Les trypanosomes africains sont responsables de la trypanosomique africaine humaine, ou de la maladie du sommeil et de la trypanosomique africaine animale. Les trypanosomes qui causent la maladie du sommeil sont les parasites protistes transmis par mouche tsé-tsé présents dans de nombreux foyers géographiques d’Afrique subsaharienne. La détection du parasite est essentielle pour le diagnostic, le traitement et le suivi.
Une sérologie peut donner de faux résultats positifs et malheureusement faux négatifs. Pour faciliter la détection dans le sang, les trypanosomes doivent être concentrés. Diverses techniques de concentration de parasites ont été utilisées.
La méthode la plus sensible est la séparation des parasites du sang par une colonne d’échangeur d’anion, la cellulose DEAE suivie d’une centrifugation et d’une observation microscopique. Par conséquent, la méthode de cellulose DEAE est la meilleure et reste à ce jour, la méthode de référence pour visualiser et isoler les parasites du sang pour le diagnostic de trypanosomique humaine africaine, en particulier dans les conditions de terrain. Cette méthode, le diagnostic le plus approprié pour la trypanosomique africaine fournit également des parasites purifiés pour des investigations immunologiques, biologiques, biochimiques, pharmaceutiques, et moléculaires biologiques.
Toutes les enquêtes conformes au guide de soins et d’utilisation des animaux de laboratoire et l’accord ont été obtenus des autorités de Français et tous les protocoles utilisés ont été approuvés par notre comité local d’éthique. Pesez chaque substance selon le protocole écrit. Ajouter l’eau distillée et ajuster précisément au pH 8 avec du phosphate de dihydrogène de potassium pour faire les solutions tamponnées suivantes, concentré phosphate tampon saline 2X.
Ajouter l’eau distillée et le glucose pour le glucose salin tamponné au phosphate. Pour 100 millilitres de tampon d’élitution, ajouter 100 unités par millilitre de pénicilline, 100 microgrammes par millilitre de streptomycine, et cinq microgrammes millilitres de rouge phénol au phosphate tamponné glucose salin. 100 grammes de cellulose DEAE sont d’abord lavés avec trois litres d’eau distillée, puis laissés à s’installer.
Les particules fines sont jetées. Les lavages sont répétés jusqu’à ce que le surnatant soit clair. On ajoute de la saline 2X tamponnée au phosphate concentré et la cellulose DEAE est agitée.
Le pH est ajusté à huit avec un phosphate de potassium molaire. La cellulose est ensuite lavée deux fois avec de l’eau distillée et deux fois avec du glucose salin tamponné au phosphate. La cellulose DEAE et le glucose salin tamponné phosphate sont mélangés en volumes égaux.
Alliage en quart et stocké à température ambiante ou à quatre degrés Celsius ou à moins 20 degrés Celsius pour un stockage prolongé. Trypanosome sang infecté est stocké dans de l’azote liquide. Un litre d’alliage d’un millilitre est décongelé à température ambiante.
Les parasites sont soigneusement prélevés sur le cryotube à l’aide d’une aiguille et d’une seringue d’un millilitre. La viabilité des parasites décongelés est évaluée par la motilité visualisée par l’observation de microscopie légère avant l’infection. Les parasites sont injectés dans les cavités péritonéales de deux souris, 500 microlitres par souris.
Chaque jour après l’infection, la parasitémie est évaluée en recueillant une goutte de sang de la queue à l’aide d’une aiguille et vérifiée par microscopie. Lorsque la parasitemie est à un niveau approprié, le sang infecté est recueilli. Une seringue de 10 millilitres est soutenue dans une pince ou un support et un morceau de papier filtre précoupé est ajouté.
La cellulose DEAE préparée est versée dans la seringue jusqu’au niveau de huit ou neuf millilitres. La colonne est lavée avec le tampon d’élitution. Deux millilitres de sang infecté sont soigneusement placés sur le dessus de la colonne et trypanosomes sont recueillis dans la colonne allonger dans un tube centrifugation de 50 millilitres.
Le tampon d’élitution est régulièrement ajouté en fonction du transit des trypanosomes. Le transit des trypanosomes à travers la colonne est vérifié en prenant une goutte d’allongement de colonne à intervalles réguliers et en observant les trypanosomes à l’aide d’une microscopie légère. Lorsque les trypanosomes ne sont plus observés dans l’élitate, le tube conique est centrifugé à 1 800 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Le supernatant est jeté et les trypanosomes dans la palette sont comptés à l’amiomètre. Les trypanosomes collectés sont ensuite dilués dans le milieu requis pour l’enquête prévue. Cette méthode, le diagnostic le plus approprié pour la trypanosomique africaine fournit des parasites purifiés pour des investigations immunologiques, biologiques, biochimiques, pharmaceutiques, et biologiques moléculaires.
Ces études ont été développées parce que les parasites purifiés à la cellulose DEAE peuvent être facilement obtenus en grande quantité à partir d’hôtes infectés naturellement ou expérimentalement et en particulier de rongeurs. La viabilité trypanosome en présence d’agents pharmaceutiques est évaluée par observation microscopique. La viabilité des parasites est associée à la motilité et, par conséquent, peut être vérifiée par les yeux sous un microscope léger à 40 fois ou un grossissement plus élevé.
La viabilité des parasites est évaluée en mesurant le pourcentage de formes motiles. Des dilutions des composés d’essai sont ajoutées dans chaque puits d’une plaque de culture de tissu de puits 96 tandis que les puits de contrôle sont simulés traités. Chaque concentration est évaluée en triplicate.
Le nombre de parasites viables pour chaque dilution est comparé au nombre de parasites dans les puits de contrôle. Les effets de la Pentamidine, un médicament de référence, utilisé dans la thérapie africaine humaine trypanosomique est affiché dans cette figure. Les co-cultures de macrophage trypanosome permettent l’investigation de l’interaction de parasite d’hôte au niveau cellulaire.
Dans les co-cultures de parasite de macrophage, les trypanosomes extra cellulaires induisent la production de macrophage arginase qui hydrolyse l’arginine à l’ornithine. L’ornithine est le précurseur des polyamines et des trypanothione, essentiels à la survie et à la croissance des parasites. En outre, l’épuisement de l’arginine diminue la production d’oxyde nitrique trypanocidal.
Par la suite, l’ajout d’un inhibiteur de l’arginase, la S-L-cystéine aux co-cultures réduit considérablement la croissance des parasites induits par le macrophage. L’induction d’arginase est médiée par des facteurs excrétés et ou sécrétés par trypanosome. Ce facteur induisant l’arginase a été identifié comme une kinésine orthine.
La kinésine se lie aux récepteurs de liaison de mannose de lectine de type C. Arginase est induite et produit de l’ornithine qui favorise la croissance des parasites. Arginase n’est pas induite par la kinésine dans les macrophages cultivés avec 12,5 millimolar mannose ou dans les macrophages de souris où les récepteurs macrophages mannose ont été supprimés.
D’autres exemples de biologie cellulaire et d’expérimentation biochimique utilisant des trypanosomes purifiés de cellulose DAEA sont démontrés dans des études où de nouvelles protéines cytosquelettiques telles que BILBO1 ont été identifiées. BILBO1 est nécessaire pour la biogenèse d’importantes structures cytosquelettiques et la survie des parasites. Ainsi, BILBO1 représente une cible importante pour l’intervention dans les trypanosomes pathogènes.
Une image montrant l’étiquetage d’immunoflourescence d’une forme de culture de sang, cellule de brucei de trypanosoma sondée avec un anticorps anti-BILBO1 est montrée dans cette figure. En outre, le métabolisme du glucose et de la thréonine ont été décrits à l’aide de trypanosomes purifiés de cellulose DEAE et les enzymes impliquées dans ces processus ont été validées expérimentalement. Une représentation schématique du métabolisme de glucose et de thréonine dans les trypanosomes sang-formés est montrée dans cette figure.
La purification des trypanosomes africains à partir du sang par anion échange des colonnes de cellulose DEAE avec des améliorations récentes reste l’étalon-or pour la détection du trypanosome, non seulement chez les hôtes naturels avec de faibles parasites dans les zones endémiques, mais aussi pour l’exigence de parasites en grand nombre pour des études expérimentales. Les investigations ont permis d’identifier des molécules trypanosome jouant un rôle essentiel dans la survie et la croissance des parasites. Les cibles identifiées pourraient représenter la base d’un futur vaccin avec des antigènes potentiels pour les humains et les animaux dans une approche unique en matière de santé.
