이 연구는 헤르메스 친목 올라요 Negm 타 냐 모나 고 노팅엄 소화 질환 센터와 NIHR 노팅엄 소화 질병 생물 의학 연구 센터에서 별도 자금을 통해 지원 했다.

1. 준비 Microarray 플레이트
<ol><li>(이 환자 세라를 실행 하기 전에 미리 정의 된) 최적 농도에서 인쇄 버퍼 [PBS-트윈-트 레 할 로스 (50mm)] C. 남과 어울리지 않는 항 원 희석: 독 소는 (200 µ g/mL) 및 독 소 B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), 및 순화 된 네이티브 전체 SLPs ribotypes 001, 002, 027 (200 µ g/mL)에서 파생 된. 참고: 독 소 B 독 소 B 표현 스트레인 CCUG 20309 (90 µ g/mL)에서 얻은 것입니다.<ol>
<li>긍정적인 컨트롤, C. albicans, 및 100 µ g/mL에서 인쇄 버퍼와 파상풍 사망 toxoid lysates 희석. 마지막으로, 일치 시험된 항 체 isotype 직렬, 10 희석 한 교정 커브를 생성 인쇄 버퍼에 걸쳐 50 µ g/mL에서 시작 순화 인간 면역 글로불린 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>384 잘 격판덮개로 인쇄 버퍼에 희석의 10 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>커버 플레이트 플레이트 물개 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기와.</li>
</ol>2. 인쇄 연락처 로봇 배열
<ol><li>열 휴대용 가스 버너 3 x 2 각 s를 사용 하 여 실리콘 핀 하 고 깨끗 한 물 3 x 3 s에 린스.</li>
	<li>arrayer의 로드 카트리지에 microarray 접시를 놓습니다.</li>
	<li>Aminosilane 슬라이드 슬라이드 트레이에 놓습니다. 참고: 슬라이드 트레이 27 슬라이드를 저장할 수: 9 슬라이드의 세 행. 슬라이드 아래쪽 행의 왼쪽에서 시작 하는 세로 방향으로 배열 되 고 공간의 나머지 빈 슬라이드에 슬라이드 트레이에서 모든 구멍 커버는 되도록 덮여 있다.<ol>
<li>확인 누르고 진공 켜져 있고 모든 슬라이드는 보안 확인. 인쇄를 시작 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 습 한 환경에서 슬라이드를 둡니다. 참고: aminosilane 슬라이드는 방 습 제로 밀봉된 주머니에 제공 됩니다. 일단, 어떤 사용 되지 않는 슬라이드 만료 날짜까지 저장용 desiccator에 즉시 반환 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원 인쇄에 적합 한 인쇄 프로그램을 설정 합니다. TAS 응용 프로그램 제품군을 실행 하 고 ' 내 Gridding 실행 ' 디렉터리에서 필요한 인쇄 실행된 매개 변수 파일을 엽니다. 모든 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 quadruplicate 인쇄 Clostridium 남과 어울리지 않 는 파일을 선택 합니다.</li>
	<li>주 창에 MicroArray 아이콘을 두 번 클릭 시 3 탭 창 라는 'MicroArraying 파라미터' 표시 됩니다.  세 개의 탭은 "원본," "대상"과 "옵션." "소스" 탭 내용을 microarray 접시에서 사용 되는 샘플의 수를 나타냅니다. "대상" 탭 어떻게 슬라이드는 로드, 배열 슬라이드 인쇄 하 고 슬라이드 레이아웃 (16 하위 형식) 편집의 세부 정보를 표시 합니다. "옵션" 탭에는 세척 프로토콜 및 도구 사용된 예를 보여 줍니다. 모든 완성 된 샘플 후 씻어. 다른 샘플 사이 어떤 상호 오염 든 지 피하기 위하여 샘플 사이의 실리콘 핀을 청소 하십시오.</li>
	<li>프로그래밍 옵션은 옵션 아래에 있는 > TAS 스위트 도구 모음에서 환경 설정을 실행. 통해이 섹션에서 작업을 9 탭이 있습니다 그리고 당신이 완전 한 하나의 탭에 클릭 하 여 다음 이동. "확인" 버튼을 클릭 하면 "실행 환경 설정." 밖으로 이동 됩니다. "실행 환경 설정"의 "일반" 탭에서 어떻게 악기는 프로그램이 시작 될 때 동작에 관련 된이 섹션에서 사용할 수 있는 확인란 수가 있다. "실행의 시작 전에 프라임 목욕" 확인란을 모든 3 개의 세척 스테이션 실행된 시작 전에 짧은 못쓰게 시퀀스를 받게 될 것 이다. 첫 번째 소스 방문 전에 확인 "실행의 시작에 세척" 상자, 핀 도구 세척 될 것 이다. "세척 실행의 끝에" 체크 박스를 선택 후 마지막 소스 방문 핀 도구 세척 될 것 이다. 사용자는 세척 주기의 수를 설정할 수 있습니다. "실행 환경 설정"의 "기후" 탭에는 습기를 시작 합니다. 우리가 사용 하는 설정에는 다음과 같습니다: 율 55%, 최소 습도 55%, 대상 습도 60% 실행 시작 속도 55%. 대상 습도 도달 했습니다, 그렇지 않으면 관광 명소 잘못 된 크기 및 도서관 것 이다 급속 하 게 증발 때까지 실행을 시작 하지 마십시오.</li>
	<li>TAS의 메뉴 모음에서 녹색 이동 버튼을 클릭 합니다.  실행을 시작 하 고 주기적으로 특정 다 수 인쇄 실행 하는 동안 arrayer는 확인 합니다. 참고: 수 있습니다 각 슬라이드에 병렬로 15 샘플의 분석을 한 하위 부정적인 컨트롤으로 사용 됩니다. 배열의 디자인 인쇄 된 단백질 (항 원)의 수에 의해 결정 되 고 인쇄 된 생물의 수 복제 합니다. 참고: 각 샘플 인쇄 후 머리 진행 세척 목욕 증류수 및 0.002% 포함 하는 2 개의 세척 목욕으로 핀을 여러 찍기 수 있도록 1.5 트윈 20 각 목욕에 s 뒤에 핀 초 순수한 물으로 헹 구 고 건조에 핀 4 주요 워시 역 s.</li>
</ol>3입니다. 스토리지 배열
<ol><li>인쇄 된 슬라이드는 desiccator에서 실내 온도에 밤새 껏 저장 하십시오. 참고: 인쇄 된 슬라이드는 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 배열 검색
<ol><li>조심 스럽게 16 다 잘 실 형식의 슬라이드 홀더 인쇄 슬라이드 장소. 참고: 챔버, 약 7.5 m m의 깊이 갖는 혼합 및 세척 단계 볼륨 비율에 관대 한 표면 제공.</li>
	<li>모든 시 약을 사용 하기 전에 실내 온도를 따뜻하게 수 있습니다. 달리 지정 하지 않는 한 실 온에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>필터링 된 5% 소 혈 청 알 부 민 트윈 (BSAT; 사용 필터 주사기 0.2 µ m) 각 블록, 슬라이드, 커버와 함께 1 시간 동안 흔들어 그들을 품 어를 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>슬라이드 5 x 1 분 인산 염 버퍼의 120 µ L에 트윈 20 식 염 수 세척 (PBST; 0.1% 트윈) 동요와 당. 슬라이드를 밖으로 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>20 분 동안 얼음에 혈 청 샘플을 해 동 하 고 배경 구성 요소 감소와 희석제를 상업적으로 사용할 수 있는 항 체와 각 샘플을 희석 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>표 2와 같이 테스트 면역 글로불린에 따라 혈 청 샘플의 희석을 최적화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하나, 부정적인 컨트롤;로 사용 될 것입니다를 제외 하 고 모든 블록을 희석된 혈 청 샘플의 100 µ L를 전송 이 블록에만 항 체 희석제의 100 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 부드러운 동요와 함께 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>PBST의 120 µ L에서 슬라이드 5 x 3 분을 세척 (0.1% 트윈) 동요와 당.</li>
	<li>biotinylated 염소 반대로 인간 항 체 항 체 희석제로 희석의 100 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>표 2에 설명 된 대로 테스트 면역 글로불린에 따라 이차 항 체의 희석을 최적화 합니다. 슬라이드 커버 하 고 1 시간 동안 부드러운 흔들어으로 그들을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>잘 흔들어 당 PBST의 120 µ L에서 슬라이드 5 x 3 분을 씻어.</li>
	<li>각 블록 5 %BSA 1: 2000에서 희석 streptavidin Cy5의 100 µ L를 추가 합니다. 부드러운 동요와 15 분 동안 흔들어 동안 빛에서 그들을 보호 하기 위해 호 일 슬라이드 커버.</li>
	<li>슬라이드 5 x 1 분 각 120 µ L에서 PBST의를 씻고 잘 떨고, 당 각 PBS에 1 분의 2 세척만 떨고 다음.</li>
	<li>그들을 건조 300g x 5 분에 대 한 슬라이드를 회전 합니다.</li>
	<li>실내 온도에 전송 및 저장에 대 한 어두운 상자에 슬라이드를 유지.</li>
	<li>프로 빙 후 신호 일관성을 보장 하기 위해 즉시 배열 검사를 진행 합니다. 참고: 그러나, 탐지 슬라이드 수 어둠 속에 저장 되며 프로 빙에서 1 주일 이내 스캔.</li>
</ol>5. 배열 검색
<ol><li>레이저 스캐너에 전환 ( 재료의 표참조) 워밍업 레이저 스캔 하기 전에 30 분. 스캐너 소프트웨어를 업로드 하 고 스캐너를 컴퓨터에 연결 합니다.</li>
	<li>플레이 빛 녹색 변할 때까지 슬라이드 인쇄 된 쪽 얼굴을 스캐너에 놓습니다.</li>
	<li>설정 단추를 누르고 다음 설정을 조정 할 때 다음과 같은 슬라이드를 스캔: 스캔 모드, 중간; 수집, 635만; 수집 모드, 수동; 이득, 20; 전력, 낮은; 슬라이드 유형, 레이블 없는 슬라이드; 초점, 자동 초점입니다. 자동 스크롤을 끄고 픽셀 크기 10와 35 스캔 바코드 읽기 설정.</li>
	<li>여러 이미지를 TIFF 형식 16 비트 회색조로 결과 이미지를 저장 합니다. 가져오기 격자 단추를 누르고 적절 한 배열 목록 선택. 참고: 배열 목록 크기와 배열의의 위치와 각 기능 표시기와 관련 된 인쇄 된 물질의 이름을 설명 합니다.<ol>
<li>슬라이드에 반점에 그리드를 정렬 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 명소의 형광 신호 강도 측정 하 고 GenePix 결과 (GPR)를 호출 하는 텍스트 형식으로 결과 저장을 정량화 과정 버튼을 눌러 이미지를 분석 합니다. 참고: GPR 파일 배열에 항 원 대상의 현지화 및 식별 변수를 포함 하 고 또한 항 체 바인딩을 나타내는 로컬 배경과 중간 형광 강도 신호 각 자리 값.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>배경 빼기 라는 역 상 단백질 배열 (RPPA) 분석기, 크 랑36R 통계 언어 모듈 무료 microarray 분석 소프트웨어를 사용 하 여 후 각 항의 복제에 대 한 중앙값을 계산 합니다.</li>
	<li>표준 곡선을 플롯 하 고 각 항 원 항 체 수준을 계산 하 상업 과학 그래프 및 통계 소프트웨어 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 면역 글로불린 표준 곡선을 기준으로 신호 보간.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+Clostridium+difficile.-specific+antigens+by+protein+microarray+analysis.">Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+subclass-specific+binding+and+neutralizing+antibodies+against+Clostridium+difficile.+toxins+in+adult+cystic+fibrosis+sera:+possible+mode+of+immunoprotection+against+symptomatic+C.+difficile+infection.">High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).</li><li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+against+Clostridium+difficile.+are+present+in+intravenous+immunoglobulin+and+are+retained+in+humans+following+its+administration.">Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).</li><li>Monaghan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OC-058+A+protein+microarray+assay+for+predicting+severe+outcomes+in+Clostridium+difficile+infection.">OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection.</a> Gut. 66, 31 (2017).</li><li>Bacon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+directed+against+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile+in+the+general+population+and+patients+with+antibiotic-associated+diarrhea.">Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).</li><li>Viscidi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+antibody+response+to+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile.">Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile.</a> The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).</li><li>Salcedo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+therapy+for+severe+Clostridium+difficile+colitis.">Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis.</a> Gut. 41 (3), 366-370 (1997).</li><li>Abougergi, M. S., Kwon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+for+the+treatment+of+Clostridium+difficile+infection:+a+review.">Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).</li><li>Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+in+the+treatment+of+severe+Clostridium+difficile+colitis.">Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis.</a> Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).</li><li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+carriage+of+Clostridium+difficile+and+serum+levels+of+IgG+antibody+against+toxin+A.">Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).</li><li>Solomon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+in+patients+with+Clostridium+difficile+infection+correlates+with+host+pro-inflammatory+and+humoral+immune+responses.">Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses.</a> Journal of Medical Microbiology. 62, 1453-1460 (2013).</li><li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+antibody+response+to+toxin+A+and+protection+against+recurrent+Clostridium+difficile+diarrhoea.">Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea.</a> Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).</li><li>Leav, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+anti-toxin+B+antibody+correlates+with+protection+from+recurrent+Clostridium+difficile+infection+(CDI).">Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI).</a> Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).</li><li>Drudy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+response+to+surface+layer+proteins+in+Clostridium+difficile+infection.">Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).</li><li>Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+response+as+predictor+of+recurrence+in+Clostridium+difficile+infection.">Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).</li><li>Wilcox, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bezlotoxumab+for+prevention+of+recurrent+Clostridium+difficile+infection.">Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).</li><li>Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+against+Clostridium+difficile.">Vaccines against Clostridium difficile.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).</li><li>Ghose, C., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prospect+for+vaccines+to+prevent+Clostridium+difficile+infection.">The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).</li><li>Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+safety+and+efficacy+of+vaccines+as+prophylaxis+for+Clostridium+difficile+infections.">A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections.</a> Vaccines. 5 (3), (2017).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Delehanty, J. B., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+printing+functional+protein+microarrays.">Method for printing functional protein microarrays.</a> BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).</li><li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+microarrays.">Overview of protein microarrays.</a> Current Protocols in Protein Science. , 21 (2013).</li><li>Huang, Y., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array-based+approaches+for+biomarker+discovery+in+cancer.">Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).</li><li>Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+humoral+immune+response+to+infectious+agents+using+high-density+protein+microarrays.">Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays.</a> Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).</li><li>Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serodiagnosis+of+infectious+diseases+with+antigen+microarrays.">Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays.</a> Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).</li><li>Davies, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays:+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery.">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).</li><li>Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antigen+microarrays+for+serum/plasma+antibody+detection.">Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection.</a> Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).</li><li>Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+high-content+functional+protein+microarrays.">Applications in high-content functional protein microarrays.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).</li><li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+analysis+of+the+Ab+response+to+Plasmodium+falciparum+before+and+after+a+malaria+season+by+protein+microarray.">A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).</li><li>Khodakov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligonucleotide+microarray+for+multiplex+real-time+PCR+identification+of+HIV-1,+HBV,+and+HCV.">An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV.</a> BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).</li><li>Ryabinin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+oligonucleotide+microarray+for+sub-typing+of+Influenza+A+virus.">Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus.</a> PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+diagnostics+using+a+coronavirus+protein+microarray.">Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).</li><li>Cleton, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+the+difference:+development+of+a+syndrome+based+protein+microarray+for+specific+serological+detection+of+multiple+flavivirus+infections+in+travelers.">Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers.</a> PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).</li><li>Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+antigen+array+for+simultaneous+detection+of+viral+antibodies.">Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies.</a> PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array+identification+of+protein+markers+for+serodiagnosis+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Scientific Reports. 5, 15349 (2015).</li><li>Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPPanalyzer:+analysis+of+reverse-phase+protein+array+data.">RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+antibody+and+memory+B-cell+responses+to+C.+difficile-associated+diarrhoea,+inflammatory+bowel+disease+and+cystic+fibrosis.">Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis.</a> PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).</li><li>Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+microarray+surface+chemistries.">Current microarray surface chemistries.</a> Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).</li><li>Wellhausen, R., Seitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facing+current+quantification+challenges+in+protein+microarrays.">Facing current quantification challenges in protein microarrays.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).</li><li>Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+surface+chemistry+in+protein+microarrays.">The critical role of surface chemistry in protein microarrays.</a> Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , (2007).</li></ol>

없음입니다.

이 프로토콜에서 우리는 microarray C. 남과 어울리지 않 는 단백질 항 원 환자 세라 (그림 3 과 6)와 IVIg (그림 5)의 상업적인 준비에 체액 성 면역 응답을 정의 하기 위한 적합 한 플랫폼입니다 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 microarray 기술은 기존의 ELISA (그림 2)에 비교 될 때 잘 수행 하 고 내부 및 남북 assay variabilities 정밀 ( 의 허용 한계 내로 우수한 재현성을 보여줍니다 증명 하고있다 표 1).
중요 한 단계: 어떤 성공적인 항 원 microarray 플랫폼을 구축할 때 중요 한 단계 수를 다음 합니다. 처음에, 그것은 매우 품질 실험을 실행 하는 것이 중요입니다. 품질 관리 실험에서 서로 다른 매개 변수 평가 되어야 한다, 적절 한 표면 화학, 인쇄 버퍼, 블로킹 버퍼, 혈 청 샘플 및 이차 항 체의 희석의 선택과 같은. 이 실험은 잘 검증 되 고 신뢰할 수 있는 기술38,39제공의 목적으로 수행 되어야 합니다.
적당 한 단백질의 동원 정지 과정의 선택이이 연구에서 보듯이 테스트 aminosilane 슬라이드의 고품질 성능을 보장 하는 microarray 분석에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 정기적이 고 원형 자리 형태학, 높고 특정 신호 강도, 그리고 분명 배경 관찰 하는 것이 결정적 이다. Microarray 성능에 영향을 미치는 또 다른 요소는 균일 하 고 일반 명소 슬라이드에 생산 원하는 표면 화학을 달성 하는 것도 중요 인쇄 버퍼.
그것은 이렇게 하면 최적의 크기와 인쇄 하는 자리를의 모양으로 인쇄에 대 한 올바른 설정을 선택 해야 합니다. 예를 들어 습도 수준 유지 되어야 한다 약 55%, 인쇄 중 습도 없이 microarray 챔버에 증발의 비율은 증가 되 고 적은 명소 인쇄 됩니다 때문에.
비 특정 단백질 바인딩은 추가 요소에 영향을 미치는 배경 및 현장 신호; 따라서, 블로킹 버퍼의 적절 한 선택 어떤 비 특정 바인딩, 향상 된 감도 및39의 배열 데이터 정확성을 줄일 수 있습니다.
수정 및 문제 해결: 항 원 및 혈 청 샘플 해야 aliquoted 냉장고에 작은 스토리지 튜브에 저장 방지 하는 데 도움이 사용까지 배열의 신호 강도 저하 수 있습니다 여러 동결-해 동 주기를 반복. 성공적인 실험의 기회를 향상 시키기 위해, 모든 시 약 신선한 준비 되어야 하 고 필터링 할. 인쇄 하 고 설정이 필요 확인 하기 전에 arrayer를 청소. 또한, 슬라이드 홀더 배경 잡음을 최소화 하기 위해 청결 한 유지 되어야 한다.
제한 사항: 단백질 microarrays의 응용 프로그램은 현재 단백질 microarray 제작에 표면 화학에 대 한 엄격한 수요에 의해 방해 된다. 여기 단백질 분자의 화학 및 물리적 특성에 있는 중대 한 변이 단백질 및 항 체 분자40의 다른 클래스에 대 한 사용자 지정 디자인 독특한 표면 화학을 필요로합니다. 다른 기술 과제 같은 기술의 광범위 한 구현 등 고가의 특수 장비 및 유지 보수 비용, 복잡 한 데이터 분석, 상대 배려 뿐 아니라 할당 된 벤치-공간, 소프트웨어에 대 한 필요 단백질 정량화, 그리고 비판적으로 순화 된 항 원에 대 한 액세스.
기존/대체 방법에 관하여 방법의 중요성: Microarray 기술 ELISA, Meso 스케일 검색, 또는 Luminex immunoassays 원리에서 유사 하지만 사용자 정의할 수, 통계적 인 힘을 달성 하기 위해 확장할 수 있습니다, 유일한 microliter 귀중 한 샘플의 수량에 의존 있으며 화면 세라 수 여러 단백질 reactivities에 대 한. 그것은 따라서 대규모, 역사적 혈 청 은행 및 바이오 마커 발견과 심사에 특히 적합 합니다.
미래의 응용 프로그램 또는 방법의 방향: 향후 다른 샘플 (셀 supernatants)에 대 한 분석 결과 사용 하 여 분석 결과 전조 도구로 환자 계층에 대 한 이중 패션에 큰 무리를 사용 하 여 외부 유효성 검사 잠재적인 생체 최적화 쪽으로 이동 하 고 예측 하 고 최적화 immunotherapy (mAb, 백신)에 대 한 응답. 미래에, microarray 기술 병원 설정 유용한 진단 도구 또는 시간의 기간 동안 약물 치료 계획을 모니터링 하는 데에 사용 될 수 있습니다.

이 프로토콜 개발 및 검출을 위한 소설과 맞춤형 단백질 microarray 분석 결과의 검증 및 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답의 반 정량화에 설명합니다. 우리는 성공적으로 우리의 C. 남과 어울리지 않는 사용-특정 항 체 환자 세라1,2, IVIg3, 준비에에서 콘텐츠 구성 bioanalysis 유망한 새로운 툴으로 서 분석 결과 특정 microarray 및 CDI4가난한 결과 연관 항 체 특이성의 식별. 시연 어떻게 biobanked 혈 청 샘플 및 IVIg의 상업적인 준비 microarray 슬라이드에 분석 될 수 있다 C. 남과 어울리지 않는 병원 체 특정 항 체 반응을이 분석 결과의 높은-품질 프로 파일링를 재현할 수 있도록 합니다.
많은 건강 한 아이 들 및 성인 있고 C. 남과 어울리지 않는 독 소 A에 감지 혈 청 IgG와 IgA 항 체 B5,6. 이러한 초기와 성인에서 C. 남과 어울리지 않 는 노출 다음 중 과도 노출 다음 발생 생각 된다. 이러한 이유로, polyclonal IVIg 되었습니다 재발 및 fulminant CDI7,,89치료에 오프 라벨을 사용. 그러나, 그것의 확실 한 역할 그리고 행동의 모드 불분명 남아 있습니다. 몇 가지 연구는 C. 남과 어울리지 않는 독 소를 체액 면역 반응에서 역할을 질병 프레 젠 테이 션 및 결과 나타났습니다. 특히, 무 증상 환자 증상 질병10을 개발 하는 환자에 비해는 증가 혈 청 항 독 소 A IgG 농도 표시. 명백한 협회 중간 항 독 소 A IgG titers 및 30 일 모든 원인 사망11보고 되었습니다. 여러 보고서 또한 독 소 A, B, 그리고 여러 비 독 소 항 (Cwp66, Cwp84, 플, FliD, 및 표면 층 단백질 (SLPs)) 재발과 항 체 응답에 대 한 보호와 연결을 계시 했다12,13 , 14 , 15. 이러한 관측을가 했다가 개발의 첫 번째 수동 immunotherapy 마약 대상 C. 남과 어울리지 않는 독 소 B (bezlotuxumab)는 최근 미국 식품 의약품 안전 청 및 유럽 의약품에 의해 승인 되었습니다 재발 CDI16의 예방을 위한 기관. 사 독 소 또는 재조합 독 소 조각을 사용 하 여 예방 접종 전략은 또한 현재 개발17,,1819에서. 이러한 새로운 치료 접근 의심할 여 지 없이 큰 샘플 크기에 여러 항 원에 체액 성 면역 반응 평가 대 한 요구를 자극할 것 이다.
오늘날, 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답을 동시에 평가 가능 상업적으로 사용 가능한 높은 처리량 분석 실험의 주목할 만한 부족이 있다. 미래 연구 및 임상 응용을 촉진 하기 위하여 이러한 분석을 개발 하는 충족 되지 필요가 있다. 단백질 microarrays는 현미경 슬라이드 기반 표면에 반점의 공간적 조직 배열로20 접촉 또는 비 접촉 될 수 있는 로봇 시스템을 사용 하 여 개별적으로 순화 된 단백질의 많은 수를 무력화 하는 방법 인쇄 도구21. 관광 명소는 세포 lysates, 항 체, 조직 homogenates, 내 인 성 또는 재조합 형 단백질 또는 펩 티 드, 체액 또는 약물22,23등 복잡 한 혼합물을 나타낼 수 있습니다.
단백질 microarray 기술 표준 사내 ELISA 뚜렷한 장점이 안티-C. 남과 어울리지 않는 항 체 응답을 평가 하기 위해 전통적으로 사용 된 기술을 제공 합니다. 이들은 다양 한 단백질 목표, 항 원, 예제 및 시 약에 대 한 요구 사항 감소 볼륨의 더 광범위 한 패널에 대 한 멀티-isotype-특정 항 체를 탐지 하기 위한 용량 증가 및 더 큰 통합 향상된 된 능력 기술 복제 뿐만 아니라 여러 내부 품질 관리 (QC)의 수1를 측정합니다. Microarrays는 따라서 더 정확한, 과민 하 고 재현할 수 있고 큰 동적 범위. 이러한 요인 microarrays는 저렴 하 고 잠재적으로 유리한 대안 ELISAs 알려진된 단백질의 대규모 검색에 대 한 확인합니다. 그러나, microarray 기술의 단점 매우 순화 된 항 원의 패널 구축 및 기술 플랫폼을 설정 관련 된 큰 초기 비용에서 주로 유래한 다.
단백질 microarrays 임상 응용 프로그램에 진단 및 기본 연구 공구로 지난 2 년간 광범위 하 게 사용 되었습니다. 단백질 발현 프로 파일링, 효소-기질 관계, 바이오 마커 검사, 호스트-미생물 상호작용의 분석의 연구 및 항 체 특이성23,24, 프로 파일링을 포함 하는 특정 응용 프로그램 25,26,,2728. 말라리아 (변형 체)29, 에이즈-130,31독감, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)32, 바이러스 성 출혈 성 열33 포함 하 여 많은 새로운 병원 체 단백질/항 microarrays 설립 되었습니다. , herpesviruses34및 결핵35.
현재 프로토콜 쉬운 운영 C. 남과 어울리지 않 는 반응 항 원 microarray 분석 결과, 멀티 isotype 및 c.에 대 한 스트레인 특정 항 체 응답의 정밀, 정확 하 고 특정 정량화를 가능 하 게의 설립에 관한 남과 어울리지 않는 세라와 IVIg polyclonal 항 원. 여기, 우리는 프로필 ELISA 분석 결과 정밀도 및 재현성에 비해 허용 microarray 분석 결과 성능에 관한 대표적인 결과 포함 합니다. 이 분석 결과 다른 임상 샘플 프로 파일링에 더 개발 될 수 있습니다 고 CDI의 분자 기준으로 연구에 대 한 새로운 표준을 설정 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1827px;" width="1826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BioRobotics MicroGrid II arrayer</td>
			<td style="width:296px;">Digilab, Malborough, MA, USA</td>
			<td style="width:296px;">N/A</td>
			<td style="width:836px;">Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanner InnoScan 710.</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAPIX software version 7.2.0</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Measure signal intensities of the spots.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon contact pin</td>
			<td>Parallel Synthesis Technologies</td>
			<td>SMT-P75</td>
			<td>Print the samples onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Nalgene Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41102426</td>
			<td>To store the new and printed slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plate</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>X7022UN</td>
			<td>To prepare the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate cover</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>CLS6570-100EA</td>
			<td>To reduce evaporation of the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminosilane slides</td>
			<td>Schott,&#160; Germany</td>
			<td>1064875</td>
			<td>The slide of choice for printing the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide holders</td>
			<td>GraceBio Labs, USA</td>
			<td>204862</td>
			<td>Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Candida albicans lysate</td>
			<td>NIBSC</td>
			<td>PR-BA117-S</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetanus Toxoid&#160;</td>
			<td>Athens Research and Technology</td>
			<td>04/150</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-1</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-2</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-3</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-4</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-1M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-2M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090713</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3080</td>
			<td>Goat anti- human IgG (&#947;-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9052-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9060-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9210-08&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG4 pFc&#39;-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9190-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3030</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA1-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9130-08</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA2-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9140-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgM-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9020-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 mm syringe filter</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td>Filter the 5% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A7284</td>
			<td>Use 5% BSA for blocking the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody diluent</td>
			<td>Dako, UK</td>
			<td>S3022</td>
			<td>To dilute the serum and the secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Cy5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>SA1011</td>
			<td>Detection of the immune reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb</td>
			<td>University of Bath&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins</td>
			<td>Dublin City University&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vigam (IVIg preparation 1)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Privigen (IVIg preparation 2)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Intratect (IVIg preparation 3)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection

우리Clostridium 남과 어울리지 않는 항 체 수준의 polyclonal 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)의 별도 준비와 인간의 세라에서의 안티-결정에 대 한 소설 높은 처리량 단백질 microarray 분석 결과 대 한 자세한 개요를 제공합니다. 프로토콜 샘플 준비, 배열, 시험 절차, 및 데이터 분석의 인쇄에 관련 된 방법론 단계를 설명합니다. 또한,이 프로토콜 플라즈마를 포함 한 다양 한 임상 샘플을 통합 하 고 문화 supernatants 셀을 더 개발 될 수 있습니다. 우리는 단백질 microarray를 사용 하 여 isotype (IgG, IgA, IgM), 서브 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)의 조합을 결정 하는 방법을 보여 및 스트레인-특정 항 체를 매우 전체 C. 남과 어울리지 않 는 정화 독 소 A와 B (toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, ribotype 087), C. 남과 어울리지 않는 독 소 B만 표현 스트레인 (CCUG 20309)에서 독 소 B, 이진 독 소, pCDTb, ribotype 특정 전체 표면 층 단백질 B 조각의 선구자 형태 (SLPs; 001, 002, 027), 단백질 (파상풍을 제어 사망 toxoid 그리고 Candida albicans)입니다. 실험 기간 동안 microarrays 세라 C. 감염과 (CDI), 낭 성 섬유 증 (CF) 설사, 건강 한 컨트롤 (HC), 없이 개인으로 개인 및 개인 사전 및 포스트 IVIg 치료와 함께 조사 됩니다는 CDI, 결합 된 면역 결핍 장애 및 만성 염증 demyelinating polyradiculopathy의 치료. 우리 환자 단체, IVIg, 그리고 전에 세라의 상업적인 준비와 다음 IVIg 관리 사이 독 소 중립화 신진대사 및 멀티 isotype 특정 항 체 수준에 큰 차이가 발생합니다. 또한, 있다 microarray 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 사이의 중요 한 상관 관계 항 독 소 IgG 수준에 대 한 혈 청 샘플에서. 이러한 결과 microarray 예방 접종 또는 감염 된 인간 C.difficile 항 원에 항 체 응답을 프로 파일링 하기 위해 유망한 도구가 될 수 것이 좋습니다. 항 원 패널과 생산 비용에 있는 감소의 더 수정, 우리는 microarray 기술을 최적화 하 고 환자 별로 C. 감염과 대 한 가장 임상적으로 유용한 immunotherapies를 선택 도움이 될 수 있습니다 예상.

그림 1 설명된 프로토콜의 주요 단계를 설명 하는 순서도를 보여 줍니다. 그림 2 는 상당한 사이 계약 microarray ELISA IgG와 IgA 항 독 소 A와 B 환자 테스트 세라 수준을 보여주는 Spearman 상관 관계 테스트. 그림 3 설사 없이 CF 환자, 설사, CDI 환자와 HC에서 독 소 A, B, 독 소 및 이진 독 (pCDTb)에 대 한 특정 항 체 응답 차동 IgG와 IgA 항 체-클래스를 보여준다. 그림 4 는 C. 남과 어울리지 않는 항 독 소 중화 항 체 응답 환자 세라. 그림 5 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소 및 Slp)에 대하여 면역 반응성 IVIg의 중화 효과 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소)에 대해 보여 줍니다. 그림 6 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소 및 Slp)에 대하여 면역 반응 및 환자 세라 사전 및 포스트 IVIg 관리 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소)에 대 한 중화 효과 보여 줍니다. 표 1 허용 내부 및 남북 assay의 계수 테스트 세라를 사용 하 여 microarray의 다양성을 보여준다. 표 2 에서는 세라와 2 차 항 체에 대 한 최적화 된 희석으로 순화 된 단백질의 관련 농도 함께이 연구에 사용 된 면역 글로불린의 목록을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57399/57399fig1.jpg"> 그림 1 : Microarray 프로토콜에 관련 된 주요 단계에 대 한 일반적인 개요. 첫 번째 단계는 항 원 및 컨트롤의 준비 합니다. 다음 샘플 희석 aminosilane 슬라이드에 quadruplicates에 인쇄 준비 384-접시에 전송 됩니다. 건조 하 고 슬라이드의 차단, 배열 환자 세라와 함께 알을 품는. 씻은 후 추가, 지정된 isotype의 biotinylated 안티 인간 면역 글로불린 (Ig) 추가 됩니다. 최종 세척 및 건조 단계 후 슬라이드를 검색 하 고 결과 이미지 microarray 이미지 분석 소프트웨어와 함께 처리 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57399/57399fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57399/57399fig2.jpg"> 그림 2 : Microarray 및 ELISA 결과 간의 상관 관계. Spearman 상관 계수는 두 플랫폼 간의 계약의 수준을 평가 하기 위해 사용 되었다. 때 내부 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), A로 microarray 성능 비교. 좋은 상관 계수 A의 독 소에 대 한 관찰 되었다 (r = 0.7051; P < 0.0001), B. 그리고 독 소 B에 적당히 좋은 상관 관계 (r = 0.5809; P < 0.0001). 전체 ELISA 프로토콜 되었습니다37다른 상세한. 이 그림 Negm 외 에서 재 인 쇄 되었습니다. 1 허가입니다. <a href="/files/ftp_upload/57399/57399fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57399/57399fig3.jpg"> 그림 3: Isotype-특정 항 체 응답 Clostridium 남과 어울리지 않 는 독 소. 이 이미지는 혈 청 항 독 소 IgG와 IgA 응답 (toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, 087 ribotype; 200 µ g/mL, 독 소 B 100 µ g/mL에서 독 소 A), 뿌리 독 B (C. 남과 어울리지 않는 독 소 B 생산 스트레인 CCUG 20309; 독 소 B 90 µ g/mL)와 B의 선구자 형태 이진 독 소, pCDTb (200 µ g/mL), 낭 성 섬유 증 (CF) 없이 설사, C. 감염과 (CDI)와 설사, 환자와 환자와 건강 한 컨트롤 (HC)의 조각. IgG와 IgA에 대 한 혈 청 희석은 1: 500, 1: 100, 각각. 그룹 간의 차이 여러 반응에 대 한 던의 포스트 hoc 테스트 다음 Kruskal-월리스 테스트를 사용 하 여 평가 됐다. HC와 비교 (n = 17)와 증상 CDI와 환자 (n = 16), 성인 CF 환자 (n = 16) 전시 하는 상당히 높은 수준의 혈 청 IgA 항 독 소 A의 및 B 수준; P 0.05입니다. 동일한 패턴 극복 IgG에 대 한 제외 하 고 그룹 사이 항 독 소 A IgG 수준에 차이가 없었다. 상자와 수염 음모 중앙값, 범위, 및 quartiles를 나타냅니다. P ≤0.0001; P ≤0.01; P 0.05입니다. 표준화 된 신호 면역 글로불린 표준 곡선을 정규화 됩니다. 이 모나 외 에서 재 인 쇄 되었습니다. 2 허가입니다. <a href="/files/ftp_upload/57399/57399fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57399/57399fig4.jpg"> 그림 4: 중화 방 청 항 체 신진대사를 C. 남과 어울리지 않 는 독 소 A와 B 환자 세라에. 이 그림에서는 보호 중화 항 체 (NAb) 응답 C. 남과 어울리지 않는 독 소 A와 B [toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, 087, ribotype 50% 치 사 량 (LD50) 사용]에 세라 (1: 100 희석; 독 A 2.5 ng/mL, 독 소 B 0.5 ng/mL)는 HC에서 설사, 하지 않고 CF와 환자 및 설사와 CDI와 환자. CF 환자에서 세라 세라 HC (독 소 A와 B)에서 CDI (독 소 A)을 가진 환자에서와 비교해 상당히 강한 보호 항 독 소 NAb 응답 전시. 그룹 간의 차이 여러 반응에 대 한 던의 포스트 hoc 테스트 다음 Kruskal-월리스 테스트를 사용 하 여 평가 됐다. 상자와 수염 음모 중앙값, 범위, 및 quartiles를 나타냅니다. P ≤0.01; P 0.05입니다. 이 모나 외 에서 재 인 쇄 되었습니다. 2 허가입니다. <a href="/files/ftp_upload/57399/57399fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57399/57399fig5.jpg"> 그림 5 : 면역 반응 및 C.difficile 항 원에 IVIg의 효과 중화. A. 이 이미지에서는 멀티 isotype의 반응성 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 특정 항 체 상업 정 맥 면역 글로불린 (IVIg) 준비. 열 지도 7 C. 남과 어울리지 않 는 항 [독 소는 (200 µ g에 ( 재료의 표참조) 3 상용 준비에 특정 항 체 isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, 그리고 IgM)의 레벨을 보여줍니다. /mL), 독 소 B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), 독 소 B (CCUG 20309; 90 µ g/mL), 표면 층 단백질 (SLPs) 001, 002, 027 (모든 200 µ g/mL)] 단백질 microarray 기술을 사용 하 여. 열 지도의 색상 코드는 다음과 같습니다: 빨간색 (높은) 신호 강도 (낮은) 녹색. 열 지도 대 한 색 눈금에 표시 신호 값은 임의의 형광 단위 (AFU)에서 log2 변형입니다. 제발 참고 표준화 기술자는 AFU는 대체 최근에2신호. 총 IgG, IgG1, IgG2 isotypes 준 독 A, B, 이진 독 (pCDTb), 독 소에 대 한 높은 바인딩 reactivities 및 독 소 B (CCUG 20309). B. 이러한 플롯 표시에 대 한 네이티브 C. 남과 어울리지 않 는 IVIg 중화 효능 전체 독 소 A와 B 그들은 A와 B. C. 남과 어울리지 않는 독 소에 대 한 상용 IVIg 제품의 보호 무력화 효과의 백분율에 게 각 플롯 triplicate 실험 1: 100 희석에의 중간을 나타냅니다. IVIg 준비 1 전시 IVIg 준비 2, 3, 특히 독 대답에 대 한에 비해 낮은 보호 효과 * * * P ≤0.0001; P 0.05 (단방향 분산 분석) 이 그림 Negm 외 에서 수정 되었습니다. 3 허가입니다. <a href="/files/ftp_upload/57399/57399fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57399/57399fig6.jpg"> 그림 6 : 면역 반응 및 환자의 세라 C. 남과 어울리지 않는 항 원에의 효과 중화. A. 이 그림에서는 C. 남과 어울리지 않 는 단백질에 대 한 항 체 reactivities의 비교 환자 들 세라 IVIg 주입 전후. 열 지도에서는 7 명의 환자에서 혈 청 샘플의 isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, 그리고 IgM) 식 수준 7 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 대 한 IVIg 주입 전후 [한 (200 µ g/mL)의 독 소, 독 소 B (100 µ g / mL), pCDTb (200 µ g/mL), 독 소 B (CCUG 20309; 90 µ g/mL), 및 Slp 001, 002, 027 (모든 200 µ g/mL)] 단백질 microarray 기술을 사용 하 여. 열 지도의 색상 코드는 다음과 같습니다: 빨간색 (높은) 신호 강도 (낮은) 녹색. 열 지도 대 한 색 눈금에 표시 하는 신호 값은 log2는 AFU에서 변형. 표준화 된 신호2는 AFU는 대체 최근에 note 하시기 바랍니다. 독 소 A, B, 독 소 및 pCDTb 총 IgG, IgG1, IgG2, 및 IgG3 reactivities의 포스트 주입 향상이 있었습니다. B.이 화면은 IgG 응답 독 소 A, B, 독 소 및 이진 독 소 (pCDTb), 사전 및 게시물 IVIg 관리. 모든 독 소에 대 한 총 IgG 레벨 표시 (Wilcoxon 서명 순위 테스트를 사용 하 여) IVIg 관리에 따라 크게 증가. 각 플롯 나타냅니다 triplicate 실험의 중간 1시 10분 희석. C. 이러한 플롯에 대 한 네이티브 C. 남과 어울리지 않 는 중화 효과 보여 독 소 A와 B IVIg 관리 다음. 사전 및 포스트 주입 중화 항 체 활동의 비교 IVIg 혼합 네이티브에 대 한 후 향상 된 보호 효과 보여주는 A와 B. C. 남과 어울리지 않는 독 소 각 플롯 나타냅니다 triplicate 실험의 중간 1시 10분 희석. 독 소 A와 B에 대 한 보호 효과가 크게 증가 (Wilcoxon 서명 순위 테스트를 사용 하 여) 환자 세라 테스트 게시물 IVIg 주입 지적 했다. 이 그림 Negm 외에서 재 인 쇄 되었습니다. 3 허가입니다. <a href="/files/ftp_upload/57399/57399fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>재현성</td>
			<td>독 소 A</td>
			<td>독 소 B</td>
			<td>SLP001</td>
			<td>SLP002</td>
			<td>SLP027</td>
			<td>독 소 B CCUG 20309</td>
			<td>
pCDTb</td>
		</tr>
<tr>
<td>내부 분석 결과</td>
			<td>7.70%</td>
			<td>6.40%</td>
			<td>7.40%</td>
			<td>5.10%</td>
			<td>7.60%</td>
			<td>7%</td>
			<td>3.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>간 분석 결과</td>
			<td>9.10%</td>
			<td>9.10%</td>
			<td>7.40%</td>
			<td>11.20%</td>
			<td>12.8</td>
			<td>9.70%</td>
			<td>12.50%</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: Microarray 내부 분석 결과 및 간 분석 결과 정밀 1. Microarray 내부 및 남북 assay variabilities 7 환자의 혈 청을 사용 하 여 계산 했다. 동일한 샘플은 각각 두 개의 독립적인 시간 지점에서 두 슬라이드에 분석 했다. 모든 항 원 (n = 7 테스트 및 n = 2 컨트롤) 각 배열에 5 복제에서 목격 됐다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>순화 된 단백질 농도</td>
			<td>혈 청 희석</td>
			<td>이차 항 체 희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG</td>
			<td>50 μ g/ml</td>
			<td>1/500</td>
			<td>1/20000</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG1</td>
			<td>200 μ g/ml</td>
			<td>1/100</td>
			<td>1/5000</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG2</td>
			<td>200 μ g/ml</td>
			<td>1/100</td>
			<td>1/10000</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG3</td>
			<td>200 μ g/ml</td>
			<td>1/100</td>
			<td>1/5000</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG4</td>
			<td>200 μ g/ml</td>
			<td>1/100</td>
			<td>1/5000</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA</td>
			<td>50 μ g/ml</td>
			<td>1/100</td>
			<td>1/5000</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA1</td>
			<td>200 μ g/ml</td>
			<td>1/100</td>
			<td>1/10000</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA2</td>
			<td>200 μ g/ml</td>
			<td>1/100</td>
			<td>1/5000</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM</td>
			<td>50 μ g/ml</td>
			<td>1/500</td>
			<td>1/20000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 이 연구에 사용 된 면역 글로불린의 목록. Igs는 관련 정제 단백질 농도 (µ g/mL)와 희석 혈 청 및 이차 항 체에 대 한 표시 됩니다.

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A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

이 문서 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 인간 세라 정화 7-플렉스 패널의 체액 면역 반응 높은 프로 파일링에 대 한 간단한 단백질 microarray 메서드를 설명 합니다. Polyclonal 정 맥 면역 글로불린의 준비에 특정 항 체 반응의 결정에 대 한 프로토콜을 확장할 수 있습니다.

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

a-protein-microarray-assay-for-serological-determination-antigen

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

10.0K 조회수.  University of Nottingham. 이 문서 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 인간 세라 정화 7-플렉스 패널의 체액 면역 반응 높은 프로 파일링에 대 한 간단한 단백질 microarray 메서드를 설명 합니다. Polyclonal 정 맥 면역 글로불린의 준비에 특정 항 체 반응의 결정에 대 한 프로토콜을 확장할 수 있습니다.

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Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

연구

면역학 및 감염병학

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

배양 및 유지<em&gt; 클로 스트 리듐 디피</em&gt; 혐기성 환경에서

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

This protocol outlines the cefoperazone mouse model of Clostridium difficile infection (CDI) using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Emphasis on clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol.

의 Cefoperazone 처리 된 마우스 모델 임상 관련<em&gt; 클로스 트리 디움 디피</em&gt; 스트레인 R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

형태 변화를 규명하기위한 프로토콜<em&gt; 클로스 트리 디움 디피 실</em&gt; 항생제 치료에 대한 반응

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...