저자는 인정 (JLM)에 R37 DK045729, R01 AR060837 (HX)를 미시간 위장 연구 센터 분자 코어 P30 DK034933의 대학에서 지원 하고자 합니다.

설명 하는 모든 동물 실험 동물의 관리 및 사용에 미시간 대학 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 멸 균 폴 리-D-리 (PDL)와 Laminin 솔루션의 준비
<ol><li>셀 격리 전에 적어도 1 일 폴 리-D-리 (PDL)와 laminin 코팅 접시를 준비 합니다. 참고: 6-잘, 12-잘 접시 실험 목표에 따라 준비 되었다. 일반적으로 12-잘 접시 서쪽 오 점;를 사용 하 여 정량 분석을 위해 사용 했다 반면, 6 잘 플레이트 immunohistochemistry 위해 압력가 마로 소독 (살 균) coverslips를 사용 했다. 24-잘 접시 EGCs 캘리포니아2 + 에 대 한 문화를 사용한 영상 유출.</li>
	<li>재고 솔루션 DNase 무료 고 공기 HEPA 필터와 후드를 조직 문화에서 RNase 무료 물 초순 조직 문화 등급을 희석.</li>
	<li>
살 균 유리 coverslips
	<ol>
<li>소독 집게와는 coverslip를 누른 coverslips 15 분 조직 문화 후드에 증발 하 고 6 잘 플레이트에 장소를 허용 에탄올에 대 한 100% 에탄올의 비 커에 담가.</li>
		<li>또는 개별적으로 2mm 두께 압 종이 플라스틱 용기 그리고 압력솥에 여러 coverslips를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 코팅 판
참고: 메 마른 조직 문화 층 류 두건 아래이 단계를 수행 합니다.
<ol><li>1 mg/mL PDL 재고를 해 동 하 고 최종 농도 100 µ g/mL를 무 균, 조직 문화 학년 물 1시 10분 희석. 6 잘 플레이트, 12-잘 접시의 한 잘 커버를 1 mL 및 24-잘 접시에서 한 잘 0.5 mL 코트 잘 당 2 mL를 사용 합니다. -20 ° c.에 12 mL aliquots에 나머지 희석된 PDL를 저장</li>
	<li>적어도 1 시간에 대 한 웰 스 코트 PDL 허용 후 살 균 피 펫으로 PDL을 제거 합니다. 공기 접시 조직 문화 층 류 두건 아래 완전히 건조 허용 합니다. 참고: 제거한 후 살 균 피 펫으로 PDL 솔루션, 그것은 수 두 번 사용 1 주일 이내 더 0.22 μ m 필터를 통과 하 고 4 ° c.에 저장 후</li>
	<li>Laminin 재고 젤 형성을 피하기 위해 얼음에 녹여 참고: Undiluted laminin이 된다 8 ° c.의 위 예 열 때 고체</li>
	<li>Laminin 주식 (0.5 mg/mL) 1: 50으로 살 균 Dulbecco 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 10 µ g/mL의 최종 농도를 희석. -20 ° c.에 12 mL aliquots에 희석된 laminin를 저장</li>
	<li>포함 하는 웰 스에 희석된 laminin 건조 PDL 추가 합니다. 6 잘 표면 및 12-잘 접시의 바닥을 커버 0.5 mL을 1 mL을 사용 합니다. Coverslips, 400 µ L 희석된 laminin의 표면 범위를 달성 하기 위해 coverslips를 추가 합니다.</li>
	<li>접시 같은 날 (빠른 코팅) 사용 하는 경우 2 시간, 37 ° C에서 코팅된 접시를 품 어. 아니라면, 번호판, 플라스틱 포장으로 밀봉 하 고 하룻밤 4 ° C (느린 코팅)에서 저장 합니다. 참고: 씰링은 건조 및 오염 방지 하기 위해 중요 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 표면 긁힘 방지를 피펫으로 laminin 솔루션을 제거 합니다. 부드럽게 세척 살 균 DPBS와 세 번 웰 스.</li>
	<li>각 완전 한 폐해 성장 미디어 고 37 ° C에서 번호판 EGC 정지를 추가할 준비가 될 때까지 유지 추가 합니다. 참고: 폴 리 D lysine과 laminin 코팅 접시 4 ° c.에 3 일 동안 저장 될 수 있다 코트 판 몇 일 앞두고 4 ° C에서 저장, 세척 살 균 DPBS와 번호판 세 번. 최종 세척 후 각 잘 하 메 마른 DPBS 2 mL를 추가 합니다. Parafilm와 4 ° c.에 게 접시를 봉인 그것은 laminin를 건조 하지 않습니다 보장 하기 위해 필수적 이다.</li>
</ol>3입니다. 격리 솔루션의 준비
<ol><li>EDTA/HEPES/DPBS 분리 솔루션을 준비 합니다. 솔루션의 500 ml (칼슘, 마그네슘) 없이 메 마른 DPBS 10 mM HEPES 및 5 mM EDTA의 최종 솔루션을 사용 합니다. DPBS의 490 ml 1 M HEPES 버퍼의 5 mL 및 0.5 M EDTA 재고 솔루션의 5 mL를 추가 합니다. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>표 1에 나열 된 시 약을 사용 하 여 glial 세포 물의 resuspension 미디어를 준비 합니다.</li>
	<li>표 2에 나열 된 시 약을 사용 하 여 폐해 성장 미디어를 준비 합니다. 참고: 폐해 성장 미디어 GDNF를 포함 하는 4 ° c.에 1 주 동안 저장 될 수 있다</li>
</ol>4입니다. 장 세그먼트의 제거
참고: 마우스 isoflurane 드롭 메서드는 중요 한 장기의 제거에 의해 식품 및 euthanization 이전 물이 허용 되었다. C57BL/6 쥐 나이의 8 주 이상 사용 되었다. 두 남녀는 준비에 눈에 띄는 차이 없이 사용 되었다.
<ol><li>Isoflurane의 과다와 함께 마우스를 안락사 하 고 배치 해 트레이에 부정사. 사지를 고정 하 고 70% 에탄올과 복 부를 소독. 집게와 피부 천막 한 다음가 위로 복 부를 엽니다.</li>
	<li>간 들어올리고 원심 위/pylorus 식별 합니다. 7cm 근 내장의 제거. 수 소장을 찢 어 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>
mesentery를 멀리 자르는 동안는 pylorus 집게로 잡으십시오.
	<ol>
<li>긁어 멀리 부착 췌는 시저의 뒤를 가진 무뚝뚝한 해 부를 사용 합니다.</li>
		<li>캘리포니아2 + 또는 Mg2 + (그림 1A) 없이 얼음 처럼 차가운 DPBS로 장 세그먼트를 놓습니다. 참고: 다른 세그먼트의 창 자 또는 결 장 또한 제거할 수 있습니다 동일한 기술을 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사용 5 또는 10 mL 주사기를 얼음으로 지저분한 내용을 플러시 무뚝뚝한 끝 20 G 바늘에 연결 된 차가운 DPBS (그림 1B).</li>
	<li>3 cm 세그먼트 처음 스미스 그 외 여러분 에 의해 설명 된 기술을 사용 하 여 경도 근육을 제거 하 내장을 나눕니다 12 Sundaresan 그 외 여러분 에서 수정 하 고 10. 참고: 최대 2 개의 마우스에서 장 세그먼트 HEPES/EDTA/DPBS 격리 솔루션의 30 mL 당 사용 됩니다.</li>
	<li>면 끝에서 나무 막대기를 별도로 약 4 cm를 끊다. DPBS (그림 1C)에 나무 막대기를 담근 다.</li>
	<li>부드럽게 젖은 스틱 (그림 2A-C)에 장 세그먼트 중 하나이 구 요.</li>
	<li>부착 mesentery 아직도 바늘 코 집게 (그림 2D)를 사용 하 여 연결을 제거 합니다.</li>
	<li>
깨끗 한 면도날을 사용 하 여 또는 두 세로 닉스는 mesentery가 내장 따라 있도록 메스 연결 (그림 2E).
	<ol>
<li>젖은 DPBS 면 끝. 경도 근육/myenteric 총 (LMMP)를 풀고 근육을 따라 경도 침수 면 팁을 문질러. 그런 다음 이동 면 팁을 가로로 LMMP 제거 하는 동안 멀리 장 세그먼트의 길이 따라 원형 근육에서 LMMP를 애타게.</li>
		<li>중간 및 네 번째 손가락 (그림 2F) 세그먼트를 안정화 하면서 엄지손가락과 집게손가락 사이 막대기의 끝을 잡으십시오. 완료 되 면는 LMMP 장 세그먼트에서 쉽게 껍질 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>삭제는 LMMP 장 튜브에서 제거 하 고 myenteric 총에서 EGCs를 수확 하지 않으면 면봉에 연결 된 원하는.</li>
	<li>나무 막대기에서 제거 하는 경도 장 세그먼트 오픈 혹 평에 면도날을 사용 합니다.</li>
	<li>얼음에 DPBS 박탈된 장 조직 (주로 점 막과 submucosa 플러스 원형 근육)을 저장 합니다. 모든 장 세그먼트 준비가 될 때까지 단계 4.4-4.11을 반복 합니다.</li>
</ol>5입니다. 상피 점 막의 제거
<ol><li>좋은 위 창 자 ~0.5 cm의 작은 조각으로 잘라.</li>
	<li>장소 살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 30 mL의 얼음 처럼 차가운 EDTA/HEPES/DPBS 솔루션을 포함 하는 조직.</li>
	<li>10 분 ~ 60 분 당 젖 힌 채에 4 ° C에서 포함 하는 조직 솔루션을 바위.</li>
	<li>미리 한 번 위아래로 EDTA/HEPES/DPBS 버퍼를 pipetting으로 5 mL 플라스틱 피 펫을 축 축 하 게 하 고 다음 조직 플라스틱 버퍼 정지 (분쇄) 위아래로 20 번을 미리 moistened 피 펫을 사용 하 여 상피 점 막 꺼내 려.</li>
	<li>100 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 혼합물을 붓는 하 여 EDTA 외피에서 조직을 수집 합니다. 폐기는 혼 탁 한 점액 가득한 자형 (그림 3).</li>
	<li>얼음의 30 mL를 포함 하는 새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에는 스 트레이너에서 유지 조직 장소 차가운 EDTA/HEPES/DPBS 바늘 코 집게를 사용 하 여.</li>
	<li>락을 10 분 ~ 60 젖 힌 채를 추가 상피 점 막에서 분 당에서 4 ° C에서 조직 하 여 EDTA/HEPES/DPBS 외피를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>미리 해당 버퍼와 함께 5 mL 피 펫을 축 축 하 게 하 고 점 막 세포를 꺼내 려 20 번 위아래로 조직 정지 플라스틱. 참고: 조직 상피의 제거 이다 피펫으로 내부에 집착 하는 경향이 됩니다.</li>
	<li>100 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 혼합물을 붓는 의해 두 번째 부 화 후 조직을 수집 하 고 삭제를 통해 흐름. 두 번째 흐름 통해 첫 번째 (그림 3) 보다 눈에 띄게 덜 혼 탁 한 이어야 한다.</li>
	<li>반복 때까지 솔루션은 거의 10 분 EDTA 외피 취소 (조직의 양과 분쇄의 효과 따라 약 3-4 외피) (그림 3).</li>
</ol>6. 고 Lamina Propria Submucosa에서 장의 Glial 세포의 수집
<ol><li>15 mL 원뿔 원심 분리기 관 상용 셀 복구 솔루션 및 4 ° c.에 25-30 분 동안 바위의 5 mL를 포함 하는 조직 나일론 여과기에서 전송</li>
	<li>
Lamina propria에서 장의 glial 세포 분열을 부드럽게 10 x triturate
	<ol>
<li>깨끗 한 50 mL 튜브에서 filtrate 수집 및 40 µ m 필터를 통해 필터링 합니다.</li>
		<li>조직 DPBS의 1 mL와 함께 나일론 필터에 린스.</li>
		<li>조직의 삭제 하 고 전송 ~ 5-6 깨끗 한 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 여과 액의 mL.</li>
		<li>2000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안 스윙 양동이 원심 분리기에서 여과 액을 스핀</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 일시 중단 glial 세포 포함 된 펠 릿 1 mL 이상 물의 resuspension 버퍼에에서 부드럽게 500 µ L 피 펫 팁 위쪽 및 아래쪽 펠 릿 pipetting으로. 거품을 소개 하지 마십시오. 참고: 우물과 번호판의 수에 대 한 필요에 따라 물의 resuspension 볼륨을 조정 합니다. 예를 들어 1.2 mL 한 6-잘 접시; 2.4 mL 두 6 잘 플레이트; 2.4 mL 1 12-잘 접시입니다.</li>
	<li>폐해 성장 매체를 포함 하는 12-잘 코팅 PDL laminin 번호판에 대 한 6-잘 또는 100 µ L의 각 음에 세포 현 탁 액의 200 µ L 플라스틱.</li>
	<li>접시에 셀을 추가 하 고 준수 하는 셀의 최대 수 있도록 37 ° C 배양 기에서 배치 후 요리를 방해 하지 마십시오. 참고: 셀의 건강 준비 6-8 h 이내 첨부 것입니다 하지만 부드럽게 비 부착 한 세포와 함께 미디어를 pipetting으로 미디어를 변경 하기 전에 적어도 24 시간 기다립니다.</li>
	<li>3-4 일 후에 그들은 문화 (그림 4)에 배치 된 실험에 대 한 셀을 사용 합니다. 특정 단백질 마커 (표 3)에 대 한 관심의 항 체를 사용 하 여 immunofluorescent 분석을 수행 합니다. 예를 들어, GFAP, S100b 및 Sox10 p75NTR 여기 사용 되었다. E cadherin 또는 알파 부드러운 근육 말라 항 체는 다른 세포 유형에서 오염 정도 평가 하기 위해 사용 되었다.</li>
</ol>7. immunofluorescent 얼룩
<ol><li>문화에서 미디어를 발음 하 고 PBS로 두번 씻어.</li>
	<li>4 %paraformaldehyde 실 온에서 20 분에 대 한 문화를 수정.</li>
	<li>정착 액을 제거 하 고 PBS로 3 회를 씻어.</li>
	<li>0.2%를 포함 하는 PBS를 가진 세포를 permeabilize 실 온에서 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>반대로 닭 IgY, 반대로 토끼 또는 실 온에서 2 h에 대 한 반대로 마우스 IgG의 구성 차단 솔루션 permeabilized 셀을 품 어.</li>
	<li>
셀 주 항 체 하룻밤, 예를 들어, GFAP (1:1, 000)을 품 어.
	<ol>
<li>3 회 PBS로 세포를 씻어. 만약 colocalization 수행 단계 7.7로 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실내 온도에 적어도 2 시간에 대 한 기본 항 체의 다음 세트를 품 어 하지만 선호 4 ° c.에서 하룻밤 토끼 반-S100 1:1000 희석 또는 마우스 안티-p75NTR의 1: 500 희석 사용 합니다. 참고: 모든 항 체는 PBS에 희석.</li>
	<li>3 회 1 차 항 체를 제거 하는 PBS 가진 세포를 씻어. 그런 다음 적절 한 붙일 태그 2 차 항 체 (표 3) 실 온에서 2 h와 함께 씻어 서 세포를 품 어.</li>
	<li>2 차 항 체를 제거 하는 PBS로 3 번 씻어.</li>
	<li>DAPI와 설치 미디어의 1-2 방울을 사용 하 여 슬라이드에 coverslips를 탑재 하 고 형광 현미경으로 세포를 봅니다.</li>
</ol>8. Cytometry
<ol><li>한번 DPBS 셀을 rinsing 하 여 cytometry에 대 한 부착 glial 세포를 제거 하 고 제조 업체의 프로토콜 당 0.25% trypsin EDTA를 추가. 완전 한 glial 세포 성장 매체에 셀을 수집 하 여 3 분 종료 소화에 대 한 37 ° C에서 트립 신-EDTA 용액에 세포를 품 어.</li>
	<li>5 분에 대 한 400 x g 에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 다시 PBS에 셀을 일시 중단.</li>
	<li>10 분 동안 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 하 고 permeabilize 0.2% 트라이 톤 X-100 PBS에 단계 7.4에 설명 된 대로.</li>
	<li>1 %BSA 20 분, 예를 들어, 당나귀 안티 닭 IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) 또는 당나귀 안티 염소 IgG (H + L) (1:1, 000)에 대 한 조직의 특정 면역 글로불린을 포함 하는 PBS를 가진 세포를 차단 합니다.</li>
	<li>셀 주 항 체 GFAP (1:2, 000), 품 어 E-cadherin (1:400), α-부드러운 근육 걸 (1: 500), 또는 Pgp9.5 (1: 500) 4 ° c.에서 하룻밤</li>
	<li>
PBS 가진 항 체를 씻어.
	<ol>
<li>붙일 태그가 이차 항 체 30 분 동안 실 온에서 incubated와 항 원-항 체 복합물을 품 어.</li>
		<li>이차 항 체와 incubated 셀의 별도 약 수를 사용 하 여 isotype 컨트롤 역할을. 셀의 두 인구 씻어 고 cytometry 이전 PBS에 resuspended.</li>
		<li>라이브 셀에 게이팅 하 여 교류 cytometer 세포의 2 개의 인구를 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9.는 hGFAP에서 마우스 조직 준비-Cre:tdTomato 쥐
참고: Lox-정지-Lox-tdTomato cDNA로 사 로커 스22,23 (잭슨 실험실, #007914)에서 표현 하 고 생 형광 Cre recombinase (hGFAP-Cre)를 표현 하는 마우스를 사육 하는 때를 생성 합니다. 현장에서 분석 언된 조직 단면도 생성 하 여 수행 됩니다.
<ol><li>1 시간에 대 한 4 %paraformaldehyde 장 조직 수정 하 고 하룻밤 PBS에서 1 M 자당에서 탈수.</li>
	<li>상업적으로 최적의 절단 조직 (10 월) 복합 구성 10% 폴 리 비닐 알콜의 구입에서 조직 포함 및 4.2% 폴 리 에틸렌 글리콜, 및 다음 액체 질소에서 동결.</li>
	<li>5 µ m cryosections를 준비 하 고 DAPI 미디어를 장착 한 antifade를 사용 하 여 탑재.</li>
	<li>hGFAP에서 EGCs cytometry에 대 한 준비-Cre:tdTomato+ 마우스 4.1-6.5 단계에 설명 된 대로.</li>
	<li>3 일 후에 단계 8.1에서 문화 접시에서 셀 trypsinize 하 고 4 %paraformaldehyde 10 분 수정.</li>
	<li>세포는 hGFAP에서 분리 하는 세포와 병렬로 Cre 부정 쥐에서 분리 분석-교류 cytometer에 Cre:tdTomato+ 쥐. 참고: 빌 게이츠는 죽은 세포와 파편을 피하기 위해 건설 되었다.</li>
</ol>10. 캘리포니아2 + 영상 유출
<ol><li>3 µ M와 24-잘 접시에 도금 EGCs를 품 어 Fluo-4-오전 30 분 동안 37 ° C에서.</li>
	<li>이미지 회전 디스크 confocal 현미경 및 480의 여기 파장을 사용 하 여 상업적으로 구입한 Tyrode의 솔루션에서 Ca2 + 신호 CCK 또는 gastrin 펩 티 드를 추가한 후 (F480) nm. 이미지 분석이 알려졌다 Sundaresan 외. 10 .</li>
</ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+keeps+enteric+glial+cells+on+the+move;+prospective+roles+of+the+gut+epithelium+and+immune+system.">The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system.</a> Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).</li><li>Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. 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저자는 공개 없다.

EGCs 직감 항상성에 중요 한 역할 그리고 분리 하 고 그들 에 체 외연구 필수적 이다. 이 프로토콜에서 성인 마우스 내장의 lamina propria에서 EGCs를 격리 하기 위한 간단한 방법 장 폐해 기능을 공부 도입 되었다.
면봉으로 부착 mesentery와 LMMP를 제거 경도 원형 근육 사이 있는 간 myenteric 명과의 일부를 제거, 버퍼 submucosal 표면에의 접근성 증가 하 고 많은 큰 모세 혈관을 제거 하는 것은 . 후자는 최종 문화를 오염 혈액 세포의 수를 줄입니다. EDTA 외피의 시리즈 스트립 거리 노출 lamina propria 및 submucosal 명과 수 있는 연약한 chelating 솔루션에 노출 후 상피 점 막. 동요 동요, vortexing 또는 분쇄 (pipetting 위아래로 반복) 하 여 신중 하 게 수행 하 고 셀에 과도 한 손상을 피하기 위해 초과 해야 합니다. 부착, 가능한 glial 세포의 더 일관 된 수익률 귀착되는 기술 때문에 분쇄는 여기 사용 되었다. 흔들어 거품을 소개 하 고 코팅된 판에 세포 부착에 의해 형태학 상으로 평가 하는 세포 생존 능력을 줄일 수 있었습니다. 조직을 조각으로 잘라 해야 합니다 < 5 mL 피 펫과 조직을 효과적으로 triturate을 0.5 c m.
일반적으로, 적어도 3 쥐에서 7 cm 세그먼트는 약 20-30%에서 한 6 잘 플레이트를 충당 하기 위해 충분 한 EGCs를 생성 하기 위해 충분 한 confluency, immunocytochemistry 및 정량에 사용할 수 있습니다. 그러나, 더 많은 세포는 공부 하는 유전자의 표현 수준에 따라 서양 오 점 같은 생 화 확 적인 방법에 필요한 수 있습니다. 있지만, 궁극적으로 다른 세포 유형으로 EGC 문화의 오염 증가 상피 세포 인구의 큰 준수 관찰 되었다 1 콜라겐 입력 또는 Matrigel 짧게 폴 리-D-리/Laminin 기판에 안으로 시험 되었다, . 또한, 1 형 콜라겐 접시에 확고 하 게 고착 하지 않았다 고 쉽게 미디어를 변경할 때 표면에서 제거 했다. Fibronectin은 다른 기판 사용된24되었습니다 하지만 여기 테스트 했다. Laminin 분명히 바인딩을 강화 하 고 신경 크레스트의 파생 셀25. 그러나, 많은 laminin의 변화할 수 있다, 영향을 미치는 세포 부착 및 수익률. 문화의 미생물 오염 시간의 약 5% 발생 하 고 살 균 약, 기술 및 항생제의 사용에 의해 최소한으로 유지 했다. 항진균 약의 사용은 선택 사항.
여기 프로토콜의 주요 한계는 기본 EGCs를 손상 하지 않고 상피를 제거 하는 동요의 표준화 이다. 또한, 코팅 판 셀 준수에 달려 있기 때문에 즉시 준비의 평가 만들 수 없습니다. 문제 해결에 초점을 세 가지 영역: 1)의 신선한 PDL laminin 접시; 코트 사용 2) 도우미;의 수를 증가 하 여 EDTA 외피를 시작 하는 해 부에서 시간을 최소화 3) 계량 시간과 선동 조직 상피 그리고는 EGCs를 효과적으로 제거 하는 데 사용 하는 방법. 이러한 단계 중 하나에 시간을 확장 EGC 취약성과 가능성을 그들은 성장 매체에 도금 할 때 복구 하지 것입니다 증가 합니다. 상피 해리를 분쇄 메서드는 여기 사용 되었다, 비록 떨고와 vortexing 또한 시험 되었다 일관성 없는 결과 아마도 때문에 의존 하 고 계량 하기가 더 연산자. 도금 부착 세포의 수확량 더 셀은 16-24 h에 대 한 방해 하지 했다.
여기에 제시 하는 방법 스미스 그 외 여러분 에 의해 원래 연구 수정 되었습니다. 12, 분리는 LMMP에 초점. 스미스 접근만 제거 하 고는 LMMP 절연 glial 세포의 대부분 submucosa 및 lamina propria에서 발생 한 것을 버리고 여기 사용 되었다. 또한, 효소 소화 하지 않고 myenteric EGCs 되지 않습니다 쉽게 해방된12. 그럼에도 불구 하 고, submucosal 명과 대 myenteric에 대 한 특정 마커 없습니다 있기 때문에, 인터-myenteric 총에서 glial 세포의 존재를 제외할 수 없습니다. 로젠바움 외. 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) hGFAP 발기인에서 표현 하는 EGCs의 흐름 cytometric 분석 보고. 그들은 아주 어린 쥐 (출생 후 7 일)을 사용 하 고 효소 소화19EGCs 전체 창 자에서 분리. 또한, 흐름 cytometric 분석 했다 부동성 neurosphere 형성을 추진 하는 조건을 유지의 2 주 후 수행 됩니다. 저자는 neurospheres를 매우 GFAP와 S100b 표현 보고, 부동 셀 집계는 또한 강력 하 게 α-SMA, myofibroblast 세포 인구의 확장 격려 반면 gliosphere 개발 제안 표현 플랫 시트 같은 형태학에 여기에서 설명합니다. 따라서, 재미, 하는 동안 연구 직접이 프로토콜 비교있지 않습니다. 대조적으로, 세포의 형태에서 훨씬 적은 α와 결합 하 여-SMA + 셀이이 프로토콜에서 설명 하는 EGCs 3-5 일간 문화 기간 동안 3 차원 형태를 전시 하지 않는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구 하 고, 프로토콜 여기와 로젠바움 메서드 사용 하 여 형광 기자 식별 하 고 격리 GFAP + 셀 셀 프로 파일링 살고 할 수 사관의 능력을 향상 시킬 것입니다.
결론적으로, 현재 프로토콜 submucosa 비 효소 방식을 사용 하 여에서 장의 glial 세포의 격리를 설명 합니다. 전체 프로토콜 사전 코팅된 조직 문화 접시에 약 3 h 초기 도금을 마우스 해 부에서 걸립니다. 가장 시간 집중적인 단계 프로토콜입니다 제거 및 내장의 첫 번째 EDTA 보육에 대 한 준비. 접시를 준비 하 고 DPBS 저장이 좋습니다. 준비의 성공은 기본 EGCs를 손상 하지 않고 상피의 효율적인 제거에 의존 하 고 24 h. 기본 EGCs 이내 PDL/Laminin 코팅 판에 부착은 생 화 확 적인 분석 등 생체 외에서 연구 하는 데 유용 캘리포니아2 + 용 고 adenoviral transfections10. EGCs는 submucosa 또는 LMMP에서 분리 하는 기능 EGC 성장 속성, 차별화 및 형태학 전체 게놈 접근을 사용 하 여 차이 정의 하기 위해 추가 연구가 허용 것으로 예상 된다.

장의 glial 세포 (EGCs)의 기능에 대 한 관심 용기 무결성 및 항상성1,2에 그들의 인식된 역할 때문에 꾸준히 증가 했다. 또한, EGCs GI로3,4의 길이 따라 위치에 따라 다릅니다. EGCs glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF) 등 다양 한 영양 요인 해제, 운동1,5 를 직감 하 고 미생물 부산물6,7에 응답을. 연구는 EGC 인구는 이기종 및 그들의 기능 여부 submucosal 또는 myenteric 총1,7내 따라 나타내 었 다. 예를 들어 내는 submucosa EGCs 꽉 접속점8에 기여 한다. 차동 GFAP 표현과 EGCs 인 산화가 장애9의 본질적인 표현 형에 그들의 가능한 연결을 제안 하는 파 킨 슨 병에 연결 되었습니다. 최근, 인접 장 submucosa에서 EGCs의 고립 된 문화에 있는 핵 단백질 menin의 손실을 했다 호르몬 gastrin10의 식을 유도 하기에 충분 한 관찰 되었다. 결과적으로, 그것은 EGCs 십이지 장 gastrinomas, 신경 내 분 비 종양10의 종류의 수 있습니다 제안 했다. 샨 다, 이러한 예 절연된 EGCs neuropathic 질환 및 암11의 기능과 동작의 관련성 밑줄.
필드에 도전 중 하나 또는 모두 EGC 인구에서 생체 외에서연구를 격리 하는 방법 남아 있습니다. 혈통 추적 실험 submucosa 및 lamina propria EGCs myenteric 총7에 조상 세포에서 발생 설명 했다. 여러 게시 된 격리 프로토콜 myenteric EGCs12,13,14,15,,1617의 문화를 생성 하는 사용할 수는 있지만 18,19, 아무도 특히 submucosal/lamina propria EGC 인구의 격리 대상. EGC 격리에 대 한 기존 프로토콜은 특별히 기계적 분리의 조합 또는 효소 분리, 점 막 세포 층을 결국 삭제와 함께 부드러운 근육의 기정을 사용 합니다.
이 원고의 목표 비 효소 lamina propria 생체 외에서 연구에서 기본 EGCs를 분리 하는 단계를 설명 하는 것입니다. 특별히 그는 submucosa에서 myenteric EGCs 구별 없는 마커 때문 평활 근에서 상피 점 막의 공간 분리 submucosal EGCs을 악용 했다. 또한, EDTA chelation 비 효소 분리와 결합 하 여 EGCs 관련된 인터 myenteric EGCs 함께 삭제 되었다 부드러운 근육 달리 submucosa 격리 했다. Submucosa의 lamina propria EGCs 더 분리 glial 세포 친화적인 기판, 예를 들어, 폴 리-D-리 신과 laminin에 세포 배양에 의해 발생 했습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-D lysine (1 mg/ml stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (0.5 mg/ml stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4544</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL on ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td>Dilute 1:100 in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>36216004</td>
			<td>Dilute 1:100 in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/mL stock)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (10 &#181;g stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM stock)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-10004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-a-Smooth Muscle Actin&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab112022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Pgp9.5&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-E-cadherin&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit S100&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse p75 NTR&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R-37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B) 250 &#181;g/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Fura-2-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK peptide</td>
			<td>Anaspec, Fremont, CA</td>
			<td>AS-20741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin peptide (Gastrin-17)</td>
			<td>Abbiotec, Bloomington, IN</td>
			<td>350188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Celll Strainer (100 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Celll Strainer (40 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serologic Pipet 5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of the adult mouse

신경 세포 및 평활 근 벽, submucosa 및 lamina propria 상주 장 glial 세포 (EGCs) 장 신 경계 (ENS)에 의하여 이루어져 있다. EGCs 다양 한 영양 요인의 출시를 통해 직감 항상성에서 중요 한 역할을 하 고 상피 방 벽의 무결성을. 기본 장 폐해 문화의 대부분 연구 사용 세포 효소 분리 후 myenteric 총에서 분리. 여기, 격리 하 고 장 submucosa 및 lamina propria EGCs 문화 비 효소 방법 설명 되어 있습니다. 경도 근육 층의 수동 제거 후 EGCs lamina propria submucosa 상용 비 효소 세포 복구 솔루션에 외피 다음 순차 HEPES 버퍼링 EDTA 외피를 사용 하 여에서 해방 되었다. EDTA 외피 세포 복구 솔루션 submucosal EGCs 해방 수 있도록 lamina propria에서 상피 점 막의 대부분을 제거 하기에 충분 했다. 모든 잔여 lamina propria와 부드러운 근육 myenteric 명과 함께 삭제 되었다. EGCs 쉽게 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)를 표현 하는 그들의 능력에 의해 확인 되었다. 세포 현 탁 액의 약 50% 포함 된 GFAP + 셀 조직 외피를 완료 한 후 폴 리-D-리/laminin 기판에 도금 하기 전에. 그러나, glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)에서 세포 배양의 3 일 후-문화 미디어를 포함, 기판 코팅 판에 고착 하는 세포 인구 구성 > 95% 장 명과. 우리는 hGFAP-Cre 마우스 GFAP + 생 세포 형광을 사용 하 여 셀의 비율을 추적 하는 사 tdTomato 기자 라인을 사육 하 여 하이브리드 마우스 라인을 만들었습니다. 따라서, 비-myenteric 장 명과 비 효소 방법으로 격리 하 고 적어도 5 일 동안 배양 될 수 있습니다.

Preps는 GFAP + 셀 준수 하지 않았고 24 h (그림 4A) 내에서 확산 하는 경우 실패 한 고려 되었다. Glial 세포 수 전지와 준수 플랫 집계 (그림 4B)으로 확산의 증거를 보여주었다 때 24 h 이후까지 확인할 수 없습니다. 클러스터의 가장자리에 세포는 긴 프로세스를 확장 하는 경향이 하 고 고전적인 glial 마커, 예를 들어, GFAP, S100b 및 p75NTR (그림 4C, 4d)10,16. 2nd 하루 glial 세포 비 점착 인구 PBS로 멀리 씻어 서 있을 수 있도록 표면에 밀접 하 게 준수 됩니다. 떠 있는 세포의 대부분은 상피 그리고 lamina propria 세포 세포 파편과 함께. 이러한 부동 셀 덩어리의 존재까지 통해 흐름은 거의 분명 하 고, 상피 세포는 lamina에서 제거 된 신호 EDTA 외피를 수행의 중요성을 강조 하는 부착 glial 세포의 수익률 감소 오는 코어. 또한, 세포 복구 솔루션에 잠복기 후 1500 x g 보다 낮은 속도로 원심 않았다 효과적으로 수집 하지 모든 가능한 셀 생산량 감소에 지도 펠 릿으로. 일반적으로 40000 100000 셀 EGCs 형태학 상으로 일치 주 3 문화에 의해 확고 하 게 준수 됩니다.
폐해 관련 된 항 체와 Immunohistochemical 분석 표시는 셀 클러스터의 그 남아 점착 하루 3 GFAP, S100b, 및 Sox 10 긍정적인10,16 (그림 5A). 현재 연구에서이 같은 정도의 순도 셀 permeabilizing 고 cytometry (그림 5B-F)에 의해 분석 하 여 관찰 되었다. 직후 submucosal/Lamina propria glial 세포를 분리, cytometry 밝혀 그 세포의 약 51 %GFAP + (그림 5B), 예를 들어, 상피, 조 혈, GFAP 부정적인 세포 유형의 존재를 제안 내 피, 신경 세포, 상피와 lamina propria에 존재 하기 위하여 알려진 myofibroblasts. 3 일 후에 문화, GFAP + 셀 수 대표 이상 95% 인구의 셀 원본 미디어를 제거한 후 분석, PBS와 rinsing 부드럽게 하 고 다음 추가 신선한 미디어 (그림 5C). 흥미롭게도, 흐름 분석 공개 및 로우 GFAP 단백질 표현 인구 (그림 5C). 실제로, 세포의 immunofluorescent 분석 클러스터의 주변 GFAP (그림 4C, 4d)의 상부를 표현 하는 경향이 나타났다. 함께 찍은, 분석의 두 가지 유형의 EGC 성숙도 나 분화 상태에 차이 나타낼 수 있습니다. Α의 총칭, 비율-SMA + (myofibroblast 셀 표식), E-cadherin + (상피 세포 마커), 그리고 Pgp 9.5 + (신경 세포 마커) 세포는 5% 미만 (그림 5D-F). 이러한 결과 선행 연구와 일치 했다 10의 약 93%를 보여주는 EGCs immunofluorescent 라벨을 사용 하 여 수행 GFAP + 세포. 흐름 분석 이후 문화의 약 5%를 함유 하는 오염 세포 인구를 제거 수 있도록 접시를 준수 하는 세포 수의 중요성을 밑줄.
이 연구에서 목표 고 생 형광 표식 (그림 6)를 사용 하 여 EGC 농축의 정도 비교 하기 위해 추가 분석에 대 한 셀의 cytometry GFAP 활성화 기자를 사용 했다. HGFAP-Cre 마우스 선 원래 았지 및 동료 20여 설명 했다. 간단히, Cre recombinase 인간의 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (hGFAP) 발기인의 2.2 kb의 통제 하에 두었다. 따라서 어떤 셀이 hGFAP 발기인 속기 빨간 형광 기자 tdTomato 표현. TdTomato 기자와 표시 셀 인구 시각화 된 제자리에 위에서 설명한 EGC 격리 절차를 수행 하기 전에 창 자와 콜론 (그림 6A, 6B)의 냉동된 섹션을 사용 하는. EDTA/셀 복구 격리를 수행 하 고 3 일 동안 세포를 배양, 후이 쥐에서 EGCs 쉽게 그들의 내 인 성 형광 (그림 6 c)에 의해 확인 되었다. 비록 GFAP + 셀 틀림 없이 근 위 소장4,21에 더 많은, tdTomato + EGCs 또한에서 관찰 되었다 콜론 (그림 6B). 또한 hGFAP의 모달 인구를 계시 했다 tdTomato+ 형광 기자 hGFAP-Cre에 의해 활성화를 사용 하 여-tdTomato + 세포 (그림 6D) GFAP의 immunofluorescent 분석을 사용 하 여 관찰로 단백질 (그림 5C). 모든 EGCs GFAP 단백질4표현으로 보고 되어,이 이때 GFAP 식의 수준에서 차이 반영 수 있습니다. 평균, 분석 하는 셀의 약 66 %tdTomato 형광의 최고 수준의 전시. 따라서, EDTA/셀 복구 프로토콜 소장 및 유전자 발현의 차이 검사 하는 기자에 의해 표시 된 콜론 EGCs의 하위 집합을 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜 비교적 순수한 GFAP + glial 세포의 생 화 확 적인 연구와 서쪽 오 점 분석에 대 한 충분 한 수를 생성 10. glial 세포 응답을 보여 3 일 glial 세포 준비 호르몬 cholecystokinin (CCK) 또는 캘리포니아2 + 플럭스 유도 gastrin 대우 되었다 (그림 7A-7B)10. 결과 이러한 GFAP + 부착 세포 세포 외 agonists 알려진된 장 폐해 기능을 전시 하는 능력을 보여주는 반응을 보였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57629/57629fig1.jpg"> 그림 1: 설정 및 마우스 창 자의 준비. 추출 된 내장을 포함 하 여 얼음에 절연의 (A) 그림. (B) 그림 5 mL 주사기 20 G 무뚝뚝한 끝 바늘에 연결 된 지저분한 내용을 플러시합니다. (C) 나무 면봉 (~ 4 cm) DPBS 버퍼에 몸을 담글의 Engineered 끝. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57629/57629fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57629/57629fig2.jpg"> 그림 2: 단계 내장을 청소 하 고 경도 근육/myenteric 총 (LMMP)을 제거 하는 데 사용. (A C) 젖은 나무 막대기에 장 세그먼트를 슬라이딩. (D) 부착 mesentery의 제거. (E) Nicking 면도날으로 소장. (F) 젖은 면봉으로 LMMP를 제거. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57629/57629fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57629/57629fig3.jpg"> 그림 3: EDTA 외피 후 순차적 흐름-throughs. 표시 인 큐베이 팅 5 mM EDTA/10 mM HEPES DPBS에 다음 triturated를 가진 10 분 동안 20 번 3 7 cm 장 세그먼트를 사용 하 여 4 순차 외피에서 흐름-throughs의 예입니다. 100 µ m 나일론 메쉬 스 트레이너를 통해 쏟아지는 후 대표적인 흐름-throughs 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57629/57629fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57629/57629fig4.jpg"> 그림 4: EGC 도금 후 24 h 이미지. 도금 후 resuspended 셀 24 h의 가벼운 현미경 검사. (A) 표시 가난한 준비 부동 상피 세포 덩어리 (화살표) 및 파편의 대표적인 예입니다. 아니 점착 EGCs 24 h. 후 관찰 되었다 (B) 표시 셀 분리와 물의 resuspension EGCs의 패치가 PDL/Laminin 준수 코팅 판 후 우수한 준비 24 h의 대표적인 예입니다. 이미지는 디지털 카메라와 함께 거꾸로 형광 현미경에 체포 했다. 스케일 바 = 500 µ m (A-B). EGC 셀의 패치 (C) 고 출력 보기 (녹색) 주변에 셀 라벨의 높은 강도를 보여주는 GFAP 항 체와 스테인드. 여러 셀의 이중 핵 (화살촉, DAPI, 파란색)을 보여주었다. (D) Colocalization의 GFAP (녹색) S100 (빨간색)와 p75NTR (빨간색). 바 규모 = 20 µ m (C-D). 세포는 antifade 시와 DAPI (블루 핵) 탑재 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57629/57629fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57629/57629fig5.jpg"> 그림 5: cytometry 성인 마우스의 십이지 장 lamina propria에서 고립 된 장의 glial 세포의 흐름. (A) GFAP 면역 형광, S100B 및 Sox10 EGC 문화 3 일 후에. 화살표는 삭스 10 긍정적인 핵을 나타냅니다. 바 규모 = 20 µ m (Sundaresan 그 외 여러분 의 허가 함께 사용 10). GFAP (B) 비율 (형광 강도 (또는 앞으로 분산형, x 축) 쪽 분산형 (y 축) 대 코팅된 판에 도금 하기 전에 긍정적인 세포. GFAP 긍정적인 (D) α-SMA 긍정적인 (E) E-cadherin (F) 양수와 Pgp 9.5 긍정적인 세포 3 daysafter 도금의 (C) 비율. 게이츠는 죽은 세포와 파편을 피하기 위해 건설 되었다. 표시 된 셀 (사이드 분산형) 수를 기준으로 형광 인구 평균 비율이입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57629/57629fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57629/57629fig6.jpg"> HGFAP-Cre+의 십이지 장 lamina propria에서 고립 된 장의 glial 세포의 그림 6: 식별: tdTomato+ 성인 마우스. 생 tdTomato 형광 (빨간색) 이미지 (A) 내장에서 디지털 카메라와 함께 단계 대비 형광 현미경에 체포 되었다. (삽입) A를 제외 하 고 동일 DAPI 이미지 (파란 핵)와 합병. (B) 콜론 DAPI 병합. (C) Enteric glial 세포 (레드) hGFAP에서 분리-Cre:dtTomato+ 마우스 PDL/Laminin 기판에 3 일 동안 경작 하 고. 스케일 바 = 50 µ m (D) 흐름 cytometric 분석 tdTomato 세포의. 표시 된 GFAP + 셀 ± sem의 3 다른 준비 (3 쥐 준비 당)의 평균 %입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57629/57629fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57629/57629fig7.jpg"> 그림 7: 비디오의 캘리포니아2 + 호르몬 치료 후 플럭스. EGCs 24-잘 PDL에 laminin 코팅 도금 플레이트 3 일에 대 한 폐해 성장 매체에서 경작 했다. 셀-37 ° C에서 20 분의 Fura-2 3 µ M와 로드 고 다음 치료와 (A) 100 nM cholecystokinin (CCK) 또는 (B) 100 nM gastrin. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57629/Figure_7.zip">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>볼륨을 추가할 수</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td>44.5 mL</td>
			<td>_</td>
		</tr>
<tr>
<td>소 태아 혈 청 (FBS)</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>페니실린-스</td>
			<td>500 Μ L</td>
			<td>100 IU/mL 펜</td>
		</tr>
<tr>
<td>스</td>
			<td></td>
			<td>100 µ g/mL Strep</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gentamicin (50 mg/mL 주식)</td>
			<td>20 Μ L</td>
			<td>20 µ g/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 구성 Glial 세포 물의 Resuspension 미디어의.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>볼륨을 추가할 수</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td>44 mL</td>
			<td>_</td>
		</tr>
<tr>
<td>소 태아 혈 청 (FBS)</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>페니실린-스 (100 x)</td>
			<td>500ΜL</td>
			<td>100 IU/mL (펜)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>100 µ g/mL (Strep)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gentamicin (50 mg/mL 주식)</td>
			<td>20 Μ L</td>
			<td>20 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>GDNF (10 µ g/mL 주식)</td>
			<td>50 Μ L</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-글루타민 (200 m m 재고)</td>
			<td>500ΜL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: Glial 세포 성장 매체의 구성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>면역 형광 검사 희석</td>
			<td>교류 Cytometry 희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>치킨 안티 GFAP</td>
			<td>1 ~ 500</td>
			<td>1 2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>토끼 반-S100</td>
			<td>1 ~ 500</td>
			<td>1 ~ 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>마우스 안티 p75 NTR</td>
			<td>1 ~ 500</td>
			<td>1 ~ 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>염소 안티-E-cadherin</td>
			<td></td>
			<td>1 ~ 400</td>
		</tr>
<tr>
<td>마우스 안티-Pgp9.5</td>
			<td></td>
			<td>1 ~ 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>염소 안티--부드러운 근육 걸</td>
			<td></td>
			<td>1 ~ 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 렉 사 Fluor 488 염소 안티 닭 IgY</td>
			<td>1 ~ 1000</td>
			<td>1 ~ 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 렉 사 Fluor 568 염소 반대로 마우스 IgG</td>
			<td>1 ~ 1000</td>
			<td>1 ~ 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 렉 사 Fluor 594 당나귀-토끼 IgG</td>
			<td>1 ~ 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>알 렉 사 Fluor 488 당나귀 안티 염소 IgG</td>
			<td></td>
			<td>1 ~ 1000</td>
		</tr>
</tbody></table>항 체의 표 3: 목록

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse at JoVE.com

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

여기, 우리 장 submucosa 순차적 EDTA 외피를 사용 하 여 divalent 양이온 그리고 외피 비 효소 세포 복구 솔루션에 킬레이트 하에서 장 glial 세포의 설명. 폴 리-D-리 신과 laminin에 결과 세포 현 탁 액을 도금 기능 분석을 위한 submucosal glial 세포의 매우 풍부한 문화에 발생 합니다.

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

isolation-enteric-glial-cells-from-submucosa-lamina-propria-adult

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K 조회수.  University of Michigan. 여기, 우리 장 submucosa 순차적 EDTA 외피를 사용 하 여 divalent 양이온 그리고 외피 비 효소 세포 복구 솔루션에 킬레이트 하에서 장 glial 세포의 설명. 폴 리-D-리 신과 laminin에 결과 세포 현 탁 액을 도금 기능 분석을 위한 submucosal glial 세포의 매우 풍부한 문화에 발생 합니다.

비디오: Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

성인 뮤 린 눈물과 턱 밑 동맥에서 Myoepithelial 세포의 고립

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...