이 원고에 설명 된이 작업에 의해 제공 된에 대 한 자금:는 학장 및 대학원 의학 및 건강 과학 센터에 대 한 계산 혁신 (HSCCI);를 통해 치과 학장의 사무실의 로체스터의 대학 사무실 에이징 화목 (AG-NS-0681-10) 엘리슨 의료 재단 새로운 학자 funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

두 전통 및 복제 설정된 방법 날짜순 세 동물의 동기화가 필요합니다. 우리는 수정 된 달걀만 벗 성인 치료를 생존 벗 성인, 차 아 염소 산 치료를 사용 하는 동물을 동기화 하는 메서드를 포함 합니다. 이러한 배아 액체에 해치 고 발달 첫번째 애벌레 단계 (L1)에서 체포. L1 동물 식품 (예: 대장균 표현 dsRNA의 유전자)에 시드, 후 동물 개발을 다시 시작 합니다. L1 동물 벗 성인의 차 아 염소 산 처리에 의해 동기화 장점이 남은 unseeded L1 동물 동결 되 고 무한정 액체 질소 또는-80 ° C 냉장고에서 저장 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 미래 연구를 위한 귀중 한 자원 만들기 및 재현성을 향상 실험 설치의 시간에 각 스트레인의 샘플 보존 됩니다. 그러나, 차 아 염소 산 벗 성인 동물의 치료는 노화 연구22에 대 한 동기화 된 동물을 얻을 수 있는 일반적인 방법을, L1 체포 기아 응답 이다. 따라서, 어떤 실험실 접시에 발생 전부 차 아 염소 산 치료를 지 내 다 고 (즉, 그는 누워) 몇 시간 동안 알을 낳 기를 잠시 벗 성인을 화 수를 선호 합니다. 후자의 경우에, 부모는 제거 하 고 자손 수명 뒤에. 우리의 지식 최선을 수명에 분명 한 차이가 M9, 접시, 또는 달걀 누워에서 자손에 부 화에 동기화 된 동물 사이 보고 되었습니다. 그러나, 그 양분 가용성에서 변화는 수명에 변화에 밀접 한, 우선 특정 유전 배경 동기화 방법 사이 다른 결과 생성할 수 있다. 좀 더 조심 분석이 이론적인 문제를 해결 하기 위해 필요 합니다.
시작 인구를 동기화 하는 데 사용 하는 방법에도 자손 생산을 방지 하거나 미래의 자손에서 동기화 시작 인구를 분리 단계를가지고 한다. 우리의 프로토콜에서 우리는 FUdR 자손 생산을 방지 하기 위해 사용 하는 방법을 개요 동물 구분으로 실행 가능한 옵션이 아니다 복제 설정 방법에 대 한. 그것은 또한 유전자 feminized 유전 배경 (예: fer-15(b26);fem-1(hc17), 온도 따른 불 임 스트레인23입니다)를 사용 하 여 자손 생산을 방지 하기 위해 가능한. 그러나도 결점 없이 이다: 유전 배경의 사용 수 후속 분석을 복잡 하 게 하 고 일부 유전 배경 FUdR 장 수24,,2526을 변경할 수 있습니다.
자손을 방지 하는 대신 화학 또는 유전을 통해 생산, 성인 동물 이동 될 수 있다 주기적으로 신선한 RNAi 번호판에서 그들의 자손 들을 의미 합니다. 이 처리량 비용 고려 사항을 배경 단순화합니다. 정기적으로 신선한 음식에 동물을 이동 가능한 기아를 방지 하 고 갱신 dsRNA에 노출의 추가 이점이 있다. 그러나, 수명에 영향을 주는 몇 가지 유전 상호 작용만 발견 했다 자손 생산을 저해 하는 때: 수명 표현 형에 대 한 TGFβ 통로의 초기 분석 잘못 감소 TGFβ 신호 영향 C. 선 충을 결론 dauer 형성 하지27,28노화 하지만. 그러나, FUdR을 사용 하는 연구를 수행 하는 TGFβ 신호 인슐린 신호29통해 증가 장 수 감소 밝혔다. 이전 연구는 왜 증가 수명 TGFβ 돌연변이 동물에서 볼 수 실패 했 어? TGFβ 통로 돌연변이 결함 (egl) 누워 약간의 달걀을 생산 하 고 나중에 부모를 죽이 자손의 내부 화를 일으키는 원인이 되는 생식 장 수 확장. 그것은 수명이 긴 TGFβ 돌연변이 동물 야생-타입 동물 일반적으로 죽을 때 무렵 동물 살해 egl 형 때문에 정상적인 수명을가지고 등장. 굶주린된 야생-타입 동물 또한 매니페스트 egl 형 아마도 낮은 식품의 조건에서 자손을 적응 생존 장점으로 서 박사에 연결 된 다른 유전자 경로에 관련 된 수 있습니다. 이 설계 수명 실험 동물 스트레스 조건과 주의 분석 및 고려 사항에 대 한 필요성에서 받아야 하는 적응형 응답에 기본 복잡성을 강조 표시 합니다.
설계 수명 실험 방법 중 하나에 의해 실시에 편견을 피하기 위해 긴요 하다. 더블 블라인드 방식으로 실험을 실시 해야 합니다: 어떻게 샘플 이전 이전 시간 지점에서 득점 했다 고 테스트 조건의 id는 실험 알 수 있어야 합니다. 또한, 그것은 항상 긍정적이 고 부정적인 컨트롤;를 포함 하는 데 필요한 복제 설정된 방법의 경우이 24-잘 접시에 무작위로 삽입 됩니다. 대장균 플라스 미드 삽입 시퀀스를 포함 하지 않는 표현 해당 선 충 C. 하 게놈은 빈 벡터 부정적인 컨트롤 (즉, "L4440"-참고 자료). 긍정적인 통제 실험의 특정 특성에 따라 달라 집니다. 예를 들어, daf-2 선 충 C. 인슐린/IGF-1 수용 체, 인코딩하고 먹이 기반 RNAi 통해 daf-2 비활성화 튼튼하게 수명 야생-타입 동물27에 적어도 2 배 증가 합니다. 따라서 수명 증가 유전자 inactivations를 찾을 때 daf-2(RNAi) 긍정적인 통제 역할 수 있습니다. 반대로, daf 16 FOXO 녹음 방송 요인 orthologue30인코딩합니다. DAF-16 많은 장 수 패러다임의 필수적인 구성 요소 이며, 야생-타입 동물 (N2) daf-16(RNAi) 로 치료는 짧은 살면서 progeria31의 흔적을 보여줍니다.
전통적인 경도 수명 접근의 기본 장점은 그것을 아주 잘 설립, 실험은 쉽게 설정입니다. 상대적으로 적은 동물 각 테스트 조건에 대 한 몇 접시에 필요 합니다. 따라서, 가난 하 게 성장 하거나 전파를 분산을 요구 하는 종자는 쉽게 테스트할 수 있습니다. 전통적인 접근은 높은 적응력 및 자손 생산 처리, FUdR로 치료를 포함 하 여, feminized 유전 배경으로 건너 또는 주기적으로 새로운 번호판 성인 동물을 이동 가능한 방법 중 하나를 함께 사용할 수 있습니다. 동안 낳는 기간. 크게 동물 이동 처리량 감소, 돌연변이 배경 작업은 결코 이상적인, 그리고 FUdR 팬 들은 야생-타입 수명32,,3334의 정보를 변경 하지 않습니다, 비록 그것은 수명에 영향을 미칠 수 있으며 관련된 고기 나이 일부 유전 배경35,,2526에. Note FUdR의 사용으로도 남성의 존재 것입니다 상당히 자웅 동체 수명13단축, 따라서 광고에 나온는 것 도달 L4 후 남성을 포함 하는 접시는 사용할 수 없습니다. 마찬가지로, 카 플 란 Meier 견적 및 관련된 커브와 로그-순위 테스트를 통해 분석 사망률 데이터에 대 한 잘 설립 이다. 그러나, 전통적인 수명 분석을 몇 가지 단점이 있다. 접시의 처리를 반복 (즉, 공기 판 노출) 공 수 곰 팡이 오염의 도입을 용이 하 게. 또한, 반복 손상 또는 동물, 특히 죽 일 수 있는 파고 인구 나이에서 발전 하 고 깨지기 쉬운 되. 오래 된 동물 대장균 된다 기회 주의 병원 체 (루멘을 식민지 화 하 고 인 두 포장)36동안 크게 마비 하 고 대장균 에 mired 되었다. 아주 오래 된 살아있는 동물만 미묘한 머리 움직임에 의해 식별할 수 있습니다. 따라서, 죽은 늙은 라이브 동물을 분류 하는 것이 쉽습니다. 마지막으로, 전통적인 접근은 처리량에 의해 제한 됩니다.
복제 설정 방법은 높은 처리량 및 양적. 그러나,이 방법의 단점은 시간과 리소스를 설정 하는 초기에 더 큰 투자입니다. 20 시간 포인트 30000 L1 동물 (약 15 동물 RNAi 복제 시간 포인트 당 당 시험 했다)는 대부분 긴장, 쉽게 하는 동안 문제가 될 수 있습니다 어떤 경우에 필요 합니다 100 RNAi 클론을 검사 하는 적당히 큰 실험. 예를 들어, 분산 또는 운반 하는 유전자 변형 라인 유지 되어야 하는 큰 입자 분류 ("벌레 정렬") 긴장 없이 제대로 전송 된 여분 염색체 배열 수 없습니다 쉽게 검사이 방법으로. 두 번째 단점은 그 자손 생산 해야 합니다 수 저해, FUdR 또는 feminized 유전 배경의 사용을 요구 하입니다. 마지막으로, 하나 하나 복제 실험의 시작 부분에 각 시간 점의 세트를 준비 해야 합니다 분석 결과 실행 됩니다 시간의 길이 알고 있어야 합니다. 그러나,이 방법의 이점은 수 많다. 무엇 보다도, 생존을 득점 하는 것은 훨씬 더 빨리 그리고 하나 쉽게 따를 수 동물 100 테스트 조건에 동시에 (즉, RNAi 클론). 복제 데이터베이스 집합 이므로 한 번 득점 다음 격판덮개의 아무 반복된 처리 하는, 또는 동물, 곰 팡이 오염의 가능성을 최소화 하 고 가끔 거친 괴롭히는 웜에 의해 발생 하는 사망률을 제거의 파고를 선택 합니다. 또한, 잘 하는 액체의 추가 크게 점수 용이. 접시에서 오래 된 동물을 해방 하 고 박테리아를 둘러싼 미묘한 머리 움직임에서 더 쉽게 득점을 지원 합니다. 액체의 추가 또한 피트 니스 (예: healthspan8,37)의 때리는 속도 측정을 기회를 제공 한다.
노후화는 여러 인과 메커니즘 해명에 시스템 생물학 접근의 사용을 요구 하는 관련 된 복잡 한 현상 이다. 이러한 방식을 자주 게놈/transcriptomic 데이터의 큰 볼륨을 사용 하 여 데이터 기반 모델링을 통합 하 고 수명 및 healthspan 측정을 보완 강력 하 고 높은 처리량 방법 필요. 높은 처리량 복제 설정 방법은 수 많은 RNAi 클론의 비교 경도, 일괄 처리 효과 인과 경로 간의 상호 작용을 유추할 수 있는 동적 모델의 개발을 촉진 하는 기술적인 오류를 최소화 하면서 양적 방식입니다. 또한, 복제 설정 방법 여러 가지 게놈 넓은 유전체학 접근의 통합은 나이 동기화 동물의 큰 인구 작은 인구 수로 나누어져 있기 때문에 가능 합니다.
다른 방법은 이전 C. 선 충 수명 실험, 종종 전통적인 경도 접근을 적응에 초점을 맞추고의 처리량을 개선 하기 위해 개발 되었습니다 (즉, 시간이 지남에 동물의 동일한 집합을 다음)에 자동 관찰 그리고 일반적인 평판 스캐너38,의39또는 미세 판40등 보다 전문적인된 장비를 사용 하 여 녹음. 스캐너-기반 접근 자극으로 빛을 사용 하 고 살아/죽은 상태를 한 번에; 여러 접시에 대 한 움직임에 따라 결정을 순차적으로 캡처된 이미지를 비교 이러한 접근 독자적인 과학적 하드웨어를 필요로 하지 않는, 시간 워크플로 설정에 관련 된 원하는 규모에 따라 상당한 수 있습니다. 또는, 사용자 지정 미세 장치에서 수명 실험 깊이 phenotypic 특성 분석을 위한 단일 동물의 시간, 그리고 치료 자손, 하지만 미세 접시와 수집의 제조를 할 거 없이 허용 관련 된 미세 펌프 및 영상 장비. 반면, 복제 설정 방법, 상세한 소프트웨어와 함께에서 수 있습니다 이미 있는 일반적인 실험실 C. 선 충작업 도구를 사용 하 여 크게 향상 된 처리량을.
WormLife 소프트웨어 통계 비교 및 추가 플랫폼 호환성에 쉽게 액세스를 제공 하는 미래에 개선 될 것입니다. 소프트웨어에 대 한 최신 설명서는 소프트웨어 테스트 되었습니다 플랫폼에 대 한 설치 지침을 포함 하 여 GitHub 페이지에서 찾을 수 있습니다. 웹 기반 버전 또한 어떤 소프트웨어를 설치할 필요 없이 편리 하 게 액세스할 수 있도록 개발 될 것 이다.
요약, 복제 설정 방법 및 상세한 여기 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어의 조합을 처리량 및 수명 실험의 견고성과 광범위 한 생존 기반 분석 (예: 향상을 위한 강력한 플랫폼을 제공 스트레스 내성, 독성 연구, healthspan, 등). 기능 유전체학과 결합 하는 때에 특히이 이렇게 활용 metazoan 모델 시스템 C. 선 충 의 많은 혜택. 노화의 진행에 기여 하는 유전 상호 작용의 무수 한 해독

노화의 유전 기초 이해를 향한 가장 transformative 기술 발전의 한 개 이었다 C. 선 충1; 먹이 기반 RNAi의 개발 RNAi의 실험적인 사용 전에 노화의 많은 고기 유전자 세공 되지 않았습니다. 먹이-기반 RNAi dsRNA 일치 하는 대장균 내에서 생산을 통해 이루어집니다는 생 선 충 C. mRNA: IPTG 중 선 충 C. cDNA의 삽입 또는의 부분에서 양방향 전사를 유도 한 플라스 미드2내의 열려있는 독서 프레임. C. 선 충 에 그대로 피드 박테리아에 의해 생산 하는 대장균, dsRNA 루멘에서 SID-2 막 횡단 단백질3을 통해 장 세포로 수송 이며 다음 SID-14를 통해 동물의 나머지 부분을 통해 배포. 각 셀 내에서 외 인 dsRNA에 의해 처리 됩니다 Dicer 복잡 한 siRNA에 새로운 만들려고 보완 기본 페어링 통해 성숙한 mRNA와 상호 작용 하는 siRNA mRNA 이중. 이 이중 RISC 복합물에 의해 인식 하 고, 그로 인하여 죽 습 생 mRNA5저하. 따라서, 단지 플라스 미드 삽입 변경, 하나 C. 선 충 게놈 내에서 거의 모든 유전자의 기능을 비활성화 수 있습니다. 이 발견의 라이브러리 컬렉션 변형 대장균 주식의 약 86%의 범위를 달성 하기 위해 결합 될 수 있는 몇 가지 큰 먹이 기반 RNAi의 창조에 주도 알려진 C. 선 충 유전자6, 7.
먹이-기반 RNAi의 발전 이후 종합 화면 C. 선 충 에 수명 비활성화 (로 WormBase에 큐레이터 RNAi 형 협회 입증) 때 우리가 참조를 변경 하는 900 개 이상의 유전자의 발견에 지도 gerogenes로. 대부분 장 수 제어에 gerogenes의 역할 몇 정액 보고서에 RNAi 먹이-기반을 통해 발견 되었다 (자세한 내용은 그림 1A 및 추가 파일 1 참조). 경우에 따라 이러한 gerogenes는 RNAi 치료와 수명에 정량 측정을 제공할 수 있는 단일 또는 몇 시간 지점에서 생존 능력 측정에 따라 확인 되었습니다. 다른 경우에,이 유전자가 수명, 추가 나이 관련 된 고기에 있는 변화에 대 한 양적 평가 되었습니다. 예를 들어, 우리는 이전 159 유전자를 정상적이 고 증가 수명 감소 인슐린/IGF-1 신호, 동물의 필요 그리고 healthspan에서 변화를 정량 확인. 이들의 103 유전자 inactivations 귀 착될 progeric 표현 형으로 손실 귀착되 었 다 조기 노화8의 하나 이상의 표시.
일부 gerogenes 100 이상의 연구 (예: daf-16, daf-2, 선생님-2.1)와 연결 된, 400 gerogenes 10 이하의 인용 (그림 1B및 보조 파일 2) 있다. 따라서, 동안 포괄적인 먹이 기반 RNAi 스크린 발견 하 고 엉 특징 상 상속 gerogenes의 수백, 장 수 제어에서 이러한 유전자 기능 및 이러한 유전자 제품 사이 유전 상호 관계 유지 하는 방법을 제대로 공부. 나이 관련 된 고기에 대 한 전체 경도 분석 gerogenes (예: epistatic 상호 작용, asynthetic 상호 작용, 등등) 사이 유전 상호 작용을 식별 하는 데 필수입니다. Gerogenes 사이 유전 상호 관계에 대 한 깊은 통찰력을 얻고 또한 먹이 기반 RNAi의 장점을 활용 하 여 높은 처리량 양적 방법을 필요 합니다.
노화의 가장 일반적인 대리 측정은 수명. C. 선 충 사망률을 측정 하기 위한 전통적인 방법은 작은 인구 샘플 내에서 시간이 지남에 개별 동물의 죽음을 추적 합니다. 동물의 비교적 적은 수 시간이 지남에 따라 하 고 정기적으로 부드럽게 백 금 철사 또는 속눈썹, 생존 (그림 2A)의 지표로 서 운동으로 prodded. 이 방법은 널리 사용 되었습니다, 평균 및 최대 수명, 직접 측정을 제공 합니다. 그러나,이 전통적인 방법은 이다 시간과 상대적으로 낮은 처리량을 동시에 제어 방식으로 측정할 수 있는 조건과 동물의 수를 제한. 시뮬레이션 연구는 최근 많은 C. 선 충 수명 연구 조건9사이의 작은 변화를 안정적으로 감지 수 동물의 충분히 큰 수를 시험 하지 않습니다 발견. 또한,이 전통적인 방법은 차례로 수 소개, 오염 및 손상 하거나 점점, 세 동물을 죽 일 시간 동안 동물의 동일한 코 호트를 반복적으로 처리를 포함 한다.
C. 선 충 수명 측정에 대 한 대체 "복제 세트" 방법론을 개발 했습니다. 이 위해, 나이 동기화, isogenic 동물의 큰 인구 수 작은 인구 (또는 복제)으로 나누어집니다. 충분 한 복제 샘플 계획 된 실험에서 각 시간 포인트를 충당 하기 위해 생성 됩니다. 각 관찰 시간이 시점에서 복제본 중 하나가 죽은 생활의 수를 위해 득점 하 고 검열된 동물, 다음 그 복제 동물 삭제 됩니다. 따라서, 이상의 독립 모집단의 시리즈 전체 인구의 예상된 수명은 주기적으로 샘플링 (그림 2B). 복제 세트를 사용 하 여 잠재적인 환경 오염 없이 반복된 노출의 아무 반복 괴롭히는 있다. 1 회 시점에서 관찰 생존 모든 다른 관측, 처리를 최소화 하 고 적어도 크기 순서에 의해 처리량 증가의 완전히 독립적입니다. 이 RNAi의 수백 클론8,10동시에 대 한 수명에 변화를 quantitate 하을 수 있다.
여기 C. 선 충 수명 복제 세트와 C. 선 충 장 수 득점을 위한 전통적인 방법을 통해 수행을 위한 상세한 프로토콜 선물이. 우리는 방법 사이 비슷한 결과 얻은 것을 보여 줍니다. 우리는 우리가 자유롭게 GPL V3 라이센스 (참조 자료의 테이블)에서 제공 하는 어느 접근 방식을 통해 생성 된 수명 데이터의 그래픽 분석을 지원 하기 위해 개발 된 소프트웨어를 있다. "WormLife" R11, 작성 하 고 Mac OS와 리눅스에서 테스트 되었습니다 데이터를 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함 한다. 마지막으로, 우리가 비교 하 고 각 방법의 한계를 대조 C. 선 충 수명에 양적 변화를 측정 하는 방법을 선택할 때 다른 고려를 강조.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td style="width:108px;">Gold Bio</td>
			<td style="width:119px;">12481C100</td>
			<td style="width:527px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td style="width:108px;">Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:367px;">24 Well Culture Plates</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td style="width:108px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">2mL 96-well plates</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Air-permeable plate seal</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">96-pin plate replicator</td>
			<td style="width:108px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">bacto-peptone</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">bacteriological agar</td>
			<td style="width:108px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:119px;">10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:367px;">C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td style="width:108px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:367px;">C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td style="width:108px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis</td>
			<td style="width:108px;">Samuelson Lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L4440 Empty Vector Plasmid</td>
			<td style="width:108px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">1654</td>
			<td>https://www.addgene.org/1654/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Wormbase</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.wormbase.org/&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">OASIS</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the replica set method: a high-throughput approach to quantitatively measure caenorhabditis elegans lifespan

복제 설정 방법은 양적 측정 수명 또는 꼬마 선 충 선 충의 생존의 동일한 금액에 더 많은 치료 또는 조건 화면을 단일 조사 되므로 높은 처리 방식에 대 한 접근 데이터 품질의 손실 없이 시간. 방법 C. 선 충 작업 대부분 실험실에서 발견 하는 일반적인 장비를 요구 한다 고 따라서 채택 간단 합니다. 접근 각 관측 지점에서 모집단의 독립 샘플 보다 시간이 지남에 단일 샘플 전통적인 경도 방법 시 금에 센터. 점수 다 잘 접시의 우물에 액체를 추가 하는 수반는 자극 하는 선 충 C. 이동 하 고 healthspan에서 측정 변화를 용이 하 게. 복제 설정 방법의 다른 주요 장점으로는 agar 표면 (예: 형 또는 곰 팡이), 공 수 오염 물질의 감소 된 노출 최소한의 동물, 및 견고성 산발적 잘못 채 점 (예: 때 그것은 여전히 죽은 동물을 호출을 처리 살아 있는). 적절 하 게 분석 하 고 복제 세트 스타일 실험에서 데이터 시각화, 사용자 정의 소프트웨어 도구는 또한 개발 되었다. 소프트웨어의 현재 기능 모두 복제 설정 및 전통적인 (카 플 란-마이어) 실험으로 통계 분석 생존 곡선의 복제 세트에 대 한 표시 포함 됩니다. 여기에 제공 된 프로토콜 전통적인 실험적인 접근 복제 설정 방법 뿐만 아니라 해당 데이터 분석에 대 한 개요를 설명 합니다.

어떤 새로운 방법론의 개발, 새로운 방법 이전 접근 허용된 결과 고 필드 내에서 표준 충족 필수적입니다. 우리는 이전 표시 경험적으로 복제 설정 및 C. 선 충 수명 시 금를 위한 전통적인 방법 유사한 결과20생산. 야생-타입 C. 선 충 (N2) 일반적으로 20 ° C에서 유지 우리 전통 (그림 4A, 검은 선)과 복제 세트 접근 (그림 4B, 블랙) 관찰 20 ~ 25 일 살고 있다. 따라서, 두 방법 모두 합리적으로 야생-타입 수명 근사치. 또한 새로운 방법을 테스트 조건 및 상당한 변화를 감지 하는 통계적 인 힘 사이 변화를 정확 하 게 계량을 해상도 필수적 이다. 우리의 이전 연구에서 우리가 발견 Myc 가족 녹음 방송 요인의 C. 선 충 장 수의 결정 요인. mml-1 과 mxl-2 인코딩 포유류 몬도의 C. 선 충 homologs / 탄수화물 응답 요소 바인딩 단백질 (ChREBP) 및 Mlx, 각각. C. 선 충 과 포유류, 전사 조절 하이 Myc 가족 구성원 heterodimerize. 우리는 mml 1 또는 mxl-2 의 손실을 크게는 전통적인 수명 분석 결과 또는 복제 세트 (그림 4A-B, 황색, 적갈색) 측정으로 정상적인 수명 감소를 발견. MML-1::MXL-2 복잡 한 반면 우리 mdl-1 (포유류 매드 동종) 또는 mxl-1 (최대)의 손실을 크게 C. 선 충 수명 중 방법론 (그림 4 에 의해 측정 된 증가 발견 보라색과 파란색, 두 패널에 각각,).
장 수를 측정 하기 위한 전통적인 접근에 심각한 제한이 처리량입니다. 두 방법 모두 살아 동물 인지 전화 운동 또는 평가 하기 위해 점점 더 어려워진 죽은에 의존 합니다. 젊은 동물 자극의 부재에서 접시에 걸쳐 이동 하 고 따라서 점수 쉽다. C. 선 충 되 고 점점 노화 앉아있는 하지만 접시에 반전 운동에 의해 머리에 가벼운 터치에 반응할 것 이다. 그러나, 동물 이전으로 뒤로 이동 하는 능력 감소 그리고 점점 uncoordinated 된다. 궁극적으로 동물, sarcopenia, 강력 하 게 닮은 형 마비 되 고 전통적인 방법 생존을 통해 득점 때만 동물의 극단적인 앞쪽 끝에 미묘한 트 위치를 관찰 하 여 결정 될 수 있다. 반면, 복제 설정 방법을 통해 생존 점수, 액체 healthspan8의 판독으로 측정할 수 수 탈 곡 응답을 생성 하는 자극 역할 우물에 추가 됩니다. 액체에 운동 조차 더 오래 된 동물에 대 한 관찰 하기 쉽습니다: 날짜순 나이 일치 하는 늙은 동물 생산 건조 접시 더 발음에 미묘한 머리 움직임 (이기는 하지만 느린) 액체에 바디 벤드. 마지막으로 때 복제 세트 점수, 전체 잘 시야 (직경 ~1.1 cm) 이내 이며 동시에 서 스 펜 션-수 있도록 관찰 모든 동물의 모든 동물 들. 대조적으로, 전통적인 방법을 통해 6 cm 접시를 득점 하는 경우 하나의 전체에 걸쳐 스캔 해야 합니다 접시-세균성 잔디를 동물에 대 한 가장자리를 따라 검색. 이러한 차이의 그물 결과 복제 설정 메서드를 사용 하는 경우 처리량 적어도 크기 순서 동시에 100 개 이상의 전체 수명에 변화를 계량 가능 하 게 하는 전통적인 접근 보다는 한 수 사관으로 단일 실험에서 조건입니다. 예를 들어 게놈 넓은 먹이 기반 RNAi 화면에서 이전 했다 증가 수명에 의해 수 여에 필요한 159 유전자 식별 감소 daf-2 /8신호 인슐린 같이. 우리 야생-타입, 긴 daf-2(e1370) 돌연변이 및 단기 daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) 이중 돌연변이 동물 (그림 5A), 유전자 해독 하는 수명에 변화를 계량 분석, 그 100 progeric 유전자 inactivations 인슐린 같이 신호 사이의 관계. 또한, 우리 평가이 progeric 유전자 inactivations에서 healthspan ("activespan" 라는 시간)에서 변경 하는 방법을 복제 (그림 5B) 시간에 걸쳐 때리는 C. 선 충 의 감소를 관찰 하 여.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57819/57819fig1.jpg"> 그림 1: 먹이의 출현 기반 RNAi 리드 노화 연구에서 유전자 발견의 시대에 아직 대부분 gerogenes 남아 제대로 공부. (A) 많은 gerogenes 대규모 기능 게놈 스크린에서 처음 발견 되었다. 발견 날짜에 900 선 충 C. gerogenes의 많은 먹이 기반 RNAi, 유전자 검색에서 기능 게놈 접근의 가치를 강조 표시를 사용 하 여 확인 되었다. RNAi를 사용 하 여 원고 당 발견 하는 gerogenes의 수를 표시 하는 그래프, 기반 형에 주석 ( 재료의 표참조) 형 온톨로지 확장된 수명, 용어에 대 한 단축 수명, 수명 변종. Gerogenes을 발견 연구의 전체 목록에 대 한 추가 파일 1 을 참조 하십시오. (B) 대부분 gerogenes 남아 제대로 공부. 반면에 daf-16같은 게 잘 공부 gerogenes /FOXO (화살표), 이상의 800 참조, gerogenes의 대다수는 10 미만 참조 (일반 참조-아니 반드시 수명에 초점을 맞춘) 있다. 신뢰할 수 있는 높은 처리량 방법 gerogenes 사이 유전 상호 관계에 대 한 깊은 통찰력을 파생 하기 위하여 필수적인 것입니다. 그래프 pubmed에서 출판물과 RNAi 고기에서 발견 C.elegans gerogenes 간의 매핑을 기반으로 합니다. Gerogenes와 각각 연관 연구의 번호의 전체 목록에 대 한 추가 파일 2 를 참조 하십시오. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/57819fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57819/57819fig2.jpg"> 그림 2:는 전통적인 고 C.elegans 수명 (A) 점수에 대 한 복제 설정 방법. C. 선 충 수명 점수는 전통적인 방법. 조건 당 isogenic 동물의 여러 작은 동기화 된 인구는 시간이 지남에 따라. 동물의 동일한 인구 연구 과정을 통해 따 랐 다. 생존 능력은 부드러운 괴롭히는 의해 자극 될 수 있습니다 운동에 의해 평가 됩니다. 이동에 실패 하는 득점 하 고 죽은 동물과 제거 (포부 표시)는 아무 가능한 동물 남아 때까지. (B). 는 복제 설정 방법 C. 선 충 수명 득점. Isogenic 동물 나이 동기화의 큰 인구는 동일한 복제 번호판의 숫자에 걸쳐 배포 됩니다. 각 시간 지점에서 단일 복제 득점: 가벼운 버퍼 솔루션 (M9) 추가 되는 자극 하는 운동. 홍수 우물을 통해 평가 저절로 이동 하지 못하는 동물 터치 자극. 실험에 대 한 채 점 기간 시작 전에 결정 됩니다. 각 동물 한 번만 득점 하 고 더 큰 인구에 대 한 장 수는 많은 독립적인 관측에서 파생 됩니다. (C). 복제 설정 방식은 양적 C. 선 충 수명 측정 하는 높은 처리량 방법입니다. 100 또는 더 독립적인 RNAi 클론을 동시에 추적할 수 있습니다. HT115 대장균 주어진 RNAi 클론 dsRNA를 나타내는 표시 됩니다. 사실상, 모든 24 샘플 96 잘 접시에서 단일 24-잘 접시 나누어집니다. 각 결과 24-잘 접시 네거티브 (즉, 빈 벡터, 레드 잘) 있으며 긍정적인 제어 (잘 그린) 무작위로 RNAi 클론 (노란색 우물)의 컬렉션에서 배포. 일반적으로, 컬렉션에서 첫 번째 잘 (A1)에 빈 벡터를 포함 되어 있습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/57819fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57819/57819fig3.jpg"> 그림 3: 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI). (A). 기본 시작 화면을 보여주는 주요 줄거리 창 인터페이스. 이것은 어떤 소프트웨어를 열 때 표시 됩니다. 플랫폼 간의 모양이 다른 플랫폼 독립적인 윈도우 도구 키트의 사용 최소화 해야 합니다. (B). 주요 줄거리 창에서 사용할 수 있는 드롭-다운 메뉴에 대 한 메뉴 옵션의 개요. (C). 두 복제 세트에 대 한 예제 플롯 출력 스타일 (왼쪽)와 전통적인 카 플 란-마이어 스타일 (오른쪽) 데이터. 표시 되는 데이터는 독립적인 실험에서 수집 했다. 내보낸된 플롯 같은 레이블을 추가 최대 유연성을 위해 미리 그려진된 축 레이블을 포함 하지 않습니다. 이것을 촉진 하기 위하여 축 항상 y에 대 한 20% 씩 증가 하 고 x 축에 대 한 5의 증가에 분할 된다. 이 예제에서는 축과 선 레이블 (변형/치료)는 매우 간단 하 고 일반적인 이미지 편집 도구를 사용 하 여 저장 된 플롯에 추가 되었습니다. (D). 예의 출력에서 스타일 데이터 집합 복제 세트에 대 한 독립적인 실험의 결과 사이 시각적인 비교에 대 한 수 있도록 "TrialView" 기능. 이 음모는 두 개의 서로 다른 시련과 daf-2 EV(RNAi) (블루, 닫힌 원)에 대 한 해당 풀링된 결과 사이 결과 보여줍니다 N2 EV (RNAi) (검정, 닫힌 원)와 daf-16 (RNAi) (빨강, 오픈 다이아몬드)와 daf-2 . TrialView 풀링된 dataset의 적합의 품질에 영향을 미칠 수 있는 재판 관련 데이터 문제에 대 한 신속 하 게 확인 할 수 있습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/57819fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57819/57819fig4.jpg"> 그림 4: 비슷한 결과 생성 하는 복제 세트의 전통적인 방법. 손실 MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) heterodimer의 어느 부품의 수명을 증가합니다. 반면, MML-1의 어느 부품의 손실 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) 감소 수명이이 그림 (CC에서) 크리에이 티브 코몬즈 저작자 표시 라이센스 (참조 자료)를 통해 허가 기준20 에서 재 인 쇄입니다. (A). 카 플 란-마이어는 전통적인 방법으로 발생합니다. (B). 복제 설정 방법을 사용 하 여 맞는 로짓 곡선. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/57819fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57819/57819fig5.jpg"> 그림 5: RNAi 동시에 복제 복제 설정 방법 변화 수명 (A) 및 healthspan (B) 100 이상에서 변경에 따라 유전 상호 작용을 해독할 수 있습니다. 이 그림은 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시-비-상업적 4.0 국제 라이센스 (CC-의해-NC) (참조 자료) 허가8 에서 증 쇄. Progeric 유전자 inactivations 감소 인슐린 같이 신호 (ILS) (daf-2, x 축)의 맥락에서 그리고 daf-16/FoxO (y 축), ILS21의 중앙 transcriptional 이펙터의 부재에서의 (A) 유전자 수명 분석 . Daf-16 으로 비슷한 기능을 가진 유전자 inactivations daf-16 (검은 점)의 부재에 수명이 더 단축 하지 않습니다. Daf-16 에서 완전히 독립적인 기능을 가진 유전자 inactivations 마찬가지로 두 유전 배경 단축 (회색). 유전자 inactivations 부정적인 daf 2에서 수명에 효과 > daf-2; daf-16, 병렬 (화이트) 기능 제안. (B) 시간이 지남에 탈 곡 속도에 변화는 수명 (y 축)에 변화를 평가 하는 동안 많은 유전 섭 (x 축)에 대 한 평균 healthspan을 파생 수 있습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/57819fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
S 1 그림: WormLife에서 워크플로. 그림의 일부의 단계 워크플로 (때때로 "마법사"에 게 불리는) 안내. 이러한 경우, 워크플로의 마지막 단계 후의 각 초점 주요 줄거리 창으로 다시 반환 됩니다. (A) 데이터 가져오기 워크플로 스타일 데이터 집합 (B) 데이터 복제 설정 가져오기 워크플로 전통적인 카 플 란 Meier 스타일 데이터 집합에 대 한 대 한. (C) 복제 세트 스타일 데이터 집합에 대 한 음모에 라인을 추가 하기 위한 워크플로. (D) 전통적인 카 플 란 Meier 스타일 데이터 집합에 대 한 음모에 라인을 추가 하기 위한 워크플로. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/figure_S1.tiff">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 파일 1: gerogenes 식별 연구. 먹이-기반 RNAi의 출현 앞으로 유전자, 노화를 포함 하 여에 의해 세공 되지 않은 고기에 대 한 유전자 발견의 시대에 지도 했다. 리스트, 발견, gerogenes의 수의 순서 대로 그 활동 수명이 변경 유전자를 확인 하는 독립적인 연구 된다. Note gerogenes 가장 식별 연구 복제 설정된 방법8을 활용. 어떻게 유전자 inactivations 변경 수명 또한 표시의 자연: 장 수 및 progeric 유전자는 그 증가 또는 감소 수명 때 비활성화, 각각. "수명 변종" 경우를 말합니다 어디 변화의 방향 (즉 증가 또는 수명 감소) 지정 되지 않았거나 없습니다 큐레이터. RNAi 치료 수명의 추가 함께 WormBase WS262 (1 월 2018) (참조 자료)에서 데이터 결과 참조10, 아직 WormBase RNAi 고기의 큐레이터 컬렉션에 포함 되지 않습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/Supplemental_File_1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2: 각 gerogene와 관련 된 연구 수. 대부분 gerogenes는 가난 하 게 공부 했다. 일부 유전자 daf-16/FoxO 같은 많은 연구 관심의 대상이 되어, 이상의 400 gerogenes가 10 미만 관련된 간행물. RNAi 치료 수명의 추가 함께 WormBase WS262 (1 월 2018)에서 데이터 WormBase RNAi 고기의 큐레이터 컬렉션에 아직 포함 되지 않은10 에서 유래한 다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/Supplemental_File_2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 파일 3:에 대 한 일반적인 시 약의 준비 C. 선 충 실험. (A). 표준 NGM, RNAi 접시에 대 한 제조 법. (B). M9 차 아 염소 산 및 버퍼 솔루션에 대 한 제조 법. (C). 준비의 파운드 + 앰프/Tet 접시. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/Supplemental_File_3.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 파일 4: 예제 데이터 복제 세트. 복제 설정 수명 실험에서 예제 데이터 집합. 이 데이터 집합 이미 가져오기/분석에 적합 하도록 형식이 지정 됩니다. 조건 (스트레인/인 자형 및 RNAi의 조합) 당 두 개의 실험을 포함 한다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/Supplemental_File_4.csv">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 파일 5: 전통적인 경도 예제 데이터. 오른쪽-검열와 전통적인 경도 수명 실험에서 예제 데이터 집합 준비 가져오기/분석의 카 플 란-마이어 생존 플롯 기능을 사용 하 여 포맷. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57819/Supplemental_File_5.csv">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

the-replica-set-method-high-throughput-approach-to-quantitatively

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

8.5K 조회수.  University of Rochester Medical Center. 여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

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Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

연구

유전학

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...