대부분의 경우, 통상적인 부위-지시된 돌연변이유발은 단백질에서 프롤린의 기능적 역할을 연구하기에 적절하지 않다. 여기에서, 우리는 단백질 폴딩 및 기능에 대한 프롤린 잔기의 역할을 조사하기 위해 비정준 아미노산으로서 프롤린 유사체를 리보솜으로 합성된 단백질에 통합하는 방법을 제시한다. 프롤린을 표준 아미노산으로 대체하는 것은 위험한 접근법입니다.
프롤린 유사체의 혼입은 일종의 분자 수술을 허용합니다. 즉, 단백질 특성에 합리적으로 영향을 미치고 조작하기 위해 미묘한 분자 변화를 도입합니다. 프롤린 잔기는 단백질 스캐폴드의 안정성에 필수적인 역할을하기 때문에 우리의 기술은 인간의 특정 병리학 적 상태의 기초가되는 단백질 폴딩 결핍의 원인을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
프롤린 대체에 의해 유도되는 단백질 변경은 효소의 생명 공학 공학에 영향을 미치고 리보솜 단백질 번역 또는 폴딩의 향상을위한 기회를 제공합니다. 이 방법은 특별한 장비와 값 비싼 계측이 필요하지 않습니다. 프롤린 유사체를 첨가하기 전에 천연 프롤린이 E.coli 배양물에서 고갈되는 프로토콜 단계에 특별한주의를 기울여야합니다.
천연 프롤린을 사용한 형광 단백질의 생산을 시작하기 위해, 200 밀리리터의 신선한 NMM 배지를 2리터 삼각 플라스크에 2밀리리터의 밤새 배양물로 접종한다. 세포를 섭씨 37도에서 약 3.5시간 동안 220RPM의 오비탈 진탕기에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 동안, 30분마다 분광광도계에서 600나노미터에서 광학 밀도를 측정한다.
광학 밀도가 0.7에 도달하면 세포 현탁액을 스핀 다운하고 상층액을 폐기물로 부드럽게 떨어 뜨립니다. 이어서, 프롤린 없이 아미노산 또는 NMM이 없는 50밀리리터의 빙냉 NMM에 재현탁시켜 세포를 세척한다. 세포를 다시 회전시키고 상청액을 폐기물로 분해하십시오.
다음에, 프롤린이 없는 NMM의 200 밀리리터에 온화한 피펫팅에 의해 세포 펠릿을 재현탁시키고, 2리터 삼각 플라스크에서 암피실린으로 보충하고, 프롤린의 완전한 고갈을 허용하도록 30분 동안 오비탈 진탕기에서 세포를 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 50-밀리몰 스톡 용액으로부터 적절한 부피의 L-프롤린 또는 프롤린 유사체를 첨가하여 세포 현탁액 중의 일밀리몰 최종 농도를 얻었다. 다음으로, 일몰 원액으로부터 500-마이크로몰 IPTG를 첨가하여 표적 단백질 발현을 유도한다.
표적 단백질을 오비탈 쉐이커에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 발현시키고 다음날 광학 밀도를 측정한다. 원심분리를 통해 박테리아 세포를 수집하고 상층액을 폐기물로 데칸트하십시오. 이어서, 10% 글리세롤을 함유하는 결합 완충액 50 밀리리터에 조심스럽게 피펫팅함으로써 세포를 세척한다.
세포를 다시 회전시키고, 상청액을 데칸트하고, 추가로 사용할 때까지 영하 20 또는 80도에서 50밀리리터 튜브에 세포 펠릿을 저장한다. 형광 방출을 평가하기 전에 SDS-PAGE를 수행하여 샘플 순도가 95% 이상인지 확인한 다음 정제된 각 단백질 변이체의 샘플을 0.3 마이크로몰의 농도로 조정하고 적절한 파장에서 계산된 흡광도 값을 기준으로 취합니다. 대략적인 최종 샘플 부피가 200 마이크로리터인지 확인하십시오.
희석된 샘플이 실온에서 평형화되게 한다. 한 시간 후, 샘플을 일센티미터 석영 큐벳으로 옮기고 형광 분광계를 사용하여 샘플의 형광 방출 스펙트럼을 측정하였다. 변성을 유도하기 위해, 8.89몰 우레아 및 5.56-밀리몰 DTT를 함유하는 1.11X PBS 완충액의 18 마이크로리터에 300-마이크로몰 샘플의 두 마이크로리터를 첨가함으로써 각 단백질 변이체의 샘플을 20배 희석한다.
샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 5밀리몰 DTT를 함유하는 PBS 1,980 마이크로리터를 첨가하여 샘플을 100배 희석하여 렌처레이션을 유도하고, 즉시 200 마이크로리터의 샘플을 1센티미터 석영 큐벳으로 옮긴다. 석영 큐벳을 적절한 형광 분광계에 삽입하고 30분에 걸쳐 3초마다 형광 스펙트럼을 획득하여 단백질 재접힘을 모니터링합니다.
재접힘 샘플을 1.5밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴 다음, 뚜껑을 닫고 샘플을 어둠 속에서 실온에서 보관하여 EGFP 변이체의 완전한 재접힘을 허용한다. 24시간 후, 형광 회수의 시간적 종점을 포착하기 위해 이전과 동일한 여기 파장을 사용하여 리폴딩된 단백질 샘플의 형광 방출을 측정하였다. 천연 단백질을 발현하는 세포로부터의 펠릿 및 S-플루오로프롤린 및 데하이드로프롤린을 지닌 변이체는 무손상 발색단으로 인해 전형적인 밝은 색을 가졌다.
대조적으로, R-플루오로프롤린 및 디플루오로프롤린을 함유하는 변이체는 무색으로 남아있었고, 이는 봉입체에서 펼쳐진 단백질의 미스폴딩 및 침착을 나타낸다. SDS-PAGE 분석은 불용성 R-플루오로프롤린 함유 단백질의 존재를 검증하였다. 대조적으로, 천연 단백질 및 S-플루오로프롤린 및 데히드로프롤린-함유 변이체는 가용성 분획에서 발견되었다.
액체 크로마토그래피/질량 분광법 분석에서, S-플루오로프롤린을 사용한 각각의 프롤린 대체는 프롤린 잔기 당 양의 18-달톤 시프트를 생성하고, 데하이드로프롤린으로 대체하면 잔류물 당 두 달톤의 음의 이동이 생성되었다. 광 흡수 및 방출 스펙트럼에서, 발색단 흡광도는 EGFP의 경우 488 나노미터, NowGFP의 경우 493 나노미터에서 발견되었다. KillerOrange에서 발색단 흡광도 영역은 복합 발색단의 두 가지 가능한 구성 및 전하 상태에 해당하는 두 개의 밴드로 구성되었습니다.
또한, 상응하는 최대 흡광도 파장에서 여기시 기록된 형광 스펙트럼은 유사체가 발색단의 화학적 환경을 변화시키지 않았다는 것을 암시한다. 리폴딩 실험에서, 천연 EGFP 발색단 형광은 부분적으로 회복되었지만, 트립토판 특이적 형광은 재생 후 더 컸다. 데하이드로프롤린을 함유하는 변이체에 대해 유사한 거동이 관찰되었다.
EGFP 함유 S-플루오로프롤린에서, 295 나노미터 여기로 유사한 결과가 관찰된 반면, 형광은 488 나노미터에서 훨씬 더 높은 정도로 회복되었다. EGFP 변이체만이 트립토판 방출 회수가 발색단 방출에 비해 두 배 빠른 빠른 재접힘 동역학을 보여주었다. 적절한 성장 배지를 갖는 신선한 박테리아 배양물이 사용되어야 한다.
멸균 기술과 배양 성장의 정기적 인 모니터링은 또한 실험의 성공을위한 중요한 전제 조건입니다. 이 방법은 다른 표준 아미노산의 역할을 연구 할 수 있기 때문에 단백질 공학에 적용 할 수 있습니다. 이를 위해, 적합한 영양영양 E.coli 균주 및 아미노산 유사체가 필요하다.
전체 단백질의 질량 분광법은 비표준 아미노산 유사체의 혼입을 확인하기 위한 분석적 증거로서 요구된다. 프롤린 유사체를 통합하기 위한 SPI 방법은 단백질 백본을 직접 조작할 수 있게 해주며, 리보솜 번역 또는 폴딩의 글로벌 안정화 및 개선을 통해 합리적인 설계 및 단백질 생산 촉진에 이점을 제공합니다.
