르니틴에 arginine를 가수분해하는 대식세포 아르지나제의 생산을 유도합니다. 오르니틴은 기생충 생존과 성장에 필수적인 폴리 아민과 trypanothione의 선구자입니다. 또한, 아르기닌 고갈은 산화 분해 제의 생산을 감소시다.
이어서, 아르지나제 억제제의 첨가, 공동 배양에 S-L-시스테인은 대식세포 유발 기생충 성장을 극적으로 감소시킨다. 아르지나제 유도는 트립파놀배설 및 또는 분비된 요인에 의해 중재된다. 이 아르지나아제 유도 인자는 오틴 키네신으로 확인되었습니다.
키네신은 C형 렉틴 만노 결합 수용체에 결합한다. 아르지나제는 기생충 성장을 선호하는 오르니틴을 유발하고 생산합니다. 아르지나제는 대식세포 만노체가 삭제된 마우스로부터 12.5 밀리몰러 만노또는 대식세포에서 배양된 대식세포에서 키네신에 의해 유도되지 않는다.
DAEA 셀룰로오스 정제 된 trypanosomes를 이용한 세포 생물학 및 생화학 실험의 추가 예는 BILBO1과 같은 새로운 사이토켈레탈 단백질이 확인된 연구에서 입증됩니다. BILBO1은 중요한 사이토스켈레탈 구조및 기생충 생존의 생물 발생을 위해 요구됩니다. 따라서, BILBO1은 병원성 trypanosomes에 있는 내정간섭을 위한 중요한 표적을 나타냅니다.
혈류 배양 형태의 면역부동 표지를 보여주는 이미지, 항-BILBO1 항체로 프로브된 trypanosoma brucei 세포가 이 그림에 나타난다. 추가적으로, 포도당과 threonine 물질 대사는 DEAE 셀룰로오스 정제 된 trypanosomes를 사용하여 설명되었으며 이러한 과정에 관련된 효소는 실험적으로 검증되었습니다. 혈류 형성 된 trypanosomes에서 포도당과 threonine 대사의 회로도 표현이 그림에 표시 됩니다.
최근 개선된 데AE 셀룰로오스 컬럼에 의한 혈액에서 아프리카 trypanosomes의 정제는 발병 부위에 낮은 기생충을 가진 자연 호스트뿐만 아니라 실험 조사를 위한 기생충의 요구 사항에 대한 시도파놀터 검출을 위한 금 본위제로 남아 있습니다. 조사는 기생충 생존과 성장에 필수적인 역할을 하는 trypanosome 분자의 식별을 허용했습니다. 확인된 표적은 1개의 건강 접근에 있는 인간과 동물 둘 다를 위한 잠재적인 항원을 가진 미래 백신을 위한 기초를 나타낼 지도 모릅니다.
