저자는 건강의 국가 학회는 지난 자금에 대 한 감사 위한 그리고 감사 마이클 R. 그린 oligonucleotides 합성.

참고: 그림 1 phosphorothioate mutagenesis에 대 한 개요를 제공 하 고 프로세스의 주요 단계를 요약.
1. 돌연변이 체의 도서관의 세대-야생 타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑
<ol><li>T7 뇌관 종합 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') 화학 합성 DNA 합성기에 의해.</li>
	<li>화학 합성 단백질 바인딩 사이트에 해당 하는 DNA 합성기에 의해도 핑된 oligonucleotide (보완 가닥) 음성 합성. 야생 타입 뉴클레오티드 (참조 대 한 자세한 내용은이 비율에 대표적인 결과)로 10 %T 90 %A 야생-타입 뉴클레오티드의 비율로 핑 X (아래)의 각 사이트에 대 한 화학 합성 하는 동안 phosphoramidites의 적절 한 혼합을 사용 합니다. 참고: 여기,도 핑된 oligonucleotide의 순서는 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTG참조CTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. 밑줄이 그어진된 순서는 SXL 단백질 바인딩 사이트, 플러스 로드 컨트롤 되 고 뿐만 아니라, RNA에 모든 변경 영향을 확인 하는 유용한 컨트롤을 제공 하는 바인딩 사이트 밖에 서 추가 뉴클레오티드의 역방향 보완 비교 그리고 뉴클레오티드 바인딩 사이트 내에서 정상화. SXL 바인딩 사이트 시퀀스에에서 존재 하는 변압기 중 mRNA14,15,,1617, UUUUUGUUGUUUUUUUU 제안 된 방법론을 고안 하 사용 되었다. 기울임꼴로 시퀀스 T7 뇌관 순서에 무료 이며 생체 외에서 전사의 T7 발기인.</li>
</ol>2입니다. RNA의 합성
<ol><li>
앞에서 설명한18으로 20 µ L 녹음 방송 반응에서 RNA를 음성 합성.
	<ol>
<li>믹스 T7 전사 버퍼와 1 µ M T7 oligonucleotide, 1 µ M 실수로 oligonucleotide, 10 m m dithiothreitol (DTT) 2mm GTP, 1 mM 각 ATP, CTP, UTP (guanosine, 아데노신, cytidine, 및 uridine 3 인산 염), 그리고 2 U / µ L T7 RNA 중 합 효소.</li>
		<li>추가, 두 개의 별도 microcentrifuge 튜브 0.167 m m α-thio ATP 또는 0.05 m m α-thio UTP RNAs에 phosphorothioates (회로도 그림2에서 참조)을 통합 하. 참고: 다른 프로토콜에 대 한도 핑된 oligonucleotide 뉴클레오티드 대체 남은 두 테스트를 포함 하는 적절 한 녹음 방송 반응에 0.2 m m α-thio CTP 또는 0.2 m m α-thio GTP를 추가 합니다.</li>
		<li>2 h 37 ° c.에 대 한 RNA 합성 반응 혼합물을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA 샘플을 2.5 µ L 열 정한 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 2.5 µ L 10xphosphatase 버퍼를 추가 합니다. 5' 인산 염 제거를 37 ° C에서 10-30 분이 25 µ L 반응을 품 어.</li>
	<li>2-5 분 동안 80 ° C에 난방에 의해 알칼리 성 인산 가수분해 효소 효소 비활성화.</li>
	<li>Dephosphorylated RNA의 5' 끝 radiolabel (5 pmole) 1 µ L T4 polynucleotide 키 니 아 제 1 µ L γ-32P ATP 10 µ L 반응 볼륨에서을 사용 하 여. 37 ° c.에 30-60 분에 대 한 반응 혼합을 품 어</li>
	<li>20-30 분 동안 65 ° C에서 난방에 의해 T4 polynucleotide 키 니 아 제 효소 비활성화.</li>
	<li>젤 전기 이동 법 polyacrylamide 젤을 변성 시키기 10%에 의해 RNA를 정화. Autoradiography 하 여 젤에 RNA를 찾습니다. 소비 세 포함 된 방사선된 RNA 젤 슬라이스, 피 펫 팁, 벽에 눌러 microcentrifuge 튜브에 크 러시와 가수분해 K (PK) 버퍼 (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 m m EDTA, 150 mM NaCl, 1% 나트륨 라우릴 황산 염)에 담근 다. 하룻밤에 2 h에서 실내 온도에 튜브를 회전 합니다.</li>
	<li>원심 젤 슬러리, 젤 삭제 및 버퍼 솔루션을 수집 합니다.</li>
	<li>페 놀-클로 프롬의 같은 볼륨으로 두 번 그리고 한 번 클로 프롬 솔루션을 추출 하 고 수성 단계를 수집 합니다.</li>
	<li>아세트산 나트륨, pH 5.2, 캐리어 3 M의 수성 단계 0.1 볼륨에 추가 tRNA 또는 glycogen, 그리고 에탄올의 2.5 볼륨. 1 h-80 ° C에서 샘플을 유지.</li>
	<li>16,873 x g에서 고속 microcentrifuge에서 5-10 분 샘플 원심 RNA 펠 렛을 방해 하지 않고 버퍼/에탄올 솔루션을 신중 하 게 제거 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 신중 하 게 2-5 분 제거 에탄올에 대 한 원심. 건조 한 공기에 있는 펠 릿.</li>
	<li>20-50 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 펠 릿 resuspend-물 처리. -20 ° C에서 사용까지 저장 합니다. 참고: 방사선된 RNA 방사능 으로부터 보호 하기 위해 적절 한 예방 조치 및 플 렉 시 유리 방패를 사용 하 여 모든 단계를 수행 합니다. 현재, 스핀 열 RNA의 젤 정화 대 안으로 비법 인된 방사능, 더 일반적으로 사용 되 고 더 편리 하 게 제거 하는.</li>
</ol>3. 단백질 바인딩 반응 및 바인딩된 RNA의 분리
<ol><li>에 있는 재조합 형 단백질을 표현 하 고 대장균에서 정화.</li>
	<li>분 광 광도 법에 의해 또는 알려진된 단백질 기준, 둔감 한 혈 청 알 부 민 (BSA) 옆 SDS polyacrylamide 젤에서 분리 하 여 재조합 단백질 농도 견적 한다. 얼룩이 Coomassie 화려한 블루 R-250와 젤 여 관심과 표준 BSA의 단백질을 시각화. 알려진된 양의 BSA 희석 동일한 젤에 비해 단백질 quantitate 참고: 저장에서-80 ° C까지 사용 하 고 20 m m 4-(2-Hydroxyethyl) 희석 piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES), pH 8.0, 1 m m dithiothreitol (DTT), 재조합 단백질 0.2 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 0.05 %NP-40, 20% 글리세롤. 사용 0.5-1.0 m m 프로 테아 제 억제 물 phenylmethane sulfonyl 불 (PMSF)는 선택 사항입니다.</li>
	<li>10 mM Tris HCl, pH 7.5에에서 RNA 바인딩 반응 (20-100 µ L) 수행, 0.09 µ g / µ L 소 혈 청 알 부 민, 1 mM EDTA, 0.15 µ g / µ L acetylated 1mm DTT, 50mm KCl, 0.5 단위 / µ L RNase 억제제, tRNA, 5'-끝 방사선 RNA, 그리고 적절 한 농도 (a의 6 µ L 농도는 RNA의 50%는 단백질을 바인딩합니다) 단백질의. 참고:이 바인딩 버퍼 3 RNA-바인딩 단백질에 대 한 작동 (SXL, U2AF65, 및 PTB), 그러나 관심사의 단백질에 대 한 표준화 해야 합니다. 약 50%를 얻을 하는 데 필요한 특정된 단백질 준비에 대 한 다양 한 희석을 사용 하 여 실험적으로, 단백질 농도 추정 RNA 바인딩. 이 조건 또는 Kd RNA 바인딩 곡선의 가장 민감한 부분을 나타냅니다.</li>
	<li>단백질 바인딩 반응 (또는 얼음) 25 ° C에서 20-30 분 동안 품 어.</li>
	<li>
두 가지 방법 중 하나를 사용 하 여 언바운드 분수에서 단백질 바인딩 RNA 분수를 구분:
	<ol>
<li>Nitrocellulose 필터 바인딩<ol>
<li>실 온에서 진공 매니폴드에 연결 nitrocellulose 필터에 바인딩 반응 (20-100 µ L)를 적용 합니다. 참고:만 RNA-단백질 복잡 한 필터에 유지 하 고 필터를 통해 RNA 흐름을 언바운드. 필터 바인딩 접근 바운드 RNA의 높은 복구 수 이며 빠르고 간단 하 게, 젤 기동성 교대 분석 실험에 비해. DEAE 막 nitrocellulose 필터 아래에 배치 하 여 언바운드 RNA 분수 수집 또는 바운드 분수와 함께 비교에 대 한 RNA를 무료 수 이기도 합니다.</li>
			<li>Nitrocellulose 필터를 포함 하는 유지의 부분 microcentrifuge 튜브에 맞게 더 작은 조각으로 방사성 RNA 필터 조각 몰입할 충분 한 PK 버퍼 (300-500 µ L 포함 10-20 µ g PK)에 담가 잘라내어 필터에서 RNA elute 2-3 h 또는 하룻밤.</li>
			<li>페 놀-클로 프롬, 클로 프롬로 추출 하 고 수집 수성 단계. 추가 나트륨 아세테이트, 에탄올, 냉장고에 부 화 한 후 원심, 세척, 건조 하 고 resuspend DEPC 처리 한 물에 RNA. 2.10에 2.14 위의 단계에서 설명한 대로 다음이 단계를 따릅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>젤 기동성 교대<ol>
<li>준비 하 고 5% 기본 polyacrylamide 젤 유해 (후 60: 1 Acrylamide:bis-아크릴) 0.5에서 필터 바인딩 방법 하는 대신 바인딩 반응 시작 하기 전에 x TBE (표준 트리 스-Borate-EDTA 버퍼).</li>
			<li>미리 콜드 룸 (4 ° C)에서 250 V 15 분 젤을 실행 합니다.</li>
			<li>위의 사전 실행된 젤의 별도 우물으로 각 바인딩 반응 (위)를 로드 합니다. 참고: 단백질 저장 버퍼 샘플 로드 웰 스에 대 한 충분 한 글리세롤을 제공 한다.</li>
			<li>단백질 바인딩 RNA 젤 전기 이동 법 특정 단백질 및 RNA 크기에 따라 1 ~ 2 h에 대 한 250 V에서 차가운 방에 구분 합니다.</li>
			<li>Autoradiography 하 여 젤에 RNA-단백질 복합체의 위치를 찾습니다. RNA-단백질 복합물을 포함 하는 젤 슬라이스 삭제하시오 젤 조각 분쇄 하 고 PK 버퍼에 몸을 담글 하 여 젤 조각에서 RNA을 elute.</li>
			<li>페 놀-클로 프롬, 클로 프롬로 추출 하 고 수집 수성 단계. 나트륨 아세테이트, 에탄올, 냉장고에 부 화 한 후 원심, 세척, 건조, 공기 더하고 DEPC 처리 한 물에 RNA를 resuspend. 2.10에 2.14 위의 단계에서 설명한 대로 다음이 단계를 따릅니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 돌연변이 뉴클레오티드 위치 검출을 위한 요오드 죽 습 Phosphorothioate 제품의 분석
<ol><li>20 µ L DEPC 처리 물 포함 최대 10 µ g 캐리어에에서 1mm 요오드를 추가 RNAs (바운드 및 총 RNAs) phosphorothioate 관의 사이트에서 다니엘에 tRNA. 5 분 동안 실 온에서 품 어. 참고: 요오드 분열 약간 다른 조건에 세부 사항 더-7% (v/v) iodoethanol, 3 분 동안 95 ° C에서 난방-Gish & 엑스 타인과 198819에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>위에서 설명한 대로 추가 나트륨 아세테이트/에탄올, 쪼개진된 RNA 침전. 젤을 변성 시키기 위한 로드 염료에 resuspend. 열 및 RNA 조각에 15-20% 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>노출 x-선 필름 polyacrylamide 젤.</li>
	<li>총 풀 autoradiography를 사용 하 여 대 바인딩된 분수 밴드를 감지 합니다. 참고: 배기 후드에 요오드와 모든 단계를 수행 합니다. 여기에 표시 된 RNA 분리,이 젤의 하단에 추가 인치 긴 스페이서를 삽입 하 여 젤 접시의 하단에 두 스페이서의 두께 두 배로 얻을 수 있다 쐐기 모양의 젤 채택 된다. 이 모양은 짧은 RNA 파편 사이 더 균일 한 또는 더 가깝게 간격을 허용 한다. 또는, 검색 및 방사능의 정량에 대 한 x 선 필름 보다는 phosphorimager는 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects.">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li><li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila.">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li><li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+germ+cells+choose+their+sex?+Drosophila+as+a+paradigm.">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li><li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary.">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li><li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline.">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li><li>Robida, M. 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저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

Mutagenesis은 긴 단백질 바인딩 사이트 특성에 사용 되었습니다. 첫째, 돌연변이의 시리즈 구성 하 고 바인딩 바인딩 선호도에 미치는 영향을 분석 하는 분석에서 개별적으로 테스트 될 수 있습니다. 기준이 mutagenesis 접근 여러 시퀀스를 분석 하는 방법을 제공 하는 동안 여러 단계 돌연변이 구성 하 고 바인딩 각 돌연변이 대 한 반응의 일련과 같은 표준 접근에, 힘들고 시간이 걸리는 이며 하지 않을 수 있습니다. 특히 긴 시퀀스에 대 한 포화 mutagenesis 허용. 둘째, 시퀀스를 무작위 수 있습니다 고 수영장 사용 여러 사이클 바인딩 및 중 합 효소 연쇄 반응의 증폭 (PCR). 이러한 시퀀스 단백질을 복제 하 고 식별 하 고 일치 시퀀스에서 바인딩 사이트 유효성을 시퀀싱 할 것 이다. 그럼에도 불구 하 고,이 반복 바인딩 및 증폭 옵션 여러 단계를 포함 하 고 확인 하는 바인딩 사이트 내에서 중요 한 잔류물에 힘 드는입니다. 또한, 반복된 시퀀스 확대 PCR에 시퀀스 바이어스를 발생할 수 있습니다. 셋째, 임의의 풀에서 선택한 시퀀스 그것은 상대적으로 저렴 하지만 높은 처리량 시퀀싱의 빠른 옵션을 사용 하 여 시퀀싱 수 있습니다. 따라서, 여러 단계, 힘 드는 또는 비싼 방법의 이러한 한계를 극복 하기 위해 고안 빠르고, 저렴 한, 그리고 가장 중요 한 것은 단일 단계 방법, 설명, 바인딩 사이트 (PTM)의 포화 mutagenesis 달성 하기 위해.
이 접근에 주요 단계 식별 또는 야생-타입 nucleotide(s)의 태그 포함 됩니다. 우리 phosphorothioate 뉴클레오티드는 인산 염에 oxygens의 어느에서 백본 유황, 바뀌는 사용 설명된 (그림 2). 장점은 요오드 화학적 다니엘 phosphorothioate 뉴클레오티드의 중추를 사용할 수 있습니다. 따라서, phosphorothioate 백본 포함 된 RNA 기판의 요오드 분열 생성 시퀀싱 형 사다리, 분열의 사이트는 프록시 또는 4의 존재에 대 한 태그 위치에 기초 합니다. 언바운드 및 총 분수의 비교 우선적으로 바인딩된 분수에서 제외 되 고 따라서 단백질 바인딩 위한 중요 한 잔류물을 식별 합니다. 대조적으로, 잔류물 바인딩을 위해 중요 하지 않은 두 분수 사이 동등 하 게 분산 유지. 이 방법은 어떤 RNA 의무적인 단백질에 대 한 바인딩 사이트 정의를 사용할 수 있습니다.
요약 하자면, 원스텝 포화 mutagenesis 이렇게도 핑, phosphorothioates, 및 요오드 분열, 결합 RNA에 바인딩 사이트의 특성에 대 한 강력한 수단을 제공 합니다. 그러나,이 방법은 바인딩 사이트 mutagenesis 전에 이미 알려진 해야 합니다. 또한, 단백질-바인딩 조건 각 단백질에 대 한 최적화 해야 합니다. 다음 주의 사항을 강조 될 필요가 있다. RNA 처리에 대 한 주의 같은 장갑, 솔루션 및 DEPC 처리 물, 압력가 마로 소독 피 펫 팁, 튜브, 버퍼의 준비를 착용 하 고 RNA에 대 한 장비를 누리고 RNAses를 피하려고만 사용 행사 해야 합니다. 마찬가지로, 방사능 방패, 방사성 방사성 물질을 사용 하 여 하는 것은 필수, 모니터링을 포함 하는 관심과 유해 화학 물질을 사용 하는 동안 배기 후드의 사용 필요 하다.

유전자 규칙 생물학에 있는 중요 한 역할을 한다. 유전자의 전사 사전 mRNA 접합, 3' 끝, RNA 수출, 번역, mRNA 지 방화, 붕괴, 포스트 번역 상 수정/안정성, 등 모두 DNA과 RNA 의무적인 단백질 유전자에 핵심 역할 수준에서 통제 될 수 있다 규칙입니다. 수많은 규제 단백질 식별 분자 유전 분석, 하는 동안 그들의 작은 하위 집합만 그들의 세포질 기능 또는 바인딩 사이트 비보완전히 특징 되어 있다. 계통 발생 시퀀스 분석과 mutagenesis DNA 또는 RNA 단백질 상호 작용의 특성을 상호 보완적인 접근을 제공 합니다.
RNA-바인딩 단백질은 성적인 감 별 법을 포함 하 여 개발 프로세스에서 중요 한. 섹스-치명적인 (SXL) 초파리 단백질 또는 마스터 섹스-스위치 단백질은 결 석 남성, 여성에서 현재에. Uridine-풍부한 시퀀스 또는 pyrimidine 책자 다운스트림 사전 mRNA 목표 (변압기, 치명적이 지 섹스, 남성 전용 lethal2) 체세포1,2에서에서 특정 스플라이스 사이트에 인접 한 인식 ,,34. 또한, 그것은 기초의 증강 (e(r)) 사본5,6uridine 풍부한 polyadenylation 증강 시퀀스에 바인딩하여 스위칭 polyadenylation 사이트 조절. SXL 가능성이 조절 되도록 남아 있는 여성 생식에 추가 대상 확인1,7,,89,,1011, 12 , 13.
일반적으로, 바인딩 사이트의 특성을 포함 한다 mutagenesis를, 예를 들어 삭제 또는 단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드의 대체. 야생-타입 RNA 순서를 기준으로 각 돌연변이 바인딩 사이트 다음 바인딩 선호도 결정 하기 위해 일련의 단백질 농도 사용 하 여 분석 (Kd 또는 평형 분리 상수); 관심사의 단백질에 대 한 Kd 50 %RNA 바인딩을 얻을 하는 데 필요한 단백질 농도 이다. 자세한 mutagenesis의이 노동 집약적인 과정 포함 세대 및 수많은 돌연변이의 분석-3 야생 타입 뉴클레오티드 바인딩 사이트에 있는 각 위치에 대 한. 따라서, RNA에 단백질 의무 사이트의 빠르고, 쉽고, 저렴 한 포화 mutagenesis에 대 한 다른 접근 방법에 대 한 필요가 있다.
여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore&#160;25&#160;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dephosphorlyation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates

유전자 규칙 개발에 중요 한 역할을 한다. 수많은 DNA과 RNA 의무적인 단백질 높은 특이성 유전자 발현 제어를 가진 그들의 대상 시퀀스를 바인딩합니다. 이러한 규제 단백질 유전자 발현 DNA (전사)의 수준에서 또는 RNA (이전 mRNA 접합, polyadenylation, mRNA 전송, 부패, 및 번역)의 수준에서 제어합니다. 식별 규제 시퀀스의 유전자가 켜거나 전환 뿐만 아니라 또한 어떤 다운스트림 유전자 규정 하는 특정 단백질에 의해 통제 된다 이해 하는 데 도움이 됩니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

도 핑을 사용 하 여 포화 mutagenesis의 원리:
야생-타입 및 다른 뉴클레오티드의 적절 한 어 금 니 비율을 분석 하는 것입니다 한 위치 하는 경우에 모든 4 개의 뉴클레오티드의 동등한 혼합물을 사용 합니다. 그러나, 그러므로 동시에 여러 위치를 분석 비율의 비-야생 타입 야생-타입 뉴클레오티드를 조정 해야 합니다, 즉, 감소. 그렇지 않으면,이 하나의 대체 뿐만 아니라 있을 것입니다 또한 단일 뉴클레오티드 대체의 효과의 분석을 제외 하는 분자에 여러 야생 타입 뉴클레오티드와 함께 서식 파일. 따라서, 엄지손가락의 규칙으로 사용 비율의 비-야생 타입 1/n의 야생-타입 뉴클레오티드를 여기서 n은 분석을 위치 수입니다. 여기, 우리가 분석 10 위치 동시에 야생-타입 뉴클레오티드의 90%와 10%의 DNA 템플렛을도 핑에 대 한 야생 타입 뉴클레오티드를 포함 하는 혼합물을 사용 하 고. 별도 녹음 방송 반응, 각 녹음 방송 반응 4 phosphorothioates 중 하나 수행 완료 됩니다. 따라서, 각 반응도 핑된 위치에서 특정 염기를 모니터링합니다.
간섭으로 인해 분할의 원리:
여기에 제시 된 mutagenesis 접근, RNAs 평균에 분자 당 미만 1 phosphorothioate 잔류물이 있다. 바인딩, 단백질 바인딩 분수와 언바운드 분수 사이 RNA 분자 파티션 과정 중 Phosphorothioate 백본 결합의 분열을 특정 뉴클레오티드 phosphorothioate 링크에 연결 이므로 그 자리에서 특정 염기의 존재의 판독. 지정된 된 위치에는 뉴클레오티드 변경 될 때 바인딩에 아무런 영향을 미치지도 있을 수 있습니다 그것은 또는 부분적으로 또는 완전히 바인딩을 억제 수 있습니다 예상 된다. 경우 특정 뉴클레오티드의 존재에는 아무 영향이 바인딩 단백질-바운드 및 언바운드 분수 사이 동등 하 게 분할 됩니다. 그러나, 주어진된 위치에 특정 뉴클레오티드 단백질 바인딩 방해 하는 경우 그것은 우선적으로 제외 됩니다 단백질 바인딩 부분에서. 방해의 정도 각 젤 전기 이동 법에 따라 동일한 반응에 있는 위치에 대 한 양적 모니터링할 수 있습니다. 이 개념은 도식 (그림 3)에 나와 있습니다. 총 RNA 분수 (레인 T), 밴드 강도 이며 모든도 핑된 위치 (밴드 1, 3-7)에 대 한 합니다. 위치 1, 4, 7에서 온 단백질 바인딩 RNA의 분수 (레인 B),는 뉴클레오티드에 바인딩에 영향을 주지 않습니다 합니다. 그러나, 위치 3과 6에 그것은 바인딩을 방해 하 고 따라서 바운드 분수에서 제외 됩니다. 5 위치에서 간섭 부분입니다. 따라서, 모든 4 개의 뉴클레오티드의 분석 4 짝된 레인, T와 B 각 뉴클레오티드의 비교 하실 수 있습니다. 그럴 경우, 단백질 바인딩에 RNA 등뼈에 유황의 효과를 반영 하는 주어진된 위치에 대 한 그 야생-타입 뉴클레오티드를 지적 했다.
함께 autoradiograph (그림 4) 변성 젤 (총 풀 T)와 B 바인딩된 분수에서에서 레인의 두 쌍 (α-thio A와 α-thio U)를 보여 줍니다. 레인 (T와 B)의 각 쌍 사이 각 위치에 밴드의 강도 비교 하 여 여러 가지 관측을 만들 수 있습니다. 첫째, 젤, 즉, uncleaved 제품, 모두 α-thio의 상단에 신호의 대부분은 레인과 α-thio U 레인. 둘째, α-thio A 쌍 레인, 여러 밴드 (요오드 분열 제품)는과 총 RNA 분수 1; 위의 예를 들어 밴드는 동일 α-thio는 레인에 대 한 바인딩 사이트 내 관련 밴드 참조 번호가 지정 됩니다. 셋째, 젤의 하단에 밴드는 더 밀접 하 게 간격 (예를 들어, 아래 6 밴드)을 시퀀싱 젤에 대 한 일반적인 것 보다. 넷째, 여러 밴드는 총 RNA 분수에 존재 하지만 결 석 또는 바인딩된 RNA 분수 (예: : 밴드 1, 2, 3, 및 5)에 크게 감소. 다섯째, α-thio U 레인 쌍에 대 한 있지만 대부분 밴드는 총 및 바운드 차선 사이 비교 일부 밴드 되지 않습니다 바인딩된 분수 (예: : 밴드 7, 8)에 상대적으로 덜 긴장.
이 새로운 메서드 및 다음과 같은 결론을 리드의 성공적인 개발에 대 한 증거를 제공 하는 이러한 관측: 첫째, RNA의 대부분은 쪼개진 때문에 α-thio A 쌍 차선 및 α-thio U 차선, 쌍에 대 한 제공 증거의 단지 작은 분수 RNA를 포함 수정 또는 phosphorothioate 잔류물. 이 RNA 분자 개 이상의 phosphorothioate 잔류 물질이 확인 하기 때문에 중요 하다. Α-thio A와 α-thio U 대 한 두 개의 차선 사이 바인딩 사이트 이외의 여러 밴드에 대 한 두 번째, 동일 하거나 유사한 농도 로딩은 두 차선, 차선 사이 쉬운 비교를 허용에 대 한 비교를 보여 줍니다. 셋째, 더 가깝게 간격을 둔 밴드 α-thio A와 α-thio U, 젤 (상단에 얇고 하단에 두꺼운)의 쐐기 모양으로 따라서 더 이상 시퀀스 읽기의 분석을 허용 하 고 더 높은 해상도 제공 하 고, 달성 된다. 일반적으로, 짧은 조각은 더 넓게 간격을 젤에 균일 한 두께와. 넷째, 실종 또는 바운드 분수에 특정 밴드의 감소 된 강도 야생-타입 뉴클레오티드 우선적으로 바인딩된 분수 (α-thio A)에서 제외 되었음을 나타냅니다. 바운드 레인 내 다른 밴드의 상대 농도 또한의 다른 위치에서 야생 타입 잔류물 간섭 정도 대 한 정량적 인 정보를 제공합니다. 즉, 돌연변이 또는 특정 위치에서 야생 타입 뉴클레오티드 단백질 바인딩 방해합니다. 마지막으로, 비 브리지 oxygens (α-thio U) 중 하나에서 백본 황 대체 (phosphorothioate)의 효과 테스트, 3 순위 백본 sulfurs (예를 들어, 6, 7 및 7 아래)에서 작은 효과 보여 보여 줍니다. 우리의 결합 된 결과 바인딩 사이트 내에서 여러 위치 특혜 실종을 표시 하거나 바운드 분수에 특정 밴드의 농도 감소를 보여 줍니다. 이것은 단백질 (α-thio A) 바인딩 사이트에 있는 특정 기지와 상호 작용을 나타내는 자료 보다는 백본 대체. 한편, α-thio C의 표시는 간섭 패턴 α-thio a 비교 그러나만 3-4 α-thio G 대체 표시 작은 감지 간섭 중심, 예를 들어 위치 번호 2와 3 (데이터 표시 되지 않음). 이 방법은 어떻게 접합 진압 SXL 및 일반적인 접합 계수 u 2 snRNP 보조 요소 (U2AF65) 바인딩할는 동일한 사전-mRNA 접합 신호 순서 (polypyrimidine로)15 가지 방식에서에 차이 나타내기 위해 사용 되었습니다. .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57816/57816fig1.jpg"> 그림 1: 키의 순서도 단계 phosphorothioate mutagenesis (PTM). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57816/57816fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57816/57816fig2.jpg"> 그림 2: 요오드에 의해 화학적으로 죽 습 있을 수 있습니다 두 개의 뉴클레오티드의 phosphorothioate 연동의 도식. 황 인산 비 브리지 oxygens의 한을 대체합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57816/57816fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57816/57816fig3.jpg"> 그림 3: 간섭 때문에 분할의 원칙. 가상 RNA 단백질 바인딩 사이트를 포함 하 여 6 개의 위치에 대표적인 α-thio 뉴클레오티드를 포함 합니다. 단백질 바인딩 다음 RNA 요오드에 의해 phosphorothioate 관의 사이트에서 죽 습 이다. 위치 1-7 및 바인딩 사이트 내에서 임의로 참조 텍스트에 대 한 번호가 지정 됩니다. 위치 2 또는 누락 된 밴드 phosphorothioate 법인 또는 마약에 취해 비 뉴클레오티드를 나타냅니다. 레인 T 총 RNA 이며 레인 B는 단백질 바인딩 RNA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57816/57816fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57816/57816fig4.jpg"> 그림 4: Phosphorothioate mutagenesis (PTM) 접근 방식은 수 polypyrimidine-로/3의 포화 mutagenesis' 사이트 변압기 사전 mRNA에 결합. 레인 T 총 RNA 이며 레인 B는 단백질 바인딩 RNA. Α-thio 나타냅니다 RNA α-thio ATP의 합성 하 고 시퀀스에 α-thio adenosines와도 핑된 위치를 식별 합니다. 3 강한 밴드 그 위치에서 순서에 adenosines에 해당합니다. Α-thio U α-thio UTP의 합성 RNA를 나타냅니다 하 고 시퀀스에서도 핑된 위치를 포함 하 여 모든 uridines를 식별 합니다. 왼쪽에 세로 라인 SXL 바인딩 사이트를 표시합니다. 바인딩 사이트 내 위치 1-8 참고 목적 및 결과 섹션에서 설명의 용이성을 위해 번호가 지정 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57816/57816fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

a-novel-saturation-mutagenesis-approach-single-step-characterization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.5K 조회수.  University of Colorado at Boulder. 특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

비디오: A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

연구

유전학

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...