우리는 기증자와이 일을 가능 하 게 그들의 가족에 감사입니다. 우리는 또한 국제 의학 연구소 및 테네시 기증자 서비스 조직의이 연구에 사용 된 좌표 컬렉션을 돕는 직원의 도움을 주셔서 감사 합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회, NIH OT2-OD023850 EMS2 와 봉급 지원 NIH에서 T32 일부-DK007673 AMZ 하에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 밴 더 빌 트 변환 병리학 공유 리소스의 직원 조직 준비에 조언과 LCM 악기에 대 한 액세스 감사입니다. 밴 더 빌 트 조직 병리학 공유 리소스 NIH P30-CA068485-14 보조금과 U24-DK059637-13에 의해 부분에서 지원 됩니다. 우리는 게놈 분석에 대 한 게놈 기술 접근 센터 워싱톤 대학의과 대학에 유전학의 부에 감사합니다. GTAC는 부분적으로 지원 됩니다 Siteman 암 센터 NCI 암 센터 지원 그랜트 #P30 CA91842와 국립 센터에서 ICTS/CTSA 그랜트 #UL1TR002345 연구 자원 (NCRR), 국립 보건원 (NIH), 그리고 NIH의 구성 요소에 대 한 의료 연구에 대 한 로드맵입니다. 이 간행물은 전적으로 저자의 책임 고 반드시 NCRR 또는 NIH의 공식 보기를 대표 하지 않는다.

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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 절차 RNA-이 대 한 RNA를 파생 하는 원본으로 수많은 장 중추의 효율적인 수집 가능 여기, 우리가 극대로 RNA 무결성을 유지 하면서 기존 프로토콜에서 설명 하는 프로세스를 가속 있다. 이 절차의 모든 단계는 상호 의존, 그것은 중요 한 연구의 개시에서 모든 문제를 제거 하 고는 모든 샘플 준비가 되어로 유사 하 게 다른 가능한 신뢰할 수 있는 RNA-이를
절차의 개시에서 RNA 무결성 수 있습니다 부정적인 영향을 받을 경우 실험실에서 처리를 위해 장기 기증 시 조직의 컬렉션 및 조직의 영수증 사이 시간 간격 (찬 허 혈 성 시간) 너무 깁니다. 이 문제를 감안할 때, 우리는 높은-품질 RNA 여전히에서 추출 수 있습니다 장 샘플 24 시간 냉 허 혈 성 후에 놀 랐 다. 장 샘플은 냉장 냉장 솔루션에 제대로 저장 때 조직의 무결성 및 RNA 품질의 최상의 보호가 이다. 장 조직 기관 컬렉션 팀 내장의 소화 효소, RNases 및이 기간 동안 RNA 품질에 영향을 줄 수 있는 다른 분자는 노출을 제한에 의해 수집 플러시 되도록 해야 합니다. 우리 장 표본 완전히 플러시되지 때이 크게 샘플의 린을 줄일 수 있습니다 발견 했다.
장 조직 샘플을 준비 하기 위한 우리의 최적화 된 절차를 사용 하 여, 우리 TFM에 샘플을 포함 하지 않도록 수 있습니다. TFM 에탄올과 자일 렌 장 중추의 시각화 방해 어두운 갈색 침전을 형성 하기 위하여 상호 작용을 하기 때문에 우리는 우리의 샘플에서 그것을 제외 하 고 선호 합니다. 그러나, 마우스 또는 다른 종에서 장의 조직으로 작업할 때 TFM 제외 가능한 않을 수 있습니다. 이 경우에, 우리 TFM 슬라이드에 준수 섹션에서 제거 실험을 했습니다. 조직에 충분 한 표면적, 경우 에탄올 (-20 ° C에서 냉장)에 수 있습니다 신속 하 게 집게로 제거 될 수 있도록 TFM을 해결 하기 위해 전송 피 펫과 슬라이드에 틈 다 떨어뜨린 수 있습니다. 떨어지는 슬라이드에 에탄올 에탄올, 여러 슬라이드 처리 되는 브라우닝 효과 악화 수 있는 유리병 안에 TFM의 축적을 방지 합니다.
플래시 동결, 동안 우리 부탁 보다는 100% 에탄올, 2-MB, 드라이 아이스 슬러리를 사용 하 여 2 MB 쉽게 직물의 표면에 착륙 할 때 증발 하기 때문에. 에탄올은 TFM, 쉽게 제거 될 수 없는 조직 블록에 화학 슬러지를 형성 결합 될 때 특히 더 느리게 증발 해 경향이 있다. 에탄올과 2 메가바이트 소 다 튄 적극적으로 작은 냉동 용기에 얼 때 드라이 아이스 슬러리의 작은 볼륨 낮은 비 열 용량을가지고 있기 때문에 하는 경향이 있다. 대신, powderized 드라이 얼음으로 채워진 큰 직사각형 양동이 사용 하 여 큰 냉각 질량을 제공 하 고 조직 고정 되는 동안 온도 동요를 방지.
앞에서 언급 했 듯이, 그것은 때때로 다른 사람을 기준으로 일부 조직 샘플에서 장의 중추의 지속적인 시트를 쉽게입니다. 당연 하 게도, LCM의 전반적인 속도 원본 조직 또는 샘플링 되 고 장 지역의 특성에 따라 변동 적용 됩니다. 이러한 이유로, 그것은 종종 최고의 개시에 많은 신선한 냉동 샘플을 준비 하입니다. 우리는 일반적으로 소장 (~ 2 cm x 1.5 cm, 각)의 세그먼트 당 20 샘플의 총 보다 훨씬 더 충분 한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 충분 한 RNA를 제공 하는 발견. 그러나, 단지 장 조직의 작은 길이 사용할 수 있으면, 5 cm의 최소 길이 좋습니다. 우리의 방식으로 얻을 것 이다 가장 낮은 수익률 더 아래에 설명 하는 RNA의 18-30 ng에서 범위 것 이다. 최소 5cm 길이 잠재적으로 줄일 수 있습니다, 응용 프로그램에 따라 더 높은 양의 cDNA preamplification 사용 하는 경우에 특히. 이러한 매개 변수는 현재 연구에서 테스트 하지 했다. 예를 들어 장 중추 정량4와 함께 사용 하기 위해 전체 두께 장 생 검 견본 (2 x 2cm)에서 수집 되었습니다.
우리는이 연구에서 보여줍니다, 에탄올 호환 염료, 바이올렛, Cresyl 사용 하 여 RNA 무결성의 수성 얼룩, 톨루이 블루 보다 훨씬 더 나은 보호를 제공 합니다. 에탄올에 빠져들 때 RNases 비활성5,15된다. 그러나, RNases7,15물에 한 번 노출 기능을 회복 여전히 수 있습니다. 수성 염료와 얼룩 때 조직 거의 1 분9, 실질적인 RNA 저하에 이르게 nuclease 무료 물에 노출 되어야 합니다. 톨루이 블루 조직 얼룩을 사용 하 여, 우리가 하지 못했습니다 얼룩, 전후 물에 노출을 줄이기 위해 감소 때문에 이러한 수정 또한 통풍 관 및 블루, 톨루이의 보존 각각. 비슷한 문제가 되며 기반 염료9또한 발생 했습니다. 여기서 설명 하는 수정된 프로토콜에서 Cresyl 바이올렛으로 얼룩 방지 물, 장 샘플의 직접 노출 함으로써 극대로 RNA 무결성을 유지 합니다. 이 결과 얼룩 솔루션에 추가 RNase 억제제에 대 한 필요성을 제거합니다. 우리는 이러한 억제제는 통풍 관 및 염료의 방해로 수성 염료, 파란, 톨루이의 사용 효과 발견.
처음에 우리의 얼룩 프로토콜 최적화, 우리 다른 프로토콜에서 얻은 결과 재현 하지 못했습니다 하 고5,7,,811보고 합니다. 이 대 한 이유는 분명 하지 않다, 그러나 우리는 일관성 염료-이해 및 유지에는 여러 가지 요인 발견. 예를 들어 특정 프로토콜 또는 75% 에탄올5100% 에탄올8 에서 Cresyl 바이올렛을 사용 하 여 조직, 스테인드 성공적으로 있지만 염료 중추를 희미하게 표시 또는 높은 배경 했다만에 비해 95% 에탄올에 바이올렛 Cresyl를 사용 하 여. 마지막으로, 얼룩 솔루션에 사용 되는 Cresyl 바이올렛의 비율 또한 매우 중요 하다. 대부분 프로토콜 추천 1 %Cresyl 바이올렛 솔루션7,8, 하지만이 농도 최대 2 분에 대 한 섹션을 얼룩이 지기 후에 우리의 손에서 신뢰할 수 있는 얼룩 제공 하지 않았다. 우리는 최고의 성공 4%의 명확히 포화 얼룩 솔루션 얼룩 Cresyl 바이올렛11 살 균 주사기 필터8샘플에 적용 했다. 이 포화 솔루션 훨씬 더 급속 한 샘플의 얼룩이 있습니다, 그리고 작은 10-15 미 (-20 ° C)에서 냉장된 95% 에탄올에 샘플의 사전 정착 얼룩의 더 급속 한 통풍 관을 수 있습니다.
또 다른 보고서는 장의 중추 75% 에탄올 솔루션5에서 오신 Cresyl 바이올렛 결합 하는 때 신선한-냉동 인간 창 자 섹션에 얼룩진 가장 명백 하 게 했다 발견. 그러나, 우리는 오신 어렵게 더 중추를 식별 하 고 우수한 검색을 제공 하는 Cresyl 바이올렛, 혼자, 발견. 다른 연구에서는 버퍼링 된 바이올렛 Cresyl 솔루션 자궁내 막 암 조직10에 대 한 일관성 있는 얼룩 결과 제공으로 밝혀졌다. 그러나, 우리가 발견이 인간의 창 자 조직 어떤 향상을 제공 하지 않았다 또한 구현할 수 없는 얼룩 솔루션에 대 한 95% 에탄올을 사용 하는 경우.
수 있는 프로토콜 수 있습니다 일시 중지 되며 나중에 재개 조건 테스트 했습니다. 많은 프로토콜 제안 미리 슬라이드를 구분 하 고 다시 슬라이드5,9에 장착 후 즉시 그들을-80 ℃에서 동결. 이 접근, 얼룩 하 고 LCM 다음 다시 시작할 수 있습니다 다음 주 내에서 뛰어난 유연성을 제공 합니다. 그러나, 뿐만 아니라 않았다이 크게 방해 얼룩이 지기; 그것은 또한 우리의 손에 (데이터 표시 되지 않음)에 RNA 무결성을 감소. 이 문제를 회피, 그로버 외. 얼룩 및 저장 냉장고11에서 이전 섹션을 탈수 것이 좋습니다. 이 방법에서는, 슬라이드 스테인드 되며 ( 표 1)과 같이 100% 무수 에탄올 단계 (프로토콜 섹션 5.2)까지 탈수. 그리고 샘플 10 분 100%의 무수 에탄올의 두 번째 유리병에는 알을 품는 다음 드라이 아이스에 냉장 하 고-80 ° C 냉동 고로 전송 시키는 젤 원뿔 튜브에 즉시 전송 됩니다. 냉동 실에서 샘플을 제거 하는 경우 슬라이드는 즉시 LCM11수행에 30 s 고 air-dried 사전에 대 한 100%의 무수 에탄올에 침수. 불행히도, 우리의 손에서이 이렇게 감소 린 0.6-0.8 (데이터 표시 되지 않음). 우리는 따라서 수행 모든 단면, 얼룩, LCM 같은 날에 우리의 조건에서 최대한 RNA 무결성을 얻기 위해 resorted. 이것은 시간이 걸리는 과정일 증명 하지만 하루 종일 작업 하는 동안 10-14 LCM 모자를 채울 수 있습니다.
크 실 렌 인큐베이션 단계에서 우리의 프로토콜 수 있습니다 일시 중지는 가장 신뢰할 수 있는 지점이입니다. 슬라이드는 RNA 무결성에 어떤 명백한 효과 없이 최대 4-5 h (분자 체)와 크 실 렌에 남아 있다. 우리는 시간 휴식은 필요한 경우에 그 때 한 번에 3 개의 슬라이드 준비, 모두 처리할 수 LCM와이 기간 내에서 발견 했다. 대체 옵션 밀폐 exicator16, 내 얼룩과 탈수 단계 후 슬라이드를만 지정 하는 것 이지만, 우리가 아직이 접근을 시도 하지 않은.
RNA 격리 절차, 가장 중요 한 또 다른 중요 한 단계는 아직 되 고 요인: RNA, RNA (작은 RNA 종의 손실) 없이17,18의 전체 스펙트럼을 유지의 최대한 가능한 수확량을 얻기와 샘플17에서 게놈 DNA는 완전히 제거합니다. 우리의 손에서 RNA 추출 키트 "B" 더 큰 수익률을 제공 하 고 더 효율적으로 게놈 DNA 제거 했다 우리의 예제와 함께 최상의 결과 제공 합니다. RNA 추출 시 약 수율 차이 관한 우리의 관측은 이전 보고서17,18일치. 그러나, 다른 RNA 추출 시 약19,20성공을 보고 많은 LCM 연구도 있다. 이전 보고서는 RNA 추출 열 기반 프로세스 제공 페 놀 기반 RNA 추출 방법18 보다 작은 RNA 분자의 더 나은 보존 작은 RNA 분자 RNA 강 수 동안에 상쾌한에 손실 될 수 있습니다 나타낼 수도 단계입니다.
우리가 관찰 guanidinium 안산 추가 β-mercaptoethanol을 사용 하는 RNA 세포의 용 해 버퍼 LCM 모자 (그림 5D)에서 모든 캡처된 중추를 제거에 매우 효과적 이다. 동안 대부분 LCM 프로토콜 vortexing는 lysate를 제안 하지 않습니다, 우리는이 우수한 결과 생산 하 고 RNA 저하 초래 하지 않습니다 발견 했다. 그것은 또한 모든 중추를 캡처 더 큰 가능성 RNA 추출 모자에서 발표 될 예정 이다 제공 한다. 일반적으로 얼마나 많은 중추는 특정된 슬라이드에 따라 장 조직의 1.8 ~ 18 ng/c m2 의 범위에서 장의 중추의 LCM에서 RNA 수율을 얻을 이러한 방법을 사용 하 여, 우리. 우리의 RNA-seq 절차 10 ng RNA의 최소 입력을 필요로 하지만 다른 절차는 훨씬 낮은 RNA 시퀀싱 처리 사전 증폭 사이클의 큰 숫자를 포함 하는 경우 입력을 가질 수 있습니다. 조직 준비 및 플래시 동결 과정에서 저장의 총 표면적은 40-60 cm2, cDNA 라이브러리 준비 및 낮은 입력 RNA-Seq 응용 프로그램에 대 한 충분 한 RNA를 제공 하.
우리의 절차는 전체 장의 중추의 컬렉션에 대 한 설계는, 접근 수정할 수 있습니다 쉽게 단일 뉴런 또는 명과의 수집에 대 한 경우5. 그러나, glial 밀도가 처리 하기 때문에 팔, glial RNA의 ensheath 신경 포함 됩니다 캡처된 뉴런의 RNA와 낮은 수에서 이기는 하지만. 이 신경 성적 낮은 복사 번호 표시를 식별 하려고 할 때 문제를 발생 시킵니다. 단일 셀 RNA-seq 이와 관련, 최고의 정밀도 및 탐지를 제공 하지만 장 조직에서 해리, 팬-신경 마커, 물 및 절연 cytometry21 을 또는 전체 창 자에서 발견 신경 필요 생물 정보학으로 접근을 정렬 후 dissociations입니다. 대부분의 분리 연구의 단점은 대부분 프로토콜 샘플 실 온 또는 transcriptome3변경 알려져 있다 오랜된 시간 동안 37 ° C에서 알을 품는 필요. 최근에, 감기-활성 효소 균 licheniformis 에서 마우스 조직에 대 한 단일 셀 정지의 생성에 대 한 사용 되었습니다 그리고 4 ° C22에서 인간의 조직의 분리에 대 한이 효소를 적용할 수 있습니다. 이러한 최적화를 수행할 때까지 신선한 냉동된 인간의 조직의 LCM 식 장의 신경 같은 말 초 신 경계 요소의 프로 파일링에 대 한 RNA를 캡처하는 강력한 수단 이다.
요약, 우리는 인간의 장 중추에서 RNA의 컬렉션에 대 한 안정적이 고 일관 된 프로토콜을 개발 했습니다. 우리는 인간의 창 자, 얼룩, LCM 프로세스, 조직과의 수많은 간행물 및 프로토콜에 따라 RNA 추출 준비를 최적화 했습니다. 우리는 또한 RNA-이 대 한 충분 한 RNA의 RNA 샘플 수집에이 방법의 신뢰성을 증명 하고있다 이 프로토콜 다양 한 위장 질환을 가진 환자에서 수집 하는 조직에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다 그리고 설치류 모델, 그로 인하여 새로운 치료제의 개발에 대 한 신뢰할 수 있는 전략을 제공 하는 사용 하기 위해 쉽게 적응 시킬 수 있다.

이 메서드는 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 인간의 창 자 조직에서 장의 중추의 높은-품질 RNA 샘플을 얻기 위해 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에 대 한 충분 한 RNA 품질 및 수율을 제공 하도록 최적화 된 하며 갓 절제, 고정, 플래시-냉동 인간 창 자 조직으로 사용 될 것입니다.
기능성 위장 하 고 본질적인 운동 성 장애는 미국에서 4 명 중 하나에 영향을 줍니다. 장 신 경계 (ENS), 두 번째 뇌1라고도 종종 이러한 장애의 중심에 직감 항상성 및 운동에 중요 한 역할. 창 자 운동 성의 조작 일반적으로 aganglionic/noncontractile 조직, 만성 식이 수정 및/또는 약물의 외과 절제술으로 제한 되었습니다. 놀랍게도, 성인 팔의 전체 transcriptome 시퀀싱 할 약물 타겟 줄기 세포 치료에 활용 될 수 있는 ENS 내의 분자를 식별 하는 우리의 기능을 크게 제한 남아 있습니다.
인간의 장 중추에서 RNA를 분리 하는 데 상대적으로 몇 가지 방법이 있다. 첫 번째 접근 방법, 셀 분리2, 필요 높은 부 화 온도 및 긴 보육 시간; 모두는 RNA 저하를 촉진 하 고 변경 transcriptome2,3으로 알려져 있습니다. 다른 접근 방법, LCM, 더 안정적으로 transcriptome를 유지 하 고 RNA 무결성 보호. 이러한 방법 중 가난한 RNA 품질 및 수량에 의해 방해 했다, 아주 노동 집약, 여러 연구는 사용 하지만 LCM 신선한-냉동 인간 창 자 조직4,,56에서 중추를 수집, 또는 얼룩 또는 RNA 추출 기술을 우리의 손에서 일의 필요한 수정. LCM 제품 설명서 제공 장의 중추8, 의 분리에 적용 될 때 추가 개선7,8, 하지만 적응 필요에서 발견 된 다른 LCM 프로토콜 RNA를 보존 하기 위한 9. 이러한 이유로 우리는 최적화 된 프로토콜을 기반으로 이러한 리소스에는 인간의 장 중추에서 상당한 양의 높은 무결성 RNA 생성, 상대적으로 빠른 워크플로우, 그리고 대형에 걸쳐 일관 된 결과 생성을 개발 샘플의 수입니다.
이 연구에서 우리는 절제 인간의 창 자 조직에서 공급 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA의 분리를 용이 하 게 하는 최적화 된 절차의 개요를 제시. 우리의 방법 5 가지 중요 한 측면을 통합합니다. 첫째, 갓 절제, 고정 되지 않은 인간의 장 샘플 크기, 모든 과잉 습기 실험실 티슈로 제거 하 고 2-methylbutane (2 MB)과 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 플래시-냉동 하기 전에 큰 기본 몰드에 평평 하 게 손질 한다. 내장의 두 번째, 더 섹션 장의 중추의 큰 페이로드를 제공 하는 슬라이드에 myenteric 총의 전체 평면을 얻기 위해 준비 되어야 한다. 성공이 단계는 조직 준비 과정에 크게 의존 합니다. 셋째, 중추는 존재에의 비균일 구조 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 막 슬라이드6, LCM 과정에서 최고의 속도 정밀도 제공 하는 사용을 해야 합니다. Cresyl 바이올렛 등 4, 에탄올 호환 염료 장의 중추 얼룩 동안 RNA 무결성을 유지 하기 위해 사용 되어야 한다. 마지막으로, RNA 추출 과정은 RNA-시퀀스와 성공적인 결과 위해 중요 한 우리는 높은 RNA 무결성, 장 신경의 작은 컬렉션을 시작할 때 RNA 수율을 극대화, DNA 오염 제거 하 고 가능한 많은 RNA 종 유지 RNA 추출 방법을 모색.
함께 찍은, 현재 연구에서 이러한 요소의 최적화 크게 가속 워크플로 및 장의 중추 뛰어난 RNA 수량 및 품질의 샘플을 생성. 결과이 접근의 일관성을 나타내는 샘플의 상당한 그룹 간에 크게 일관 되었습니다. 또한, 이러한 접근 수십 장의 중추에서 RNA 샘플을 성공적으로 시퀀싱을 사용 했습니다. 여기에서 강조 하는 전략 수행 원하는 중추의 LCM 또는 주변 장치 및 중앙 신 경계와 높은-품질 RNA의 절연이 필요한 다른 경우의 핵에 대 한 광범위 하 게 적응 수 있습니다 또한.

<table><tbody><tr><td>10% Neutral-buffered formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Fisher</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>3-mL syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>50-mL conical tubes, polypropylene&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>Base molds 37x24x5mm, disposable</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>5025511</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW&amp;nbsp; Cold Storage Solution</td><td>Bridge to Life</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM caps</td><td>Arcturus, ThermoFisher</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>Cling Wrap, Press&amp;rsquo;n Seal&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Glad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>N.A.&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Acros Organics</td><td>AC405760025</td><td></td></tr><tr><td>Cutting Board</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63308</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 190-proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200-proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Glass Microscope slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Gloves, extended cuff</td><td>Microflex&amp;nbsp;</td><td>19010144</td><td></td></tr><tr><td>Gowns, surgical-disposable</td><td>Kimberly-Clark&amp;nbsp;</td><td>19-088-2116</td><td></td></tr><tr><td>Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>1335920B</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (large)</td><td>Kimberly-Clark&amp;nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (small)</td><td>Kimberly-Clark&amp;nbsp;</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)</td><td>ThermoFisher</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Leica Cryostat Chuck, large,&amp;nbsp; 40 mm&amp;nbsp;</td><td>Southeast Pathology Instrument Service</td><td>N.A.&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Microscope objective (20X)</td><td>Olympus UPlanFl 20X/0.50, &amp;infin;/0.17</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Microscope objective (10X)</td><td>Olympus UPlanFl 10X/0.25, &amp;infin;/-</td><td>N.A.&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Sieves</td><td>Acros Organics</td><td>AC197255000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA extraction kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Pestle</td><td>Kimble Kontes</td><td>4621973</td><td></td></tr><tr><td>PEN membrane LCM slides</td><td>Arcturus, ThermoFisher</td><td>LCM022</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free tubes, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Sigma-R2020</td><td></td></tr><tr><td>RNA Extraction Kit &quot;A&quot; (PicoPure)</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Extraction Kit &quot;B&quot; (RNeasy&amp;nbsp; Micro kit)</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNA Extraction Method &quot;C&quot; (TRIzol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNA Extraction Kit &quot;D&quot; (RNeasy PLUS Mini kit)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Splash Shield, disposable faceshield</td><td>Fisher</td><td>17-310</td><td></td></tr><tr><td>Scissors, Surgical, 14.5 cm &quot;sharp-sharp&quot;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, cellulose acetate (0.2 &amp;mu;m)</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium</td><td>General Data Healthcare</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue

이 방법의 목적은 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여에서 수집 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 5 단계 워크플로에서 RNA-이 대 한 충분히 높은 품질과 수량 장의 중추에서 RNA 분리를 얻기위한 중요 한를 확인 했습니다. 첫째, 준비할 때 장 조직, 각 샘플 아래쪽 큰 기본 금형의 가능한 serosa 병합 전에 blotting에 의해 제거 하는 모든 초과 액체를가지고 있어야 합니다. 다음 샘플 2 methylbutane 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 신속 하 게 고정 됩니다. 둘째, 조직 단면, 그것 장 섹션 슬라이드 당 장 신경의 가장 큰 표면 영역을 양보 함으로써 myenteric 총의 전체 평면 병렬 cryomolds 위치에 중요 하다. LCM, 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 중 세 번째-최고의 속도 장의 중추를 수집 하는 때 장 중추의 비균일 도형의 윤곽에 유연성을 제공 하는 막 슬라이드. 넷째, 섹션 내 장 신경의 고유한 시각화를 위한 Cresyl 바이올렛 같은 에탄올 호환 염료 수성 염료를 기준으로 RNA 무결성의 우수한 보존을 제공합니다. 마지막으로, 캡처된 중추에서 RNA 추출, 우리는 DNA 오염을 제거 하는 동안 우수한 RNA 수량 나왔고 상업적인 RNA 추출 키트와 품질, 차이점 관찰. 현재 프로토콜에서 이러한 요소의 최적화 크게 워크플로우를 가속화 하 고 뛰어난 RNA 품질 및 수량 장의 중추 샘플을 생성 합니다.

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Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

이 프로토콜의 목표에서 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 격리 장 중추에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 이 프로토콜 포함 플래시-냉동 인간 창 자 조직, cryosectioning, ethanolic 얼룩 및 탈수, LCM, 샘플 준비 및 RNA 추출.

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

optimization-laser-capture-microdissection-for-isolation-enteric

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K 조회수.  Vanderbilt University Medical Center. 이 프로토콜의 목표에서 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 격리 장 중추에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 이 프로토콜 포함 플래시-냉동 인간 창 자 조직, cryosectioning, ethanolic 얼룩 및 탈수, LCM, 샘플 준비 및 RNA 추출.

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

연구

신경과학

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

의학

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell populations. To characterize proteome-level variation and tumor heterogeneity at scale, high-throughput methods are needed to selectively isolate discrete cellular populations in solid tumor malignancies. This protocol describes a high-throughput workflow, enabled by artificial intelligence (AI), that segments images of hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained, thin tissue sections into pathology-confirmed regions of interest for selective harvest of histology-resolved cell populations using laser microdissection (LMD). This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of regions denoting cell populations of interest, annotated using digital image software, directly to laser microscopes, thus enabling more facile collections. Successful implementation of this workflow was performed, demonstrating the utility of this harmonized method to selectively harvest tumor cell populations from the TME for quantitative, multiplexed proteomic analysis by high-resolution mass spectrometry. This strategy fully integrates with routine histopathology review, leveraging digital image analysis to support enrichment of cellular populations of interest and is fully generalizable, enabling harmonized harvests of cell populations from the TME for multiomic analyses.

This protocol describes a high-throughput workflow for artificial intelligence-driven segmentation of pathology-confirmed regions of interest from stained, thin tissue section images for enrichment of histology-resolved cell populations using laser microdissection. This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of demarcations denoting cell populations of interest directly to laser microscopes.

종양 미세환경의 미세스케일 프로테오믹 분석을 위한 산업화된 인공 지능 유도 레이저 미세 해부

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

암 연구학

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

발생학

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into sympathetic and parasympathetic branches. Normally, there is a balance between these two branches to maintain homeostasis. However, cardiac disease states such as myocardial infarction, heart failure, and hypertension can induce the remodeling of cells involved in cardiac innervation, which is associated with an adverse clinical outcome.
Although there are vast amounts of data for the histological structure and function of the cardiac autonomic nervous system, its molecular biological architecture in health and disease is still enigmatic in many aspects. Novel technologies such as single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) hold promise for the genetic characterization of tissues at single-cell resolution. However, the relatively large size of neurons may impede the standardized use of these techniques. Here, this protocol exploits droplet-based single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq), a method to characterize the biological architecture of cardiac sympathetic neurons in health and disease. A stepwise approach is demonstrated to perform snRNA-seq of the bilateral superior cervical (SCG) and stellate ganglia (StG) dissected from adult mice.
This method enables long-term sample preservation, maintaining an adequate RNA quality when samples from multiple individuals/experiments cannot be collected all at once within a short period of time. Barcoding the nuclei with hashtag oligos (HTOs) enables demultiplexing and the trace-back of distinct ganglionic samples post sequencing. Subsequent analyses revealed successful nuclei capture of neuronal, satellite glial, and endothelial cells of the sympathetic ganglia, as validated by snRNA-seq. In summary, this protocol provides a stepwise approach for snRNA-seq of sympathetic extrinsic cardiac ganglia, a method that has the potential for broader application in studies of the innervation of other organs and tissues.

This protocol describes the detailed, low-input sample preparation for single-nucleus sequencing, including the dissection of mouse superior cervical and stellate ganglia, cell dissociation, cryopreservation, nucleus isolation, and hashtag barcoding.

단일 핵 RNA 시퀀싱을 위한 마우스 교감신경 신경절의 바코드된 항체를 사용한 저입력 핵 분리 및 멀티플렉싱

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

생물학

Laser Microdissection: A Technique to Isolate Invading Colorectal Cancer cells from a 3D Organotypic Culture Model

Source: Bullock M. et al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/51475"> Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and&#160;Ex vivo&#160;Fibroblasts.</a> J. Vis. Exp. (2014).
The video describes the laser dissection of the 3D organotypic co-culture model with micron-level precision. In 3D organotypic models, stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimensionally co-cultured with cancer epithelial cells. The 3D model serves as an experimental tool that enables invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

레이저 미세해부: 3D 유기형 배양 모델에서 침입하는 대장암 세포를 분리하는 기술

Source: Bullock M. et al.,  Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and&#160;Ex ...