Name: genetic incorporation of biosynthesized l-dihydroxyphenylalanine (dopa) and its application to protein conjugation
Uploaded: 2018-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation at JoVE.com

이 연구는 글로벌 프 런 티어 연구 프로그램 (NRF-2015M3A6A8065833)에 의해 지원 되었다 그리고 기본 과학 연구 프로그램 (2018R1A6A1A03024940)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부에 의해 자금.

1. 플라스 미드 건설
<ol><li>제정 발기인의 통제 Citrobacter freundii 에서 TPL 유전자와는 그의 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 표현 하는 식 플라스 미드 (pBAD-듀얼-TPL-GFP-WT) 생성6-태그의 통제는 araBAD 발기인입니다. PBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG, (E90) 사이트에 대 한 codon의 사이트 지시 된 mutagenesis 프로토콜을 사용 하 여 호박 codon (태그)와 DOPA 교체 합니다. 이 플라스 미드의 건설에 대 한 자세한 내용은 우리의 이전 보고서18에서 설명 했다.</li>
	<li>TRNA/aaRS 표현 플라스 미드 (pEVOL-DHPRS2)18,19 DOPA의 유전자 결합에 대 한 생성 합니다. pEVOL 독립적인 발기인 aaRS 유전자의 두 복사본을 표현 하는 특별 한 플라스 미드 벡터 이며, 플라스 미드의 자세한 정보는 이전 보고서19에서 설명 합니다.</li>
	<li>고 순도 플라스 미드 DNAs를 상업적으로 사용할 수 있는 플라스 미드 준비 키트를 사용 합니다. 필요한 경우에 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 준비한 DNAs의 순도 확인 합니다.</li>
</ol>2. 문화 준비
<ol><li>
Electroporation
	<ol>
<li>이 실험에 대 한 사용 전기 유능한 대장균 DH10β 스트레인. 유능한 세포의 20 µ L를 각 플라스 미드 DNA (pEVOL-DHPRS2와 pBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG)의 1 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 만들기 위해 그들을 피 펫을 사용 하 여 균질 혼합 믹스.</li>
		<li>Electroporation 큐 벳에 혼합물을 전송. 장소 electroporation 약 실에 있는 베트입니다. 회사 베트-챔버 수 있도록 챔버에는 베트를 밀어 문의.</li>
		<li>멧, 25 µ F를 사용 하 여 충격 및 2.5 kV 0.1 cm 큐 벳을 위해.</li>
		<li>1 mL prewarmed 슈퍼 최적의 국물 (SOC)의 2% (w/v) tryptone 포함 된 추가, 0.5% (w/v) 추출, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2, 및 베트에 20 mM 포도 당을 효 모 문화 관에는 셀을 전송. 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 대 한 그들을 배양 하 여 세포를 구출.</li>
		<li>10-100 µ L 35 µ g/mL 페니와 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 lysogeny 국물 (파운드) 한 접시에 구조 세포의 확산. 16 h 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
초보 문화 준비
	<ol>
<li>단일 변환 된 식민지 파운드 매체 포함 된 항생제의 5 mL에 접종 떨고와 37 ℃에서 12 h에 대 한 식민지를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 표현과 GFP-E90DOPA 생 합성 시스템의 정화
<ol><li>
GFP E90DOPA 생 합성 시스템에 의해 표현
	<ol>
<li>PA-5052 중간20 (50 m m 나2HPO4, 50 m m KH2포4, 25 mM [NH4]24, 2mm MgSO4, 0.1% [w/v] 추적 금속, 0.5% [w/v] 글리세롤, 그래서 100 mL를 선발 문화 (2 mL)를 전송 0.05% [w/v] 포도 당, 및 5% [w/v] 아미노산 [pH 7.25]) 떨고와 30 ° C에 외피 다음 35 µ g/mL 페니, 100 µ g/mL 암 피 실린, 100 mM pyruvate, 10 m m catechol, 25 mM 암모니아, 그리고 300 µ M dithiothreitol (DTT).</li>
		<li>때 0.2% (w/v) L arabinose의 2 개 mL를 추가 550 nm에 도달 0.8에서 광학 밀도 (OD). 떨고와 30 ° C에 12 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		<li>5 분 11000 x g에서 셀 아래로 회전, 상쾌한, 삭제 시키고-80 ° c.에 셀 펠 릿을 동결</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 세포의 용 해
	<ol>
<li>얼음에 셀 펠 릿을 녹여 및 50 mM NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 셀 resuspend 10 m m 이미, 및 300 mM NaCl.</li>
		<li>25의 10 분 사용 80% 쥡니다 진폭 펄스에 대 한 얼음에 resuspended 셀 sonicate s 오프 및 35 s.</li>
		<li>15 분 이전에 상쾌한 정화에 대 한 신선한 튜브 4 ° C에서 18000 x g에서 lysate 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 펠 릿을 삭제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ni NTA 친화성 크로마토그래피
	<ol>
<li>상쾌한에 Ni NTA (nitrilotriacetic 산) 수 지 (100 mL 문화에 대 한 수 지 서 스 펜 션의 300 µ L)를 추가 하 고 부드럽게 흔들어 1 시간에 대 한 서 스 펜 션으로 단백질을 4 ° C에서 Ni NTA 수 지에 바인딩할.</li>
		<li>폴 리 프로필 렌의 열 정지를 전송 하 고 3 수 지 세척 50mm NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 워시 버퍼의 5 mL x 20 m m 이미, 및 300 mM NaCl.</li>
		<li>3 단백질을 elute 50mm NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 차입 버퍼의 300 µ L x 250 m m 이미, 및 300 mM NaCl.</li>
		<li>280에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 농도 결정 nm. 280에서 GFP-E90DOPA에 대 한 소멸 계수 (24,630 M-1c m-1) nm 단백질 소멸 계수 계산기를 (예, https://web.expasy.org/protparam/)와 독립적으로 측정 된 멸종에 의해 산출 되었다 coefficiennt (2630 M-1c m-1) DOPA 대체 방법으로 단백질 농도의 결심을 위한 Bradford 단백질 분석 결과21 을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 순화 GFP-E90DOPA oligomerization
<ol><li>나트륨의 1 µ L H2O (6 m m) periodate 추가 (1.0 equiv. GFP E90DOPA를) GFP E90DOPA의 20 µ L의 솔루션 (300 μ M) 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼에 300 mm NaCl.</li>
	<li>48 h 25 ° C에서 진행 oligomerization 반응을 수 있습니다.</li>
	<li>나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 반응 혼합물 분석) (SDS 페이지) 6 단계에 설명 된 대로.</li>
</ol>5. SPOCQ에 의해 Alkyne 프로브 GFP-E90DOPA의 활용
<ol><li>Cy5.5 연결 azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4.0 m m) 1 µ L을 추가 (10 equiv. GFP E90DOPA를) GFP E90DOPA의 20 µ L의 솔루션 (20 µ M) 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼에서 300 mm NaCl.</li>
	<li>나트륨의 1 µ L H2O periodate 추가 (400 µ M) (1.0 equiv. GFP E90DOPA에) 반응 혼합물에.</li>
	<li>1 시간에 25 ° C에서 진행 SPOCQ 반응을 수 있습니다. 빛에 민감한 프로브를 사용 하는 알루미늄 호 일로 반응 배를 커버.</li>
</ol>6입니다. 레이블이 GFP의 정화
<ol><li>50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼를 추가 하 여 SPOCQ 반응 혼합물을 희석 및 300 mM NaCl, 최대 500 µ L.</li>
	<li>원심 필터 스핀 열 희석된 솔루션을 전송 합니다. 15 분 동안 4 ° C에서 14000 x g 에서 스핀 열 원심 그리고 흐름을 통해 삭제. 어떤 초과 Cy5.5 ADIBO를 제거 하려면이 단계 3를 반복 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 스핀 열에서 정화 샘플을 전송.</li>
	<li>또는, 동일한 버퍼에 대 한 투 석으로는 정화 실시 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 순화 된 GFP를 저장</li>
</ol>7. SDS 페이지 분석 및 형광 젤 검색
<ol><li>5 µ L의 단백질 견본 버퍼를 추가 하 여 SDS 페이지 분석 단백질 견본 준비 ( 재료의 표참조)와 2 µ L DTT (1.00 M)의 정화, 또는 원유, 13 µ L 표시 GFP (13.6 µ M 또는 0.38 mg/mL). Oligomeric GFP의 분석, GFP (67.8 µ M 또는 1.9 mg/mL)의 높은 농도 사용 하 여. 10 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 단백질을 변성.</li>
	<li>전기 이동 법 셀 4%-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지 젤 카세트 (구입, premade 젤 카세트)를 배치 하 고 실행 중인 버퍼 추가 ( 재료의 표참조). 단백질 견본 및 분자량 마커를 로드 합니다. 200 V에서 35-40 분 동안 전기 이동 법을 실행 합니다. 참고: 단백질 샘플 사진 표백 형광 프로브의 최소화 하기 위해 어둠 속에서 모든 프로세스를 수행 하 여 빛의 어떤 노출을 피하십시오.</li>
	<li>형광 스캐너를 사용 하 여 형광 이미징에 대 한. 단백질 젤 전기 이동 법에서 랩 하 고 형광 스캐너에 놓습니다. 적절 한 파장 설정을 사용 하 여 젤을 스캔. Cy5.5, 스캐너 소프트웨어에 제공 Cy5 모드를 선택 합니다.</li>
	<li>상업적인 단백질 염색 시 약으로 젤을 얼룩.</li>
</ol>8. MALDI TOF MS 분석 트립 신 소화
<ol><li>순화 된 GFP-E90DOPA (2.2 mg/mL 또는 80 µ M) (w/v) SDS, 50 mM Tris HCl (pH 8.0), 0.1%를 포함 하는 버퍼에 및 1 시간에 60 ° C에서 25 mM DTT의 100 µ L를 품 어.</li>
	<li>Iodoacetamide H2O (IAA, 4.0 M)의 1 µ L 추가 (500 equiv. GFP E90DOPA에) 동일한 버퍼에 순화 된 GFP E90DOPA 솔루션 (80 µ M). 빛 으로부터 보호 30 분 동안 25 ° C에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>트립 신 (1: 100 효소-기질 단백질 비율 [w/w])을 추가 하 여 GFP E90DOPA 샘플을 소화 하 고 4 h 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
	<li>C18 스핀 열 표준 염 메서드를 사용 하 여 소화 펩 티 드 샘플을 정화.</li>
	<li>매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MALDI TOF MS) 매트릭스23으로 알파-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA)를 사용 하 여에 대 한 보고 된 프로토콜에 의해 소화 펩 티 드를 분석 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+hydroxylase:+The+initial+step+in+norepinephrine+biosynthesis.">Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).</li><li>Pinder, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+dopamine+derivatives+capable+of+crossing+the+blood-brain+barrier+in+relation+to+parkinsonism.">Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism.</a> Nature. 228 (5269), 358 (1970).</li><li>Waite, J. H., Tanzer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenolic+substance+of+mytilus+edulis:+novel+adhesive+containing+L-DOPA+and+hydroxyproline.">Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline.</a> Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).</li><li>Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanics+of+mussel+adhesion.">Single-molecule mechanics of mussel adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).</li><li>Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyarginine-containing+polyphenolic+proteins+in+the+adhesive+plaques+of+the+marine+mussel+Mytilus+edulis.">Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).</li><li>Waite, J. H., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphoprotein+from+the+adhesive+pads+of+Mytilus+edulis.">Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis.</a> Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).</li><li>Nicklisch, S. C., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+The+role+of+redox+in+DOPA-mediated+marine+adhesion.">Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion.</a> Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).</li><li>Silverman, H. G., Roberto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+marine+mussel+adhesion.">Understanding marine mussel adhesion.</a> Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).</li><li>Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+adhesives+and+coatings.">Mussel-inspired adhesives and coatings.</a> Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).</li><li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+cross-linking+with+genetically+incorporated+3,4-dihydroxy-L-phenylalanine.">Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine.</a> ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).</li><li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+approach+to+transform+low-affinity+peptides+into+protein+probes+with+cotranslationally+expressed+chemical+cross-linker.">A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker.</a> Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).</li><li>Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+non-canonical+amino+acid+design+to+covalently+crosslink+an+antibody-antigen+complex.">Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex.</a> Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).</li><li>Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodate-triggered+cross-linking+of+DOPA-containing+peptide-protein+complexes.">Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).</li><li>Borrmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-promoted+oxidation-controlled+cyclooctyne-1,2-quinone+cycloaddition+(SPOCQ)+for+fast+and+activatable+protein+conjugation.">Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).</li><li>Ayyadurai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective,+sensitive,+and+reversible+biosensor+by+the+genetic+incorporation+of+a+metal-binding+site+into+green+fluorescent+protein.">Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).</li><li>Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+protein+nanoparticles+containing+iron(III)-DOPA+complexes+for+pH-responsive+drug+delivery.">Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).</li><li>Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+a+redox-active+amino+acid+into+proteins.">Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).</li><li>Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+L-dihydroxyphenylalanine+(DOPA)+biosynthesized+by+a+tyrosine+phenol-lyase.">Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase.</a> Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis.">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li><li>Gobom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+affinity+sample+preparation.+A+protocol+for+MALDI-MS+peptide+analysis+in+proteomics.">Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics.</a> Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).</li><li>Mukai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproductive+Escherichia+coli+cells+with+no+specific+assignment+to+the+UAG+codon.">Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon.</a> Scientific Reports. 5, 9699 (2015).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomically+recoded+organisms+expand+biological+functions.">Genomically recoded organisms expand biological functions.</a> Science. 342 (6156), 357-360 (2013).</li><li>Bryson, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+directed+evolution+of+aminoacyl-tRNA+synthetases.">Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases.</a> Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).</li><li>Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+amber+suppressor+tRNAs+for+efficient+bacterial+production+of+proteins+containing+nonnatural+amino+acids.">Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+strategy+for+selective+phosphoserine+incorporation+in+histones.">A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).</li><li>Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+multiple+unnatural+amino+acids+via+evolution+of+a+quadruplet-decoding+ribosome.">Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome.</a> Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+reactions+for+labeling+proteins.">Bioorthogonal reactions for labeling proteins.</a> ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry.">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li><li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes.">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 생 합성 및 직접 설립 DOPA의 설명 되어 있습니다. 이 방법에 사용 되는 세균성 셀 추가 아미노산을 합성 하 고 단백질 합성에 대 한 부자연 스러운 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다. 부자연 스러운 아미노산의 유전자 결합 확장된 유전자 코드와 부자연 스러운 생물의 개발을 위한 핵심 기술 되었습니다. 그러나,이 메서드는 기술적으로 완료 되었습니다 하 고 관 효율을 향상 시키고 생 번역 시스템에 섭 동을 최소화 수정 되 고. 최근에, 방법에 상당한 진보가 codons24,25 부자연 스러운 아미노산 및 엔지니어링 직교 변환 구성 요소26,27,28 재할당 함으로써 달성 되었습니다. ,29. 이 개선 이외에 여기에 설명 되어의 시스템 확장된 유전자 코드와 부자연 스러운 유기 체에 다른 기능을 제공: 부자연 스러운 아미노산의 생 합성. 이 기능은 확장 된 유전 레 퍼 토리를 가진 유기 체로 더 많은 독립 부자연 스러운 시스템을 제공합니다. 또한, DOPA 세균 스트레인 3mm DOPA, 크게 감소, 세포 성장에서 그리고이 방법에 사용 되는 낮은 단백질 수율 결과에 온건한 독성을 보여줍니다. 직접 설립 시스템을 사용 하 여 독성은 감소 하 고 단백질 수율 증가 삼 배.
DOPA의 유전 결합 사용 aaRS 돌연변이 적당 한 효율성 및 충실도 고 DOPA의 낮은 농도에서 티 르. 18 그러므로 DOPA 세균성 세포에서의 생 합성 이어야 한다 Tyr 설립을 방지 하기 위해 충분히 효율적. Catechol, 암모니아, 그리고 pyruvate에서 TPL에 의해 DOPA 생 합성은 가역 반응, 그리고 시작 물자의 높은 농도 효율적인 생 합성에 대 한 필요 합니다. 그러나, catechol 사용할 수 없습니다 10 밀리미터 이상 독성 박테리아 스트레인이이 프로토콜에 사용 되는 때문에. DTT 농도 또한이 프로토콜에 중요 하다. DOPA L-dopaquinone로 변환 됩니다 DTT 산화 속도 줄이기 위해 성장 매체에 추가 됩니다 때 그것의 독성을 보여줍니다. DTT 농도 300 µ M 때 세포 성장 감소를 관찰 합니다. 따라서, 최적의 생 합성 및 DOPA의 설립, 문화 매체에 대 한 구성 요소 (특히 catechol 및 DTT) 해야 사용할 수 적절 한 농도에서이 프로토콜에서 설명 된 대로.
이 프로토콜은 또한 사이트별 단백질 활용에 대 한 DOPA 포함 된 단백질의 응용 프로그램을 설명합니다. L-dopaquinone 효율적으로 DOPA의 산화에 의해 생성 된 긴장된 alkyne 생화학 프로브에 연결 된 반응. 이 cycloaddition 반응 아민 또는 thiols 및 추가 반응 보다 일반적으로 더 빠릅니다. 그럼에도 불구 하 고, DOPA 산화 DOPA 포함 된 단백질 및 단백질에서 nucleophiles 여 및 추가 최소화 하기 위해 긴장된 alkyne 존재 밖으로 실행 되어야 한다. 따라서,이 반응에는 시 약의 추가의 순서는 중요 한.
많은 부자연 스러운 아미노산 단백질 활용에 대 한 사용할 수 있으며, 그들 중 일부는 빠른 반응 속도 우수한 활용 효율30,31,,3233달성. 이러한 아미노산 biorthogonal azides, alkynes, 긴장 된 알 켄 또는 alkynes, 및 tetrazines 같은 기능적인 그룹을 포함합니다. 들은 특정 단백질 활용에 대 한 유용한, 그들 중 많은 비싼 또는 상업적으로 액세스할 수, 그들의 응용 프로그램, 특히 필요한 대규모 단백질을 제한 하. 따라서, 저렴 한 원자재와 그것의 직접적인 법인 DOPA의 생 합성에 유용할 것 이다 생 화 확 적인 프로브 또는 약물 (항 체 의약품을 포함 하는 대규모 돌연변이 단백질을 필요로 하는 제약 및 산업 애플리케이션에 공액, ADC)입니다.

DOPA는 catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에 관련 된 아미노산 이다. 이 아미노산 티로신 hydroxylase 및 분자 산소 (O2)1에 의해 티 르에서 합성 됩니다. DOPA 도파민의 선구자 이며, 혈액-뇌 장벽 침투 수, 때문에 그것은2파 킨 슨 병 치료에 사용 되었습니다. DOPA 홍합 접착 단백질 (지도), 젖은 조건3,,45,,67에 홍합의 접착 속성에 대 한 책임은에 발견 된다. Tyr는 처음 DOPA 지도에서 발견 되는 tyrosinases8,9DOPA로 변환 됩니다 위치에 인코딩됩니다. 그것의 재미 있는 생 화 확 적인 특성 때문에 DOPA 다양 한 응용 프로그램에에서 사용 되었습니다. DOPA의 dihydroxyl 그룹은 화학적으로 산화, 경향이 그리고 아미노산 L-dopaquinone, melanins의 선구자로 쉽게 변환 됩니다. 그것의 높은 electrophilicity 때문에 L-dopaquinone와 그 파생 상품 가교 및 thiols 및 아민10,11,,1213와 활용에 대 한 사용 되었습니다. 1, 2-퀴 논 디 엔 cycloaddition 반응에 대 한 기능을 할 수 하 고 스트레인 승진 산화 제어 cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14bioconjugation에 대 한 사용 되었습니다. 또한, dihydroxyl 그룹 Fe3 + 와 Cu2 +같은 금속 이온을 킬레이트 수 고 DOPA를 포함 하는 단백질 약물 전달 및15,16을 감지 하는 금속 이온에 대 한 이용 되었습니다.
DOPA 유전자 단백질에는 직교 aminoacyl-tRNA (금주 모임-tRNA)와 aminoacyl-tRNA 합성 (aaRS) 쌍17 을 사용 하 여 통합 되었으며 사용 단백질 활용 및 가교10,11, 12,13. 이 보고서에서 실험 결과 프로토콜 DOPA biosynthesized 저렴 한 원자재와 bioconjugation 응용 프로그램에서의 유전 결합을 설명 합니다. DOPA biosynthesized TPL을 사용 하 고 catechol, pyruvate, 및 대장균에서 암모니아에서 출발 이다. DOPA biosynthesized DOPA에 대 한 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍으로 표현 하 여 단백질에 직접 통합 됩니다. 또한, 포함 된 DOPA biosynthesized 단백질 site-specifically 형광 프로브와 단백질 올리고 생산 가교 된 활용 된. 이 프로토콜와 단백질 생화학 프로브 또는 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 약물을 켤레 biosynthesize 돌연변이 단백질 DOPA 포함 된 단백질 과학자에 대 한 유용할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Plasmid Construction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG</td><td></td><td></td><td>optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>Plasmid pEvol-DHPRS2</td><td></td><td></td><td>1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).</td></tr><tr><td>DH10&amp;beta;</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression Host</td></tr><tr><td>Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Culture preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2.1) Electroporation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro pulser&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Micro pulser cuvette</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1 cm electrode gap, pkg. of 50</td></tr><tr><td>Ampicillin Sodium</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Pyrocatechol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1387</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0943</td><td>500 g</td></tr><tr><td>pyruvic acid, 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13875</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0891</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Potassium phophate, monobasic, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1127</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate, anhydrous, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>M0146</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>D(+)-Glucose, anhydrous, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>D0092</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Glycerol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0269</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Trace metal mix a5 with co</td><td>Sigma</td><td>92949</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>L-Proline, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1257</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine, 98.5%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1982</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>JUNSEI</td><td>49550-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Arginine, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1149</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Glutamine, 98%</td><td>JUNSEI</td><td>27340-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Asparagine monohydrate, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1198</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>JUNSEI</td><td>73190-0410</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0604</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Threonine, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T2938</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Glycine, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0286</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0233</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Alanine, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1543</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Isoleucine, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I1049</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Valine, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>V0088</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>SAMCHUN</td><td>S2447</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Aspartic acid</td><td>SAMCHUN</td><td>A1205</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Lysine monohydrochloride, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>L0592</td><td>25 g</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3.2 Cell lysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazole, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodium Chloride, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters</td><td>SONIC &amp;amp; MATERIALS</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resin</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Polypropylene column</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/pack, 1 mL capacity</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium periodate, 99.8&amp;amp;</td><td>Acros</td><td>419610050</td><td>5 g</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne&amp;ndash;1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ)&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&amp;nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1mg</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. Purification of Labeled GFP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/pack, 500ul capacity</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES running buffer</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12 well</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>G:BOX Chemi Fluorescent &amp;amp; Chemiluminescent Imaging System</td><td>Syngene</td><td></td><td>G BOX Chemi XT4</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dodecyl sulfate sodium salt, 85%</td><td>SAMCHUN</td><td>D1070</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Trypsin Protease, MS Grade</td><td>Thermofisher</td><td>90057</td><td>5 x 20 &amp;micro;g/pack</td></tr><tr><td>C-18 spin columns</td><td>Thermofisher</td><td>89870</td><td>25/pack, 200 &amp;micro;L capacity</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitirile, 99.5%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0125</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Sigma</td><td>C2020</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1666</td><td>100 g</td></tr><tr><td>MTP 384 target plate ground steel BC targets</td><td>Bruker</td><td>8280784</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genetic incorporation of biosynthesized l-dihydroxyphenylalanine (dopa) and its application to protein conjugation

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에는 아미노산 이다. 그것의 특정 생 화 확 적인 특성 때문에 아미노산 생화학 응용 프로그램에서 여러 사용 하고있다. 이 보고서 biosynthesized DOPA의 유전자 결합에 대 한 프로토콜 및 단백질 활용의 응용에 설명합니다. DOPA는 티로신 페 놀-lyase (TPL) catechol, pyruvate, 암모니아에서 의해 biosynthesized 이며 아미노산 진화 aminoacyl-tRNA와 aminoacyl-tRNA 합성 쌍을 사용 하 여 유전 결합 방법으로 단백질에 직접 통합 됩니다. 이 직접 설립 시스템 DOPA에 대 한 이전 유전 법인 시스템 보다 더 나은 단백질 수확량과 다른 천연 아미노산의 작은 합동 DOPA을 효율적으로 통합. DOPA 포함 된 단백질 단백질 활용 효율적이 고 사이트 이며 다양 한 응용 프로그램에 대 한 그것의 유용성을 보여줍니다. 이 프로토콜 단백질 과학자를 DOPA 원하는 사이트와 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 그들의 활용을 포함 하는 돌연변이 단백질의 효율적 생 합성에 대 한 자세한 절차를 제공 합니다.

TPL에서 DOPA biosynthesized의 직접 통합 식 시스템은 그림 1에 표시 됩니다. 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍에 대 한 유전자를 플라스 미드에 배치 됩니다 위치 90에서 호박 codon를 포함 하는 GFP 유전자 (GFP-E90TAG) GFP 형광에 의해 DOPA의 평가에 다른 플라스 미드에 위치 하 고. TPL 유전자는 GFP 유전자를 포함 하는 동일한 식 플라스 미드에 배치 하 고 constitutively DOPA 생 합성의 수익률을 극대화 하기 위해 표현. 이 식 시스템을 사용 하 여, DOPA 생 합성에 대 한 최적의 조건은 상영 했다. 이 실험 포함 된 25mm 암모니아 및 100 mM pyruvate, catechol (0-10 m m)의 다양 한 농도와 사용 되는 성장 매체. Catechol 집중 했다 암모니아 그리고 pyruvate 농도 이상 25 m m와 100 m m, 동안 DOPA 생 합성에 대 한 중요 한 각각 미치지 않았다 생 합성 및 DOPA의 설립. Catechol의 최적 농도 10 m m, 그리고 이상의 10 m m의 농도 크게 그것의 세포 독성 때문에 세균성 세포 성장을 감소. 이 최적의 조건에서 DOPA 되었고 그 시작 소재로 TPL에 의해 biosynthesized biosynthesized DOPA 직접 GFP에 통합 되었다. 표현된 돌연변이 GFP (GFP-E90DOPA) 정화 되었고 SDS 페이지 (그림 2A)에 의해 분석. 전체 길이 GFP 정화 했다, 그리고 DOPA 법인 MALDI TOF MS 분석 (그림 2B)에 의해 확인 되었다. 단백질은 트립 신을 소화 했다, 펩 티 드 조각 DOPA를 포함 분석, 그리고 결과 DOPA 아니 감지 Tyr와의 독점 설립 또는 다른 천연 아미노산 관을 보여주었다. TPL에 의해 DOPA biosynthesized의 관 효율 3 m DOPA DOPA의 최대 농도 세포 독성19때문에 관 효율 유사 했다. 10 m m catechol 보였다 온건한 독성, 비록 문화 시간 16 h 후 셀 밀도가 했다 3-사중 3mm DOPA 존재 보다 높은. 생 합성으로 순화 된 단백질 수율 보다 3mm DOPA (그림 3)를 사용 하 여 실험에서 삼 배 높았다.
DOPA 포함 된 GFP 단백질 활용을 위해 사용 되었다 돌연변이. DOPA 온화한 산화 제에 의해 L-dopaquinone로 산화 수 그리고 electrophilic quinone 긴장된 alkynes와 thiols 등 아민, nucleophiles 반응 bioconjugation (그림 4)에 사용할 수 있습니다. GFP-E90DOPA 나트륨과 반응 하 여 SPOCQ cycloaddition에 대 한 테스트 되었습니다 periodate, Cy5.5 ADIBO22와 치료. 이 SPOCQ 반응 SDS 페이지와 형광 이미징(그림 5)에 의해 분석 되었다. 강렬한 형광 밴드 관찰 되었다 나트륨의 치료와 함께 periodate Cy5.5-ADIBO, 형광 밴드 없음 제어 반응 GFP WT와 함께 또는 없이 나트륨에에서 표시 되었다 periodate 처리, 효율성과 특이성의 확인은 유전자 법인된 DOPA와 활용 반응입니다. 또한, DOPA 포함 된 GFP 단백질 oligomerization 위해 사용 되었다. L-dopaquinone 반응 리스 또는 Cys 같은 단백질 oligomeric 단백질에서 발생 합니다. GFP-E90DOPA로 대우 되었다 나트륨 periodate는 oligomerization 48 h에 대 한 실시 및 반응 분석 SDS 페이지 컨트롤 샘플에 비해는 나트륨 periodate 치료 (그림 5B) 없이. 분석은 컨트롤 샘플 보여 다른 밴드 없이 그대로 단백질 동안 동등 하 게 간격 둔된 단백질 밴드 periodate 처리 샘플에 대 한 명확한 oligomerization 패턴을 보였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58383/58383fig1.jpg"> 그림 1 : DOPA biosynthesized catechol, pyruvate, 및 암모니아의 직접. DOPA는 catechol, pyruvate, 그리고 성장 매체에서 암모니아에서 heterologously 표현된 TPL에 의해 biosynthesized 이다. DOPA에 대 한 진화 tRNA/aaRS 쌍은 공동 대상 단백질, GFP로 biosynthesized DOPA를 통합 하는 표현 이다. TPL 유전자는 GFP 식 유도 하기 전에 DOPA 생 합성을 시작 하기 위해 제정 발기인에서 배치 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58383/58383fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58383/58383fig2.jpg"> 그림 2 : GFP E90DOPA 생 합성 시스템 설계에 의해 표현의 SDS 페이지 및 TOF MALDI MS 분석. (A) GFP-E90DOPA 10 m m catechol, 100 mM pyruvate, 및 25 mM 암모니아의 존재 생 합성 시스템 설계에 의해 표현 되었고 Ni NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 다음. GFP WT도 비교 분석 했다. 샘플 페이지-두번째-트리 스 4%-12 %SDS, 구분 했다 그리고 젤 Coomassie 화려한 블루 R-250 물 했다. (B) DOPA GFP E90DOPA의 tryptic 소화에서 포함 된 펩 티 드 파편의 MALDI TOF MS 분석. GFP WT에서 펩 티 드 조각 잔류물을 86-96 (SAMPEGYVQER)에 포함 되어 있습니다. GFP WT에서 조각에 Glu DOPA GFP E90DOPA에서 펩 티 드 조각에서 바뀝니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58383/58383fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58383/58383fig3.jpg"> 그림 3 : DOPA의 일반적인 유전자 결합으로 biosynthesized DOPA의 직접 관 비교. 이러한 패널 표시 GFP E90DOPA 생 합성 시스템 설계 및 3mm DOPA 추가 pyruvate, 암모니아, 그리고 catechol 없이 존재 유전자 결합으로 표현. (A) 단백질 수율 순화 GFP-E90DOPA, 그리고 (B) 유도 후 16 h 셀 밀도 측정에서 얻은 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58383/58383fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58383/58383fig4.jpg"> 그림 4 : GFP E90DOPA의 bioconjugation의 반응 계획. GFP E90DOPA dopaquinone DOPA 변환할 산화 이다. 긴장된 alkyne와 포함 하는 dopaquinone 단백질의 반응 사이트 단백질 라벨을 달성 한다. 오랜 시간 (48 h)에 대 한 높은 농도에서 포함 하는 dopaquinone 단백질의 외피 단백질 올리고 생산 단백질 자체 활용 하면 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58383/58383fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58383/58383fig5.jpg"> 그림 5 : DOPA를 포함 하는 돌연변이 단백질의 Bioconjugation. (A) SPOCQ 긴장된 alkyne, ADIBO-Cy5.5 DOPA 포함 된 단백질의 반응. GFP WT와 GFP E90DOPA 나트륨으로 치료 periodate 및 ADIBO Cy5.5와 60 분에 대 한 반응. SDS 페이지 및 Coomassie 스테인드 (위)에 의해 반응을 분석 했다 고 형광 (아래) 이미지가 표시 됩니다. GFP E90DOPA의 (B) Oligomerization. DOPA 포함 된 GFP 나트륨으로 치료 했다 periodate 및 48 h에 대 한 인 큐베이 팅. 반응 혼합물이 SDS 페이지 분석 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58383/58383fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합

여기, 우리가 현재 간단한 시작 소재로 L dihydroxyphenylalanine biosynthesized의 유전 결합 그리고 단백질 활용에의 응용에 대 한 프로토콜.

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

genetic-incorporation-biosynthesized-l-dihydroxyphenylalanine-dopa

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

7.8K 조회수.  Sogang University. 여기, 우리가 현재 간단한 시작 소재로 L dihydroxyphenylalanine biosynthesized의 유전 결합 그리고 단백질 활용에의 응용에 대 한 프로토콜.

비디오: Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is protein conjugation by genetically introducing an unnatural amino acid containing a bioorthogonal functional group. This report describes a detailed protocol for site-specific antibody conjugation. The protocol includes experimental details for the genetic incorporation of an azide-containing amino acid, and the conjugation reaction by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strain-promoted reaction proceeds by simple mixing of the reacting molecules at physiological pH and temperature, and does not require additional reagents such as copper(I) ions and copper-chelating ligands. Therefore, this method would be useful for general protein conjugation and development of antibody drug conjugates (ADCs).

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

연구

생화학

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

화학

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different positions. Preclinical studies have shown that the therapeutic index of these traditional ADCs can be improved by the site-specific linkage of toxins. However, current approaches to produce homogeneous ADCs have several limitations, such as low protein expression and slow reaction kinetics. In this protocol we describe how to set up an expression system to incorporate a cyclopropene derivative of lysine (CypK) into antibodies using genetic code expansion. This minimal bioorthogonal handle allows rapid conjugation of tetrazine derivatives through an inverse-demand Diels-Alder cycloaddition. The expression system here reported enables the facile production and purification of trastuzumab bearing CypK in each of the heavy chains. We explain how to link the antibody to the toxin monomethyl auristatin E and characterize the immunoconjugate by hydrophobic interaction chromatography and mass spectrometry. Finally, we describe assays to assess the stability in human serum of the dihydropyridazine linkage resulting from the conjugation and to test the selective cytotoxicity of the ADC for breast cancer cells with high levels of HER2 receptor.

Incorporating a cyclopropene derivative of lysine into antibodies allows the site-specific, rapid and efficient linkage of tetrazine-bearing molecules to generate antibody-drug conjugates.

빠른 Bioorthogonal 반응을 통해 변화 항 체 의약품의 세대에 대 한 정식이 아닌 아미노산의 유전자 인코딩

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

생체공학

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

신경과학

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합

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정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는