이 연구는 도이치 가운데 (DFG) IRTG 1874 "당뇨병 microvascular 합병증" 내에서 CRC 1118 "후반 당뇨 합병증에 대 한 원인으로 반응성 대사 산물"에 의해 지원 되었다. C. 선 충 종자 N2 및 CL2166 CGC, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

참고:이 프로토콜 5 개의 섹션으로 나누어져 있습니다. 섹션 1-3, C. 선 충 에 대규모 문화 주요 프로토콜 제공 됩니다. 섹션 4와 5 exemplified metabolites 당뇨병 대사 산물에서 발생의 평가 대 한 추가 프로토콜을 제공 합니다. 자세히 섹션 1 접시에는 일반적인 대규모 문화를 설명합니다. 섹션 2 섹션 3 대규모 샘플의 수확을 설명 하는 반면 C. 선 충, 대용량의 전송에 중점을 둡니다. 제 4 샘플에서 단백질 격리를 설명 하 고 섹션 5 후속 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 분석을 위해 견본 준비에 설명 합니다.
1. 대규모 문화 접시에
<ol><li>일반적으로, 메 마른 후드 또는 오염 방지 하려면 화로 옆 작동 합니다.</li>
	<li>
문화에 웜 젊은 성인 단계를 도달할 때까지 따라 다음 적응이 이전에 게시 프로토콜7 .
	<ol>
<li>생활 OP50 대장균 박테리아를 사용 하 여 선 충을 먹이 400 µ M fluorodeoxyuridine agar (안 암 피 실린/FUdR) 실험에 대 한 준비.</li>
		<li>동기 인구의 준비를 위해 unconcentrated OP50, 사용 하 고 성인과 실험 성공에 대 한 사용 하 여 3.3 집중된 OP50 x는 상쾌한의 70%를 제거 하 여.</li>
		<li>매일 먹이 간격으로 것이 좋습니다. 산화 스트레스를 평가할 때는 다른 간격 및 먹이 대 한 볼륨 방해할 수 있습니다 결과.</li>
		<li>접종, 여러 선 충과 접시를 받아 고 약 0.5 x 1 cm2 메스의 조각으로 잘라. 전송 unconcentrated OP50를 포함 하는 직경이 60 mm의 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시에 2 ~ 3 조각.</li>
		<li>(야생-타입 N2 20 ° C에서 경작 한다) 변형에 대 한 적당 한 온도에 번호판을 품 어 계란은 접시에 표시 될 때까지.</li>
		<li>M9 버퍼의 2 mL와 함께 계란과 성인 동물의 대부분 떨어져 세척 하 고 15 mL 튜브에 수집. 2 분 동안 800 x g 에서 정지 원심 한편, 표백 솔루션을 준비 시작 합니다.</li>
		<li>Centrifuged 튜브를 꺼내와 10ml 피펫으로와 M9 버퍼를 제거. 성인 nematodes lysed 때까지 소용돌이에 표백 솔루션 및 믹스의 10 mL를 추가 합니다. 이 일반적으로 약 5-7 분, 하지만 15 분 이상 걸리지 않을 또는 계란 실험에 나중에 완벽 하 게 개발 하지 않습니다.</li>
		<li>800 x g 2 분 세척 표백 솔루션에서 계란을 취소 10 mL M9 버퍼와 3 번에서 정지 원심</li>
		<li>이제 OP50 접시에 달걀 서 스 펜 션의 150 µ L를 추가 합니다. 각 접시에 200-300 계란의 밀도 도달 한다. 선 충에 성숙한 단계를 도달할 때까지 기다립니다. 참고: M9 버퍼 (pH 7.0) 묘사 된 실험에 사용 되는 다음 물질의 구성: 22 mM KH2포4, 42 m m 나2HPO4, 86 mM NaCl. 압력가 마로 소독 혼합물, 1mm MgSO4 추가 합니다. 표백 솔루션 0.5 M NaOH, 2.3 m m NaOCl 증류수에 해결을 포함 합니다.</li>
		<li>준비 살 균 M9 버퍼, 상처로 살 균 피 펫 팁 팁 15 mL 튜브에 그들을 수집 하 고 웜, 씻어.</li>
		<li>접시에 약 1 mL의 M9 버퍼를 적용, 부드럽게 버퍼 nematodes 접시에서 스윙 하 고 부드럽게 피펫으로 여 배포.</li>
		<li>이제, 튜브에서 선 충을 수집 합니다. 잘라 피 펫 팁, (OP50와 시드) 접시에 직접 현 탁 액의 150 µ L을 적용 하 고 현미경으로 선 충의 밀도 평가 (권장: 60 m m 당 50-100 nematodes).</li>
		<li>그들은 너무 조밀한 경우에, M9 버퍼와 현 탁 액을 희석 하 고 원하는 밀도이 때까지 현미경 평가. 수확량은 너무 작은 경우에, 정착 또는 액체를 제거 하려면 800 x g 에서 서 스 펜 션 10 s 원심 벌레를 하자. 참고: 충분 한 밀도의 예 (거시적인) 그림 1A 및 1B (현미경) 20 X 확대에에서 주어진 다. 경험적으로 설명 된 대로 진행 합니다.</li>
		<li>벌레는 신속 하 게 정착 하는 유의 하십시오. 판 사이 동등 하 게 분배 되도록 튜브 번호판 (번호판 4-5)의 모든 스택 후 반전. 참고: 컷 뿐 아니라 부드러운 스윙 팁, 플라스틱 및 전단 응력을 감소, 플레이트의 세척.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 전송의 대용량의 꼬마 선 충
<ol><li>M9 버퍼, 나이 및 플레이트의 건조에 따라의 약 500 µ L와 선 충을 씻어. 동일한 버퍼를 사용 하 여 선 충을 분리 하는 동물의 대부분은에 수집 될 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>천천히 잘라 피 펫 팁 nematodes을 차지 하 고 OP50와 함께 준비 된 접시에 그들을 전송. 접시 건조 하자. 참고: 수 권장된 볼륨 보다는 훨씬 더 적용 하지 않도록 주의 하십시오. 특히 장기 실험 판 그것을 용납 하지 않을 수 있습니다 고 균열에 크롤 링 하는 선 충 수는 agar 끊을 수 있다.</li>
</ol>3. 수확 한 대형의 꼬마 선 충 샘플
<ol><li>선택한 방법에 따라 C. 선 충의 충분 한 양의 실험을 시작 합니다. LC-MS/MS 분석에 대 한 샘플 당 단백질의 적어도 200 µ g의 수익률을 보장 하기 위해 접시 당 약 100 nematodes 그룹 당 20 접시 (60 m m x 15 m m)를 준비 합니다. 참고: 프로토콜의이 부분은 요구 하지 않습니다 작업 무 균 조건 하에서 더 이상, 선 충을 수집 하 고 고정 됩니다.</li>
	<li>샘플 컬렉션의 날, 스냅-동결 수집한 샘플을 액체 질소를 준비 합니다. 선 충 류의 신진 대사를 느리게 얼음에 비 살 균 M9 버퍼를 유지 합니다.</li>
	<li>M9 버퍼의 1 mL를 적용 하 고 부드럽게 판 소용돌이 격판덮개에서 C. 선 충 을 씻어. 이 고 인된 선 충 및 대부분의 계란을 수집 하는 경우 어떤 존재, 그들은 박테리아와 agar에 충실 하기 때문에 피 한다.</li>
	<li>볼륨을 고 15 mL 튜브에 그것을 전송.</li>
	<li>전체 샘플 수집 후 정착 또는 800 x g 에서 짧게 튜브 원심 M9 버퍼의 대부분을 제거 하는 선 충에 대 한 기다립니다. 워시 샘플 3 m 9의 약 10 mL x (샘플 볼륨 x 10) 모든 박테리아를 제거 하. 참고: 모든 고 인된 선 충 제거는 되도록 자당 부양 다른 옵션입니다. 그러나, 이것은 표시 된 실험15적합 이었다. 자당은 포도 당 및과 당을 분해. 묘사 실험에서 포도의 역할 만성 당뇨병에 생 화 확 적인 변화를 촉진에 평가 했다. 따라서, 자당 부양 잠재적으로 결과 혼동 수 있습니다.</li>
	<li>모든 샘플에 대 한 M9 버퍼의 1 mL와 함께 한 1.5 mL 튜브와 하나의 빈 1.5 mL 튜브를 준비 합니다. 15 mL 튜브에서 빈 1.5 mL 튜브 유리 피펫으로와 펠 릿을 전송. 이 단계는 양적 전송을 보장 하기 위해 중요 한. 참고: 달리 이전 단계, 여기는 선 충은 더 집중. 플라스틱 피펫으로 팁을 가능한 준수 때문에 샘플의 큰 부분의 손실 예상 된다. 따라서 유리 펫 대신 사용 합니다.</li>
	<li>송금 후 유리 피 펫을 사용 하 여 두 번째 1.5 mL 튜브에서 M9 버퍼의 1 mL를 피펫으로 벽에서 선 충을 씻어 하 려. 또한, 15 mL 튜브에서 나머지 nematodes을 세척 하 고 샘플 튜브를 그들을 전송.</li>
	<li>1 분 동안 19000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 하 고 가능한 많은 상쾌한 제거.</li>
	<li>튜브 Parafilm으로 밀봉 하 고 즉시 스냅-동결 그것은 액체 질소. Lysate 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 질량 분석에 대 한 절연
참고: 여기에 설명 된 단백질 격리 또한 다른 분석 실험 (예를 들면, 서쪽 오 점)에 대 한 사용할 수 있습니다.
<ol><li>냉동된 샘플에 0.5 m m 지르코늄 구슬과 lysate 버퍼를 포함 하는 성분을 억제 물 칵테일의 볼륨 x 적어도 2의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 참고: 선 충-단백질에 대 한 상관 관계를 묘사 분석 버퍼의 100 µ L를 사용 하 여 수행 했다. LC-MS/MS 샘플 버퍼의 200 µ L로 lysed 했다.</li>
	<li>속도 9에 1 분 동안 균질 화기를 시작 합니다. 샘플은 완전히 lysed 확인 합니다. 완전히 lysed 하지 경우이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>19000 x g에서 4 ° C에서 30 분 동안 샘플 원심 얼음에는 상쾌한 새로운 튜브를 전송 고 추가 측정 이동 하려고 때까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다. 참고: 묘사 실험을 위해 사용 하는 비 변성 시키기 버퍼 다음 물질의 구성: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% 트라이 톤-X와 2 mM EDTA. 참고:이 프로토콜을 제안된 규모를 적용 하는 데의 단계를 따라는 데, 약 1, 000 선 충에서 단백질 펠 릿의 수익률 약 500 µ g 이어야 한다. 더 많은 비교, 그림 2 및 대표 결과참조 하십시오.</li>
</ol>5. 샘플 준비 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 측정
참고: 관심의 매개 변수에 따라 샘플 준비 달라질 것 이다. 이 프로토콜은 methylglyoxal 및 나이 결정에 초점을 맞추고.
<ol><li>
앞에서 설명한9로 1, 2-diaminobenzene (DB)와 derivatization에 의해 세포내 methylglyoxal를 측정 합니다.
	<ol>
<li>얼음 처럼 차가운 20% (wt/vol) trichloroacetic 산 염화 나트륨 0.9% (wt/집)에서 20 µ L와 1.5 mL 튜브에 물 80 µ L 샘플 균질</li>
		<li>내부 표준 5 µ L의 샘플을 스파이크 (13C3MG, 400 nM), vortexing에 의해 그들을 혼합 하 고 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 21000 x g 에서 원심</li>
		<li>HPLC 샘플 유리병 200 µ L 유리 삽입을 포함 하는 상쾌한의 35 µ L를 전송 합니다.</li>
		<li>각 샘플 뒤에 0.5 m m 200 m m HCl 포함 된 0.5 m m diethylenetriaminepentaacetic (DETAPAC) 물에 있는 산에서에서 DB의 10 µ L를 3% 나트륨 아 지 드 (wt/vol)의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>빛 으로부터 보호, 실내 온도에 4 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		<li>앞에서 설명한9LC-MS/MS에 의해 샘플을 분석 합니다. 참고: 나가의 측정을 위해 분리 단백질 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bradford 분석 결과10를 사용 하 여 (해 동된) lysates의 단백질 농도 측정 합니다.
	<ol>
<li>30 µ L의 aliquots 표준 곡선 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 다음과 같은 농도의 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 해결 된 아군에 대 한 준비: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6. 0.8; 그리고 1.0 mg/dL입니다. 참고: 샘플은 제안 된 크기에서 준비 하는 경우 (버퍼의 200 µ L lysate의 준비에 대 한 단계 4.1 참조), 예상된 농도 약 2-7 mg/mL의 범위에 있어야 한다. 이 경우에 샘플 1: 10와 함께 PBS는 측정 전에 희석. 참고:이 메서드를 사용 하 여 첫 번째 실험에 대 한 것이 좋습니다 다른 희석에 샘플을 측정 (1, 1:10, 그리고 1: 100). 선 충의 수의 아무 정확한 결심으로 수익률은 개별 연구자 사이 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>투명 한 96 잘 접시 (폴리스 티 렌)를 사용 하 고 각 표준 농도 우물에 중복에 선택한 희석에 샘플 10 µ L 플라스틱.</li>
		<li>단백질 분석 결과 염료 시 약 집중 1:5 (aq증류수로 희석. dest.) 그리고 접시에 모든 샘플을 희석의 200 µ L를 추가. 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어.</li>
		<li>595에서 30 분 이내 흡 광도 측정 플레이트 리더 nm. 예제 계산 된 표준 곡선에서 보간됩니다 될 수 있습니다. 방법의 자세한 내용은 문학10에 광범위 하 게 설명 했습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
앞에서 설명한11,12세포내 연령대를 측정 합니다.
	<ol>
<li>총 단백질 추출 물 (약 200 µ g)을 씻어 10 kDa 원심 필터 단위에 ultracentrifugation에 의해 물으로 3 배.</li>
		<li>복구 된 단백질 (약 100 µ L) 100 mM HCl의 10 µ L, 10 µ L의 펩 신 (2 mg/mL 20 m m HCl에에서), 그리고 티 (20 m m HCl 2 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>중화 하 고 pH 7.4에 0.5 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)의 12.5 µ L을 추가 하 여 버퍼링 하는 샘플 및 5 µ L 260 m m 코의.</li>
		<li>나 전자 [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 페니실린 스 솔루션의 10 µ L 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어 고.</li>
		<li>Aminopeptidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 10 µ L의 prolidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)에], 및 48 h 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>앞에서 설명한12LC-MS/MS에 의해 결과 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fronius, M., Clauss, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-sensitivity+of+ENaC:+may+the+(shear)+force+be+with+you.">Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sohn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+neurodegeneration+may+precede+microvascular+changes+characteristic+of+diabetic+retinopathy+in+diabetes+mellitus.">Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).</li><li>Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGEs,+rather+than+hyperglycemia,+are+responsible+for+microvascular+complications+in+diabetes:+a+&amp;#34;glycoxidation-centric&amp;#34;+point+of+view.">AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a &amp;#34;glycoxidation-centric&amp;#34; point of view.</a> Nutrition, Metabolism &amp; Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).</li><li> Schlotterer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+as+model+for+the+study+of+high+glucose-+mediated+life+span+reduction.">C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction.</a> Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Leiers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-responsive+glutathione+S-transferase+confers+resistance+to+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).</li><li>Rabbani, N., Thornalley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+methylglyoxal+by+stable+isotopic+dilution+analysis+LC-MS/MS+with+corroborative+prediction+in+physiological+samples.">Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).</li><li>Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+advanced+glycation+endproducts+(AGEs):+surveying+AGEs+by+chromatographic+assay+with+derivatization+by+6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate+and+application+to+Nepsilon-carboxymethyl-lysine-+and+Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified+albumin.">Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin.</a> Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).</li><li>Thornalley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+screening+of+advanced+glycation+endproducts+in+cellular+and+extracellular+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry.</a> Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).</li><li>Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+fructosyllysine+and+advanced+glycation+end+products+in+the+kidney,+retina+and+peripheral+nerve+of+streptozotocin-induced+diabetic+rats.">Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).</li><li>Morcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxalase-1+prevents+mitochondrial+protein+modification+and+enhances+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screenable+In+Vivo+Assay+for+Mitochondrial+Modulators+Using+Transgenic+Bioluminescent+Caenorhabditis+elegans.">A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).</li><li>Takamiya, S., Mita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+purification+of+active+liquid-cultured+Caenorhabditis+elegans+using+a+modified+Baermann+apparatus.">Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus.</a> Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).</li><li>Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+high-throughput+and+high-content+screening+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).</li><li>Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+type+2+diabetes-like+hyperglycemia+in+C.+elegans+on+a+microdevice.">Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice.</a> Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 양적 결과 얻기 위해 C. 선 충 의 대규모 경작에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 문학에서 발견 대표 결과같이 복제 될 수 있습니다. C. 선 충 의 대규모 샘플의 컬렉션에 대 한이 정서의 똑 바른 앞으로 방법 같이 보인다, 비록 특정 함정을 계정에 걸릴 있다. 선 충 인구의 동기화에 대해이 프로토콜 선 충을 파괴 하 고 전적으로 계란을 수확 하는 염소와 수산화 나트륨 인구가 표백 여 접근을 설명 합니다. 그것은 고려이 접근은 모든 실험에 대 한 적합 하지 않을 수도 있다. 표백 솔루션의 볼륨에 인구 크기의 비율에 따라 표백 솔루션의 손상 효과15태아 개발에 영향을. 발달 과정을 공부 하는 경우에 특히 중요 한 단계 수 있습니다. 선 충의 처리에 관한 프로토콜에 걸쳐 가능한 작은 전단 세력으로 적용할 결정적 이다. 신중 하 게 처리 하지, 선 충의 많은 멸망 합니다. 그 문제에 대 한 회전 시간과 속도 초과할 수 없습니다 중요 하다. 선 충을 전송할 때 부상된 선 충의 수를 줄이기 위해 잘라 피 펫 팁을 사용 해야 합니다. 선 충의 전송에 대 한 버퍼의 권장된 볼륨 해야 하지 초과 될,으로 agar 너무 젖은, 선 충에 게 접시에 파고 기회 되 면 균열 수 있습니다. 샘플을 수집 하는 동안 M9 버퍼 유지 되어야 한다 C. 선 충 떨어집니다 대사 산물 또는 기판 작업 하는 경우에 특히 선 충의 신진 대사, 천천히 얼음. 그것은 철저 하 게 사전 먹이에서 어떤 세균 오염을 최소화 하기 위해 샘플을 세척 하는 것이 중요입니다. 펠 릿을 전송할 때 벌레의 많은 플라스틱 피 펫 팁에 충실 수 있습니다 기억 하십시오. 심지어 낮은 바인딩 피 펫 팁 샘플의 큰 금액을 유지 수로 권장된 유리 피 펫을 사용 되어야 한다. 대신, 트리톤 X100 M9 버퍼에 이전 했다 0.01%의 추가 제안16. 고 인된 C. 선 충 또는 박테리아는 결과 좌우할 것 이다 있도록 자당 부양 선 충의 컬렉션 수 후14수행. 이것은 일반적으로 액체 배양 매체를 제거 후 이루어집니다. 이 실험에서 클렌징이 생략 되었다, 자당은 포도 당과 당, 따라서 잠재적으로 우리의 결과 혼동으로 물질 대사로 변화 때문에.
일반적으로, C. 선 충 의 대규모 문화 액체 매체를 사용 하 여 수행 됩니다. 그러나 액체 배양,, 아니다 모든 실험 설정에 대 한 적합 한 선 충의 정확한 숫자를 요구 하는 정보를 사용 하는 경우에 특히. Baerman 장치의 이전 정렬 정화 액체 문화17에서 파생 하는 선 충을 설명 했다. 이 메서드는 크게 세균성 오염 감소 하 고 필터링 하는 여러 구성 요소 필터 시스템을 통해만 성인 선 충. 이 우아한 방법은 실내 온도에, 대사 분석을 혼동 수 있는 긴 필터링 시간 (2-6 h)에 의해 제한 됩니다. 필터링 기술에 관해서는 nematodes 움직이는 그들의 활동에 의해 정렬 됩니다. 선 충 해야 크롤 링 하지 독립적으로 필터의 숨 구멍을 통해 다른 자료에서 충분히 적합. 따라서, 결과 실험적 치료에 의해 약화는 선 충을 제외 하 여 왜곡 될 수 있습니다.
결합 한 실험적인 디자인에 액체 및 접시 문화 나중 분석에서 confounder 또한 될 수 있습니다. C. 선 충 대량, 단백질 콘텐츠, 또는 몸 길이 너비2로 표준화 하는 매개 변수를 비교 하 고 어려운 액체 문화에서 얇고 긴 표현 형을 개발 한다. 또한, 반응 물질의 연구 이후 반응 물질 또는 수정 될 가능성이 선 충을 도달 하기 전에 미디어 구성 요소에 의해 inactivated 액체 문화에서 도전 이다. C. 선 충 의 대규모 샘플이이 프로토콜 얻어질 수 있다, 비록 격판덮개 문화 자체 액체 문화 보다 더 노동 집약 이다. 그러나, 특정 방법 (예를 들어, agar 분배 기계를 사용 하 여) 처리를 촉진 하기 위하여 있다. 효율적으로 대규모 문화를 홍보 하는 또 다른 옵션은 한 천 격판덮개의 생산에 대 한 더 큰 직경을 가진 접시를 사용 하 여. 이 옵션은 성공 분석에 의해 제약 될 수도 있습니다. 미세한 평가 또는 접시 일반적 처리, 시설 접시의 직경 감소.
화학 또는 약물 검사 같은 다른 매개 변수를 평가 대 한 적합 한 여러 높은 처리량 방법 되었습니다 개발 하 고18조사. 미세 소자 타입-2 당뇨병19의 모델에서와 같이 다양 한 매개 변수를 연구 하는 연구자를 수 있습니다. 수명, 지질 대사 및 산화 긴장 응답 수 있습니다 동시에 부과 단일 동물 수준에 높은 콘텐츠 심사, 생화학 정보 phenotypic 통합의 장점을 드러내는. 현재 문학의 재현성 및 신뢰성 평가 이미 개념 증명 연구18넘어 이러한 기술의 훌륭한 교양을 보여주었다. 장치는 종종 비싼 증명할 수 있는 실험 필요에 따라 사용자 정의할 수 있다 특히 더 작은 실험실에 대 한 경제성은 여전히 문제가 남아 있습니다.
C. 선 충 에서 연령대의 정량화는 선 충 류의 불 침투성 표 피에 의해 복잡 합니다. 일반적으로 사용 되는 방법은 immunofluorescent stainings6 통해 연령대의 탐지 이다. 표 피, 때문에 더 큰 샘플 크기는 결과의 높은 분산을 줄일 필요 합니다. 영상은 시간이 걸리는 요인으로 고려 될 수 있다.
전신 lysate 준비 여기 설명에 대 한 프로토콜 C. 선 충 의 다른 구성 요소와 세포내 나 분석에 대 한 접근은. C. 선 충 샘플의 LC-MS/MS 측정14전에 수행 되었습니다. 그러나 적절 한 자란 조건,, 선 충, 충분 한 숫자를 달성 하는 하지 설명 자세히, 아직.
이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 대규모 homogenously C. 선 충, 또는 실험 당 여러 판독의 조합에 대 한 인구 성장 요구 하는 정보에 대 한 유용 합니다. 이 특히 당뇨병과 그 합병증 같은 복잡 한 multifactorial 질병을 공부 하 고 편리 합니다. 미세 시스템을 사용 하 여 높은 처리량과 높은 콘텐츠 심사 등 대체 방법을 더 고급 기술적으로 하 고 큰 크기의 데이터를 제공할 수 있습니다. 그들의 주요 응용 프로그램은 현재 화학 및 의약품 심사 또는 돌연변이 실험 치료에 응답에 대 한 유전자 검사에서 볼 수 있습니다. 이 프로토콜 수 쉽고 저렴 하 게 고급 현재 실험적인 판독의 조정에 대 한 필요 없이 그들의 현재 또는 미래의 프로젝트의 크기를 연구 하 고, 따라서, 시간 손해를 최소화 하기 위해 관련 된의 설립과 새로운 방법입니다.

서쪽 오 점 또는 질량 분석, 단백질 분석, 단백질의 밀리 그램을 해야합니다. 이 항복 C. 선 충, 달성 될 수 있다 액체 문화 또는 고체 미디어 전송 선 충에 세척 하 여는의 수백의 대규모 배양이 필요 합니다. 및 전단 응력 유도 상피 나트륨 채널 (ENaC), 나트륨, 잠재적으로 C. 선 충 의 수명을 변경 하 고 신진 대사 분석1에 영향을 미치는의 증가 된 통풍 관을 통해 삼 투 스트레스 증가 수의 표현 . 따라서, 플레이트-기반 접근 방식에 대 한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 걸릴 계정에 실험적인 가변성에 영향을 미치는 스트레스의 감소. 액체 문화, 다른 한편으로, 선 충의 표현 형에 영향을 하 고 문화 및 nematodes2의 정확한 수의 컬렉션을 복잡 하 게. 또한, 반응 물질 미디어 구성 요소에 의해 변경 될 수 있습니다 그리고 선 충을 도달 하기 전에 하지 균등 하 게 배포할 수 있습니다. 액체 문화의 제한에 대해이 프로토콜 C. 선 충의 대규모 샘플을 경작 하는 양자 택일 접근을 제공 합니다.
C. 선 충 의 3 분 1의 모든 셀3의 만드는 302 신경 세포의 고유한 네트워크 모델 생물 이다. 많은 동종 과학에 그것의 소개부터 orthologous 유전자 기술, 의료 연구를 위한 모형으로 그것의 가치를 증폭 되었습니다. 최근, 당뇨병 성 망막 증, 혈관 손상, 앞에서 신경 장애에 대 한 증거4를발표 되었습니다. C. 선 충 혈관, 부족 하지만 뚜렷한 신경 네트워크 포함 한다 혈관 그들 떨어져 신경 변경 조사를 적합 한 모델을 만드는. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 당뇨병 합병증에 생 화 확 적인 변경 추가 혈당5응답에서 선생님의 형성에 영향을 미치는 나가의 형성을 포함 한다. 연령대와 신경 손상6을 C. 선 충 에서 발견 된다. 만성 질환은 당뇨병 합병증의 평가 함께 여기 exemplified 종종 그들의 근본적인 메커니즘의 평가 대 한 multiparametric 접근을 요구 하는 복잡 한, polygenic 프로세스 발생 합니다. 이 프로토콜 이후에 뿐만 아니라 동시에 여러 개의 매개 변수를 얻기 위해 사용 될 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 증가 comparability 및 multiparametric 접근의 재현성을 얻을 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans N2</td>
			<td>CGC</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans CL2166</td>
			<td>CGC</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 60 x 15 mm</td>
			<td>Greiner One</td>
			<td>628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric pipet, glas, 10 mL</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>E-0413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04693124001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-denaturing lysate buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, pH 8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, transparent bottom</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200, plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30017581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm</td>
			<td>Next advance</td>
			<td>ZROB05-RNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender, homogenizer</td>
			<td>Next advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P43339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolidase from Porcine Kidney</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plate-based large-scale cultivation of caenorhabditis elegans: sample preparation for the study of metabolic alterations in diabetes

한 천 배지에서 대규모 방식으로 꼬마 선 충 (C. 선 충)을 배양 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 있습니다. 이 프로토콜에는 서쪽 오 점, 질량 분석, 또는 추가 proteomics 분석으로 진행 하는 단백질의 격리에 대 한 동물의 많은 수를 간단 하 고 저렴 한 방법을 설명 합니다. 또한, immunostainings에 대 한 선 충 수의 증가 동일한 자란 조건 하에서 여러 분석을 통합 하 여 쉽게 구현할 수 있습니다. 또한, 여러 가지 실험 상황 판 사이의 전송을 촉진 된다. 플레이트 문화에서 일반적인 기술 백 금 철사를 사용 하 여 단일 C. 선 충 의 전송을 포함 하 고 채워진된 agar의 전송 청크 메스를 사용 하 여. 그러나, 선 충 숫자 증가 함께 이러한 기술을 지나치게 많은 시간이 소요 된다. 이 프로토콜의 선 충 C. 수많은 단계를 포함 하 여 벌레의 생리학에 샘플 준비의 영향을 최소화 하기 위해 대규모 문화를 설명 합니다. 및 전단 응력의 수명 및 C. 선 충, 따라서 안정적이 고 재현 가능한 결과 검색 하기 위해 중요 한 단계에 대 한 자세한 설명을 요구에서 대사 과정을 변경할 수 있습니다. C. 선 충 은 모델 유기 체 최대 1/3, 신경 세포의 구성 가능성을 전적으로 신경 변경 혈관 컨트롤의 독립적인 조사를 제공 따라서 혈관 부족. 최근, 당뇨병 성 망막 증의 초기 neurodegeneration 혈관 변경 전에 발견 되었다. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 예를 들어의 증가 형성 고급 glycation 엔드 제품 (세) 그리고 반응성 산소 종 (선생님) 관찰 reproducibly C. 선 충에서 발견 되는. 프로토콜 처리 조사의 폭넓은 스펙트럼에 대 한 적절 한 크기의 샘플을 여기, 당뇨병 유발 생 화 확 적인 변경의 연구에 의해 exemplified 표시 됩니다. 일반적으로,이 프로토콜 유용할 수 있습니다 큰 C. 선 충 을 요구 하는 연구에 대 한 숫자와 어떤 액체 문화는 적합 하지 않습니다.

여기 대규모 C. 선 충 을 만드는 예제 문화 대 당뇨병 연구에 응용 되 게 됩니다. 그것은 관심 총 단백질 농도를 정상화 하기 보다 단일 동물 매개 변수 관련 된 될 수 있습니다. 선 충 수가 적은 요구 분석 결과에이 수행할 수 있습니다 쉽게 선 충을 계산 하 여. 대규모 C. 선 충 에 대 한 문화 관련 된 수백 개의 실험적인 그룹 당 선 충,이 방식은 편리. 그림 2, C. 선 충 의 양과 단백질 콘텐츠 사이 상관 관계가 표시 됩니다. 여기 바와 같이 재현 양적 단백질 격리가이 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
그들 fructosyl lysine adduct 동안 여러 시대 선구자 중 하나는 실험 동물에 있는 당뇨병 모델13. 그림 3 은 12 일 된 선 충 및 3 개의 독립적인 실험에서 치료 컨트롤 일치 하는 나이에 포도 당 처리 후 LC-MS/MS 측정을 표시합니다. 선 충은 lysate 버퍼의 200 µ L의 추가 함께 무 균. Fructosyl-리 신 후 높은 혈당 치료 제시의 증가 형성.
Methylglyoxal 같은 반응성 대사 산물 변동할 고 단백질을 신속 하 게 수정14. 따라서, 질문 그 반응성 대사 산물 실제로 유기 체에 축적 또는 그들의 목표에 도달 하기 전에 수정 여부를 남아 있습니다. 그림 4 는 물질과 치료 후 C. 선 충 에 methylglyoxal의 축적을 확인합니다.
산화 스트레스는 전단 응력 중 뿐만 아니라 혈당6, 동안 증가 된다. 그림 5 전송 프로토콜의 섹션 2에서 포도 당 처리 그룹, 그리고 비 전송 그룹 산화 긴장의 형성에 차이 확인 합니다. 두 포도 당 처리 그룹 치료 제어 그룹의 비교 포도 당에 의해 유도 된 산화 스트레스에 상당한 증가 보여 줍니다. 반면, 두 개의 포도 당 처리 그룹 간에 상당한 차이가 관찰 되었다. 이러한 결과이 프로토콜을 사용 하 여 선 충 처리 크게 노화 또는 물질 대사의 수사에 있는 confounder로 될 수 있는 산화 긴장의 형성 유도 하지 않습니다 설명 합니다. 또한, 현재 문학에서 발견이이 프로토콜을 사용 하 여 재현 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58117/58117fig1.jpg"> 그림 1: 접시에 추가로 배포에 대 한 선 충의 적절 한 밀도. (A)이이 패널은 거시적인 보기를 보여 줍니다. (B)이이 패널 20 X 확대에 미세한 보기를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58117/58117fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58117/58117fig2.jpg"> 그림 2: 단백질 콘텐츠 야생-타입의 선 충 C. N2. 5에서 12 일 된 nematodes 프로토콜 섹션에 설명 된 대로이 준비 패널, lysate의 단백질 수익률에 선 충 수의 상관 관계를 보여 줍니다(n = 500 nematodes;의 lysate 3 n = 3의 1000 nematodes; lysate 그리고 n = 1 1500 선 충의 lysate). 회귀선은 빨간색으로 표시 된 (r2 = 0.976, y = 0.64). 총 단백질 농도 브래드포드 메서드를 사용 하 여 측정 했다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58117/58117fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58117/58117fig3.jpg"> 그림 3: 선 충 C. n 2의 포도 당 처리 후 fructosyl-신의 형성 증가. 12 일 된 선 충 및 치료 컨트롤에 포도 함께 치료 후 fructosyl-리 신의 농도 LC-MS/MS에 의해 결정 되었고 브래드포드 메서드에 의해 결정 단백질 농도를 정상화. 데이터 평균 ± sd.로 표현 됩니다. P-값은 학생의 t에 의해 결정 되었다-테스트, * *p < 0.01. 결과 3 개의 독립적인 실험에서. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58117/58117fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58117/58117fig4.jpg"> 그림 4: 세포내 methylglyoxal 농도 C. 선 충 N2의 methylglyoxal 처리 후. Methylglyoxal 농도 methylglyoxal로 치료 하는 12 일 된 선 충에 LC-MS/MS에 의해 측정 되었다. 샘플 마지막 치료 후 2 시간 미만 수집 했다. 데이터는 선 충의 수를 정규화 하는 평균 ± SD로 표현 됩니다. P-값은 학생의 t에 의해 결정 되었다-테스트, * *p < 0.01. 결과 3 개의 독립적인 실험에서. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58117/58117fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58117/58117fig5.jpg"> 그림 5: 산화 스트레스 측정 C. 선 충 CL2166 혈당 치료 후. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 티-S-전이 효소 4 promotor 구동 GFP 기자를 포함 하는 2 d 포도 당을 포함 하는 400 µ M FUdR 접시에 경작 했다. 한 그룹이이 프로토콜의 섹션 2에에서 설명 된 대로 1 일 신선한 포도 당 격판덮개로 이송 했다. 산화 스트레스는 플레이트 리더 형광 [상대 빛 단위 (RLU)]에 증가 측정 했다. 데이터 평균 ± sd.로 표현 됩니다. P-값 ANOVA에 의해 결정 되었다 *p < 0.05. 결과 3 개의 독립적인 실험에서. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58117/58117fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.

꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

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Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

연구

생화학

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

케노하브디티스 예쁜꼬마선충에서 2-아라키도노일글리세롤의 정량화를 위한 신분화 표준의 합성

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ratios (m/z), which are useful to deduce molecular weights and structures. While it is essentially a destructive analytical method, recent advancements in the ambient ionization technique have enabled us to acquire data while leaving tissue in a relatively intact state in terms of integrity. Probe electrospray ionization (PESI) is a so-called direct method because it does not require complex and time-consuming pretreatment of samples. A fine needle serves as a sample picker, as well as an ionization emitter. Based on the very sharp and fine property of the probe tip, destruction of the samples is minimal, allowing us to acquire the real-time molecular information from living things in situ. Herein, we introduce three applications of PESI-MS technique that will be useful for biomedical research and development. One involves the application to solid tissue, which is the basic application of this technique for the medical diagnosis. As this technique requires only 10 mg of the sample, it may be very useful in the routine clinical settings. The second application is for in vitro medical diagnostics where human blood serum is measured. The ability to measure fluid samples is also valuable in various biological experiments where a sufficient volume of sample for conventional analytical techniques cannot be provided. The third application leans toward the direct application of probe needles in living animals, where we can obtain real-time dynamics of metabolites or drugs in specific organs. In each application, we can infer the molecules that have been detected by MS or use artificial intelligence to obtain a medical diagnosis.

This article introduces sample preparation methods for a unique real-time analytical method based on the ambient mass spectrometry. This method lets us perform real-time analysis of the biological molecules in vivo without any special pretreatments.

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As oxygen is ubiquitous in air, retaining O2-free conditions during all steps of cultivation is challenging but a prerequisite for anaerobic culturing. The protocol presented here demonstrates the successful cultivation of an anaerobic mixed culture derived from a biogas plant using a simple and inexpensive method. A precise description of the entire anoxic culturing process is given including media preparation, filling of cultivation flasks, supplementation with redox indicator and reducing agents to provide low redox potentials as well as exchanging the headspace to keep media free from oxygen. Furthermore, a detailed overview of aseptically inoculating gas tight serum flasks (by using sterile syringes and needles) and suitable incubation conditions is provided. The present protocol further deals with gas and liquid sampling for subsequent analyses regarding gas composition and volatile fatty acid concentrations using gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC), respectively, and the calculation of biogas and methane yield considering the ideal gas law.

As obligate anaerobic organisms are unable to grow upon oxygen exposure, the use of anaerobic culturing techniques is indispensable. Here, we demonstrate a simple and effective method to cultivate a mixed culture derived from a biogas plant from media preparation to gas and volatile fatty acid quantification.

엄격하게 혐기성 /안산 조건하에서 미생물의 재배를위한 중간 준비

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality have been seen for microcrystals with the development of beamline optics, beam stability and variable beam size focusing from submicron to microns, such as at the VMXm beamline at Diamond Light Source1. Further improvements in data quality will be gained through improvements in sample environment and sample preparation. Microcrystals inherently generate weaker diffraction, therefore improving the signal-to-noise is key to collecting quality X-ray diffraction data and will predominantly come from reductions in background noise. Major sources of X-ray background noise in a diffraction experiment are from their interaction with the air path before and after the sample, excess crystallization solution surrounding the sample, the presence of crystalline ice and scatter from any other beamline instrumentation or X-ray windows. The VMXm beamline comprises instrumentation and a sample preparation protocol to reduce all these sources of noise.
Firstly, an in-vacuum sample environment at VMXm removes the air path between X-ray source and sample. Next, sample preparation protocols for macromolecular crystallography at VMXm utilize a number of processes and tools adapted from cryoTEM. These include copper grids with holey carbon support films, automated blotting and plunge cooling robotics making use of liquid ethane. These tools enable the preparation of hundreds of microcrystals on a single cryoTEM grid with minimal surrounding liquid on a low-noise support. They also minimize the formation of crystalline ice from any remaining liquid surrounding the crystals. 
We present the process for preparing and assessing the quality of soluble protein microcrystals using visible light and scanning electron microscopy before mounting the samples on the VMXm beamline for X-ray diffraction experiments. We will also provide examples of good quality samples as well as those which require further optimization and strategies to do so.

The signal-to-noise ratio of data is one of the most important considerations in performing X-ray diffraction measurements from microcrystals. The VMXm beamline provides a low-noise environment and microbeam for such experiments. Here, we describe sample preparation methods for mounting and cooling microcrystals for VMXm and other microfocus macromolecular crystallography beamlines.

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect and quantify hundreds of thousands of metabolite features. However, the application of these techniques to a large number of samples is subject to more complex interactions, particularly for genome-wide association studies (GWAS). This protocol describes an optimized metabolic workflow, which combines an efficient and fast sample preparation with the analysis of a large number of samples for legume crop species. This slightly modified extraction method was initially developed for the analysis of plant and animal tissues and is based on extraction in methyl tert-butyl ether: methanol solvent to allow the capture of polar and lipid metabolites. In addition, we provide a step-by-step guide for reducing analytical variations, which are essential for the high-throughput evaluation of metabolic variance in GWAS.

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

In this protocol, we present an optimized workflow, which combines an efficient and fast sample preparation of many samples. In addition, we provide a step-by-step guide to reduce analytical variations for high-throughput evaluation of metabolic GWAS studies.

대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...