This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).

인간 PBMC를 1. 분리 <ol><li> 헤파린 혈액 수집 튜브를 사용하여 혈액의 30 ~ 50 ml를 수집. 주 : 사용 된 혈액의 양이 관심 항원 특이 적 B 세포의 혈액에서 특정 실험 질문 빈도에 의존한다. 헤파린 혈액은 즉시 처리 또는 처리 다음날, 실온에서 밤새 부드럽게 흔들 수있다. 처리 지연 농축 효율에 거의 영향을 미치지과 생존을 최소의 손실과 관련된다. </li><li> 전혈 1 믹스 : 1 무균 실온 마그네슘과 칼슘없는 인산 완충 식염수 (PBS)로. </li><li> 50 mL의 멸균 원추형 튜브에 실온 밀도 구배 용액 10 ㎖를 추가한다. 4 ℃에서 어둠 속에서 개방 밀도 구배 병을 저장하지만, 사용 전 실온이. </li><li> 가능하면 느린 설정으로 피펫 총을 설정 및 / 또는 천천히에 아주 작은, 그러나 일관성, 트리거 압력을가두 가지를 혼합하지 않도록주의, 밀도 구배의 상단에 희석 된 혈액의 30 ~ 35 ml의 레이어. 참고 : 희석 된 혈액을 추가하는 것은 일관성있는 꾸준한 흐름을 보장 도움이 될 것입니다 동안 50 ㎖의 가장자리에 피펫의 팁을 배치는 원뿔. </li><li> 브레이크와 20 ° C에서 30 분 동안 400 XG에 원심 분리기이 꺼져. </li><li> 아래의 단핵 세포층을 방해하지 않도록주의, 혈장과 혈소판을 포함하는 상위 계층을 제거합니다. </li><li> 멸균 피펫을 사용하여 단핵 세포 층 (버피 코트)를 수집하고 별도 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치했다. </li><li> 50 ㎖의 부피로 세포 현탁액을 PBS를 추가한다. 브레이크와 20 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 PBS 10ml에 펠렛 세포를 재현 탁. 세포를 카운트하고, 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 생존을 결정합니다. </li><li> 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 10 7 세포 / ㎖와 얼음에 장소를 Resuspend 세포.</li></ol> 세포의 2. 염색 <ol><li> 각 형광 보상 / 해당하는 경우, 필요 FMO 제어 1-2 × 10 6 세포를 제거합니다. 브레이크와 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 세포를 원심 분리기 나머지. </li><li> 3-6 X 107 세포 / ml의 무균 여과 차가운 FACS 완충액 (PBS + 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) + 0.01 %의 아 지드 화 나트륨)에 재현 탁 된 세포 (1.5 mL의 원심 분리 튜브에서 제거). FACS 버퍼가 찬 것을 확인하고 염색 과정을 통해 얼음에 보관하십시오. <ol><li> 분석을 최적화 할 때 사분로 세포 인구 (AD)를 나눕니다. 농축 / 염색의 특이성을 결정하는데 관심을 이용 분획 B 및 C의 항원 특이 적 B 세포를 풍부 분획 A를 사용하여 항원 특이 적 세포의 빈도 수를 결정하고, 사용 분획 D (2.5 이하 2.6 참조) 농축되지 않은 인구는 수익률의 계산을 가능하게하고 배 농축을합니다. </li></ol></li><li> 인간 FcγR 차단 다시 추가얼음 분수 AD에 에이전트는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 방지합니다. 주 : 적절한 조건에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 교차 자성 나노 입자에 결합 된 항 멀리 붉은 형광 염료 항체와 반응 형광 색소를 포함하지 않도록주의, 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 분수의 AD 관심의 표면 항원을 세포에 형광 색소 - 복합 항체를 추가합니다. 참고 :이 근적외선 형광 염료, Cy5에, Cy5.5 및 Cy7 항체 복합체를 포함한다. 추가 된 생존의 얼룩은 고정액의 사용과 호환되어야합니다. 하나 ELISPOT에 의해, 예를 들어, FACS를 이용하여 세포를 분석하고 있지만, 항체 분비 주파수를 결정하고자하지 않는 경우, 항체 표면 염색은 불필요하다. </li><li> 상기 분석의 특이성을 시험 얼음에 30 분 동안 표지 된 항원의 충분한 양 분획 B를 배양 등 그 친 화성을 가진 수용체의 대부분은 적어도10 -6 M이 차단됩니다. 주 : 일반적으로 좋은 출발 농도는 항원의 양의 50 내지 100 배 과량 (예 50-100 μM) 2.6 이하로 충분하다고 판단된다. 비 표지 항원 따라서 풍부한 세포 특이성의 확인을 가능하게하기 단계 2.6에 첨가되는 비오틴 항원에 결합하는이 높은 친화력 모든 B 세포를 차단한다. 이 단계는 상기 단계 2.4과 함께 완료 될 수있다. </li><li> 30 분 동안 얼음 분수 A, B, 및 D 품어에 바이오틴 항원을 추가합니다. 주 : 비 오티 닐화 항원의 농도는 충분한 검출 및 비특이적 와키 세포로부터 세포를 결합 분리를 보장하기 위해 필요한 최적 량을 결정하기 위해 적정한다. 일반적으로 시험에 좋은 시작 농도는 1-5 μM이다. 참고 : 분획 A와 D의 경우,이 단계는 상기 단계 2.4와 동시에 수행 될 수있다. 분수 B의 경우,이 단계는 betw 단계 2.5 (세탁 후 수행해야EEN 단계)는 불필요하다. </li><li> 그러한 streptavidin- 원적외선 형광 염료 및 자성 비드 프로토콜 다른 시약으로 B 세포의 결합을 측정하기 위해 분획 C에서 비 오티 닐화 항원을 생략합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리의 1 ml의 세포 현탁액에 의해 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 최종 세척 후, 5 × 10 7 세포 당 1 ml의 2 % 포름 알데히드에 집중 세포 현탁액을 희석하고 5 분 동안 얼음에 어둠 속에서 앉아 보자. 주 :이 시점에서 세포의 고정은 비 오티 닐화 항원이 절차의 나머지를 위해 BCR 바인딩 유지되도록. 생존 세포 - 예컨대 ELISPOTs 또는 대체 전송에서와 같이 하류 분석을 위해, 정착 단계를 생략. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 두 번 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리기 1 ml의 세포를 씻으십시오. 1 용액에 재현 탁 차가운 FACS는 5 × 10 당 버퍼7 세포. </li><li> 1-2 μg의 스트렙 타비 딘 - 멀리 붉은 형광 염료 / ㎖ 추가 어둠 속에서 20 분 동안 얼음에 품어. 각 애플리케이션에 대한 스트렙 타비 딘의 양을 적정한다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 1 ml의 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리기로 두 번 세포를 씻으십시오. 는 자성 비드를 이용하여 농축을 일으키지 않음으로 분획 D 제제는이 시점에서 종료된다. 주 :이 표본은 샘플의 주파수 및 항원 특이 적 B 세포의 수를 결정하는 데 사용된다. 이는 농축에 의해 달성 농축 배 수율을 결정하는 데 사용됩니다. </li></ol> 3. 자기 나노 입자 기반 심화 <ol><li> 40 μm의 필터를 통해 차가운 분리 버퍼 (PBS + 0.5 % BSA + 2mM의 EDTA) 5 × 10 7 세포 당 패스 1 ㎖의 샘플 AC에서 재현 탁 세포는 열을 방해 할 수있는 덩어리를 제거합니다. </li><li> 안티 Cy5에 / 안티 멀리 붉은 형광 염료 나노 입자를 추가합니다. FO최적의 결과를 R, 나노 입자의 농도를 각각 사용 적정되어야하지만 좋은 출발점이 5 × 107 세포 / ㎖ 당 50 μl의 현탁액이다. 10 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 회전합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 1 ml의 차가운 분리 버퍼로 두 번 씻으십시오. 5 × 107 세포 당 냉 분리 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포. </li></ol> LS 또는 LD 열을 사용하여 4. 자기 심화 <ol><li> 자기 분리기의 자기장에 세 LS 또는 LD 열을 놓고 열을 적시하는 분리 버퍼의 3 ㎖를 추가 (열 유형이 가장 적합한 결정하기 위해 제품 설명을 참조). 3 ml의 컬럼을 통과하여 수집 한 후 폐기 할 수 있습니다. 주의 : 자성 나노 입자 표지 된 세포의 분리는 시판되는 자기 분리 장치의 어느 하나에 이용하여 달성 될 수 있지만, 기관은 TE에서 LS 컬럼의 사용에 가장 성공했다수율, 순도 및 농축 효율의 실효. </li><li> 열 아래에 부정적인 선택 세포 표지 세 15 ML 원뿔 튜브 &quot;분수 A / (B) / (C) 음&quot;을 놓습니다. 각각의 컬럼에 자성 입자를 표지 세포를 추가하고 전체 볼륨이 통과 할 수 있습니다. </li><li> 위에 차가운 분리 버퍼의 3 ㎖를 추가하고이 컬럼을 통과하여 2 ㎖로 반복 할 수 있습니다. 음으로 선택된 세포를 수집하고 얼음에 따로 설정합니다. </li><li> 자기장에서 열을 제거하고 긍정적으로 선택한 셀에 대해 &quot;분수 A / (B) / (C) 긍정적&quot;표시 15 ML 원뿔 튜브의 상단에 배치합니다. </li><li> 제공된 플런저를 사용하여 자기장에 결합 된 세포를 수집하는 컬럼을 통해이 체적을 뛰어 즉시 분리 완충액 약 6 ㎖의 상단에 열을 채우고. </li><li> 순도를 높이기 위해 적극적으로 선택된 셀은 상기 proce을 반복하는 초 청정 컬럼을 사용하여 농축 될 수있다틀리면. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 음과 양으로 선택 분수를 모두 스핀 원하는 최종 부피에서 일시 중지합니다. 이러한 FACS, ELISPOT 또는 입양 전송 등 다운 스트림 분석을 진행합니다. </li></ol>

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	<li>de Wildt, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+analysis+and+production+of+monoclonal+antibody+fragments+originating+from+single+human+B+cells.">A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells.</a> J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).</li><li>Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+and+arrangement+on+fibers,+beads,+and+surfaces.">Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).</li><li>Haas, W., Schrader, J. 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The authors declare they have no competing financial interests.

여기에서 우리는 고립과 인간의 말초 혈액에서 항원 결합 B 세포의 농축을 달성하기 위해 새로운 방법을 설명합니다. 상기 방법은 생쥐 비장 및 림프절과 같은 다른 조직을 용이하게 적용 가능하며, 세포의 표현형 및 기능 (준비 원고)의 후 농축 분석과 호환된다. 사용자는이 절차의 성공에 영향을 미칠 수있는 변수의 수를 인식해야한다. 경험에서 죽은 세포가 아닌 특정 증가 배경을 선도, 자기 구슬에 충실하고 같은 스트렙 타비 딘 - 원적외선 형광 염료 형광 염료를, &quot;차지&quot;하는 경향이있다. 이 절차를 시작하기 전에 가능한 한 샘플에서 많은 죽은 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 분석에서 게이트 밖으로 사균 라이브 / 죽은 차별 활성화 얼룩의 사용은 유용 할 수 있지만, 사균의 존재가 셀에 주파수를 분비하는 항체 분석법 해석을 손상 할 수 있고입양 전송 다음 함수. 또, 추가 된 비 오티 닐화 항원에주의 적정 항원 특이 및 비 - 특이 적 결합의 구별에 필수적인 것을 발견 하였다. 너무 많은 항원이 거짓 긍정적 인 탐지 / 농축을 일으킬 수있는 반면 너무 적은 항원의 사용은, 항원 결합 세포의 주파수의 과소 평가로 이어질 것입니다. 너무 높은 일이다 항원 농도의 사용은 샘플 비 B 세포에 결합 명백 의해 표시 될 수있다. 또한, 과도하게 높은 주파수 항원 (&gt; 1 %)의 겉보기 검출 반응성 세포 특이성 문제를 결합하는 표시 일 수있다. 사용하는 항원의 최적 량을 결정하는 궁극적 인 목적은, 생리 학적 농도에서 이러한 본 것보다 조금 더 항원을 추가하는 것을 &lt;10-6 M의 친 화성, 예를 들면, 대와 B 세포 수용체의 대부분 항원 포화된다. 이 항원 특이 적 B 세포 (B)임을 보장병원성 잠재력을 가지고 친 화성 검출 eing입니다. BCRS의 항원 직업 감소에 또는 생리 학적 농도 이하, 즉 너무 적은 항원의 첨가로 인해 거의 항원 특이적인 B 세포의 검출 될 수 있습니다. 한편, 지금까지 생리 학적 농도를 초과 너무 항원의 첨가는 항원 (&gt; 10-6 M)에 대한 낮은 친 화성 B 세포를 포함하고 실제로 항원 무지되는 증가 된 비 - 특이 적 결합을 초래할 수 생체있다. 따라서, 먼저 유일하고 진정한 항원 반응 B 세포가 검출되고 있음을 확신하기 위해 몇 로그에 걸쳐 바이오틴 항원을 적정하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 우리는 배경을 증가시킬 수 있습니다 너무 많은 스트렙 타비 딘 - 멀리 붉은 형광 염료의 사용을 발견했다. 이 항원의 바이오 틸는 항원 에피토프의 가용성에 영향을 미칠 수있는 유의하는 것도 중요합니다. 따라서, 다른 바이오 틸를 사용하여 최적화 충족hods은 중요 할 수있다. 대안 비오틴 차 아민, 삼차 아민, sulfhydryls 또는 카르복실기에 커플 링 될 수있다. 확장 된 스페이서 아암 길이의 사용은 입체 장애를 감소시킴으로써 에피토프의 유용성을 향상시킬 수있다. 이 기술의 한계 중 하나는 새로운 세포에 비해 냉동 보존에서 항원 - B 세포 농축에 대한 감소 된 효과이다. 이것은 큰 세포 사멸 및 냉동 샘플 연관된 &quot;끈적임&quot;관련 있었다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 고정 된 샘플들에 적용 할 수 있지만, 직접 신선한 냉동 세포 농축 및 분석 결과를 비교할 수없는 가능성 중요하다. 또 다른 한계는 농축 된 시료 중의 항원 특이 적 B 세포의 순도이다. 경험에서, 일부 셀들은 항상 존재하는 &quot;함께 태그&quot;되는 비특이적 B 세포와 T 세포를 모두 포함한다. 이 풍부하게하려고에 셀 인구의 희귀 주어진 예상한다. t의 그러나, 순도그 세포 또는 항원 특이 적 B 세포를 FACS 분류하여 단일 세포 현탁액은 새로운 열의 두 번째 농축, 컬럼에 셀을 추가하기 전에 얻어지는 것을 보장함으로써 증가 될 수있다. 조사의 유형에 따라 옵션을 결정할 수 연구원 최선인지 것이 필요하다. 우리는이 기술을 최적화 된 바와 같이 우리는 항원의 적정 또는 염색 강도에 따라 선호도가 낮은 항원 반응 세포에 비해 높은 친화력의 차별 의무가 될 것이라고 상상. 항원에 대한 친화도의 1000 배의 차이까지 동일하게이 방법을 사용하여 7로 농축 하였다 그러나, 이전의 연구에서, 우리는 항원 - 반응성 B 세포를 나타내었다. 선호도의 지식이 연구에 적절한 경우에 따라서 발현 재조합 항원 수용체의 표면 플라스 몬 공명 분석을 이용하여 농축 된 세포의 친화도의 형식적 측정이 요구된다. 이 기술에 내재 리터입니다비오틴 스트렙 항원의 첨가는 BCR 가교하여 세포를 활성화 할 수있는 모조. 이는 휴식 제어 자극 세포를 비교하기 위해 노력하는 것과 같은 특정 하류 기능 분석에 대한 문제를 제기 할 수있다. 이 문제는 신호의 전달을 방지하는 저온 제어 샘플들을 유지함으로써 완화 될 수있다. BCR 신호가 지속적 생물학적 반응에 영향을 미칠 수 있다는 것도 가능하다. 시험 관내에서 세포를 T로 제시 세포 항원 및 마우스에 대체 전송 후에 ELISPOT 분석 (도 3b) 및 기능에 의해 표시된 바와 같이 환경에서 항원 - 농후 셀 (데이터는 도시하지 않음) 항체를 분비하는 능력을 유지한다. 이 기술에 대한 최종 제약 안티 fluorochome 항체의 사용은 항원 흡착 세포에 결합 된 나노 입자를 달성하는 것이다. 안티 멀리 붉은 형광 염료는 Cy7 및 Cy5.5 포함하여 특정 구조적으로 관련 형광 색소와 상호 반응한다. 이 O 옵션을 제한 할 수 있습니다표현형 마커의 측정에 사용할 수 F 항체 접합체. 그러나, 새로운 형광 색소의 증가 가용성,이 문제가 덜되고있다. 이러한 검출 및 농축 방법을 사용하여 용이하게 생체 외 말초 혈, 비장, 또는 다른 조직에 항원 - 결합 B 세포를 식별 할 수있다. 이 방법은 외부 항원에 대한자가 면역 질환의 설정에서 예방 접종 또는 노출 된 후 항원 반응 세포의 면역 반응을 연구에 특히 유용하다. 항원 반응성 B 세포를 검출 할 수있는 방법은 결점이없는 것으로 증명되지 않았지만, 이러한 방법은 빠르고 간단하고, 하류의 다양한 결합 될 수 항원 반응성 세포의 비교적 높은 순도, 수율 및 농축을 생산 분석. 또한,이 방법의 기본 원리로 인해이 절차에 쉽게 실험의 다양한 요구에 맞추어 질 수있다.

제한 희석하여 항체 - 분비 세포의 전구체 빈도 분석은 특정 항원에 대한 반응성 B 세포는 통상적으로 접종 상태 및 항원 상에 존재하는 항원의 크기 / 수에 따라, 통상의 레퍼토리 0.05 % 내지 0.005의 주파수에서 발생하는 것을 제안했다. 이러한 세포의 낮은 주파수는 어려운 등 외국 항원, 또는자가 면역의 개발 기간 동안 다음과 같은 예방 접종 또는 노출과 같은 면역 반응의 개발 기간 동안 자신의 상태 변화를 연구했다. 이전 연구자가 항원 - 코팅 된 적혈구 리셋 항원 코팅 된 플레이트 또는 열 흡착제로부터 레인 징 기술을 사용하여 항원 - 반응성 B 세포의 분리 맡은 1, 2, 3, 4, 5, 6 정렬 셀을 형광 - 활성화. Thoug이러한 기술은 항원 - 반응성 B 세포를 식별 분리에 성공했다 (H)는, 그 결과 수율, 순도 및 확장 성면에서 다양하다. 최근에 우리는 모두 감지하고 자기 나노 입자를 사용하여 희귀 한 B 림프구의 소집단을 풍부하게 할 수있는 새로운 방법을 개발했다. 이 방법은 큰 시작 인구에서 상대적으로 높은 수율과 순도 농축 수, 항원에 대한 반응의 분석과 호환됩니다. 현탁액 중의 세포의 집단에서 농축함으로써, 상기 방법은 항원 - 코팅 된 플레이트 또는 열 및 제한 처리량의 구조와 관련된 제약을 제거한다. 농축 된 세포가 항원과 형광 리포터와 관련된 남아 보낸 마지막으로, 이들은 더 FACS 분류에 의해 정제 할 수있다. 여기에 설명 된 바와 같이 우리는 다양한 autoi와 과목에서이 전 말초 혈액 파상풍 톡소이드 반응성 B 세포의 연구와 인체의 다음과 같은 예방 접종에 대한 접근뿐만 아니라,자가 항원 반응 B 세포를 사용했다제 1 형 당뇨병, 그레이브스 병, 하시모토 병 (7)을 포함 mmune 장애. 상기 방법은 마우스 및 인간에서 동일하게 작동하며, 다양한 조직 (제조에서 원고)에서 항원 - 반응성 B 세포 분석과 호환된다. 기본적인 형태로, 말초 혈 단핵 세포를 제 표현형 분석에 필요한 표면 항원 셀하는 항체와 함께 비오틴 항원과 함께 배양된다. 이 라벨링 단계는 세척 및 고정을 한 세포를 결합 오티 닐화 항원 (도 1)의 검출 원적외선 형광 색소에 결합 된 스트렙 타비 딘을 첨가하여된다. 이전 연구와 유사한 방식으로 항원 특이 적 B 세포를 확인했지만하여 항원 직접 형광 색소 8, 9, 10, 11에 접합. 이 가치이지만방법은 스트렙 타비 딘과 함께 오티 닐화 항원의 사용은 항원 12, 13, 14 작을 때 특히 큰 신호 증폭 (결합 및 비 결합 따라서 세포보다 분화)을 가능하게한다. 추가적인 고려는 스트렙 타비 딘 대신 스트렙 아비딘이 탈글 라이코 실화 때문에, 비특이적 결합을 감소의 사용이다. 또한, 우리는 때문에, 양자 수율 (밝기)의 광 안정성, 그리고 작은 크기 (~ 1.3 kD의)에 형광 색소까지 붉은 형광 염료를 사용합니다. 그들은 잠재적으로 많은 항원 에피토프를 포함하기 때문에 단백질 등의 피코 에리 트린과 같은 형광 색소 (~ 250 kD의)와 알로 (~ 105 kD의) (15)는 최적되지 않습니다. 이러한 원적외선 형광 염료 단일 에피토프로 구성된 작은 유기 형광 염료의 사용은 분리 된 세포 집단의 복잡성을 감소시킨다. 세포가되면 바이오틴-Antigen과 멀리 붉은 형광 염료 스트렙 타비 딘 흡착는, 그들은 안티 - 원적외선 형광 염료 복합 자성 나노 입자를 사용하여 농축된다. 단일 나노 입자는 대부분의 유동 세포 계측기에 의해 검출되지 않고, 따라서 정렬 하류 FACS 분석 (16)에 의해 정제하기 전에 제거 할 필요가 없다. 항원 특이 적 B 세포의 자기 선택은 시간 및 플로우 사이토 미터를 사용하여 희귀 이벤트를 분류 비용을 제거 관심 집단을 풍부. 우리는 이전과 칠일 파상풍 톡소이드 부스터 예방 접종 후 대상에서 파상풍 톡소이드 - 특정 B 세포의 농축 대표 결과를 보여 아래. 우리 생체 자극 급성 다음 항원 특이 적 B 세포 농축이 방법의 기능을 설명하기 위해 예로서, 특정 프로그램을 선택했다. 유동 세포 계측법에 결합하면,이 방법은 농후하고 분화 항원 특이 나이브 메모리 할 수 ​​있고,plasmablast B 세포와는 연구자가 시간이 지남에 따라 빈도의 변화를 수행 할 수 있습니다. 또, 예를 들면 세포가 농축 다음 항체를 분비하는 능력을 유지하는 것을 보여주는 ELISPOT 분석, 다른 가능한 하류 분석을 포함한다. 이 방법의 또 다른 응용 프로그램은 호스트에 풍부한 세포의 입양 전송을 포함 할 수있다. 우리는 이전에 세포를 분리 및 전송 다음 항원 특이 적 T 세포에 항원 제시 세포로 역할을 할 수있는 능력을 유지 보였다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 함께 항원 특이 적 면역 반응의 이해를 알리는 방법으로 결합 될 수있는 가능한 하류 분석법 수있다. 우리는 전체 수율, 순도, 세포의 특이성을 결정하고, 배 농축을하는 컨트롤을 포함하는 방법을 설명했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="height:99px;width:164px;">Antigen of interest</td>
			<td style="width:104px;">variable</td>
			<td style="width:131px;">variable</td>
			<td style="width:196px;">At least 100 &#956;g to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier&#160; protein free.</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="118" style="height:118px;width:164px;">Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">e.g. Thermo Scientific</td>
			<td style="width:131px;">e.g. 21335</td>
			<td style="width:196px;">Biotin is available in different formulations, such as those containing&#160; various length spacers, so the type used should be determined by the researcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Streptavidin-Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">S21374</td>
			<td style="width:196px;">Can obtain from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:164px;">Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">130-091-395</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:164px;">LS Columns</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">130-042-401</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">MACS manual separators</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">variable</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;">Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:164px;">PBS without calcium and magnesium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:164px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:104px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:164px;">Whole blood in heparinized collection tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:164px;">FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:164px;">Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:164px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:164px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:164px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:164px;">Surface marker&#160; reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:164px;">ELISPOT supplies, if needed</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and enrichment of rare antigen-specific b cells for analysis of phenotype and function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

순도, 수율 분석 및 배 농축 유동 세포 계측법을 사용하여 필연적으로 streptavidin- 멀리 붉은 형광 염료를 결합하지 않은하지만 매트릭스에 갇혀있다 오염 세포를 포함하는 전술 한 바와 같이 풍부한 인구. 이러한 불순물은 FACS 정렬하여 풍부한 인구에서 제거 할 수 있습니다. 풍부한 인구의 순도를 평가하기 위해, 살아있는 세포에 게이트 앞으로 기반 및 측면 분산 및 / 또는 라이브 / 죽은 얼룩과 멀리 붉은 형광 염료 + 세포 주파수를 분석 할 수 있습니다. 후자의 게이트 내의 비율이 순도를 나타낸다. 이러한 세포의 특이성 항원 친화 추가 분석 클로닝 및 발현 된 면역 글로불린 유전자 서열의 재조합 항체 생산을 분석 하였다 단셀 FACS 정렬을 필요로한다. 수율 격리 antige의 개수를 나타낸다출발 인구 (분획 D)의 수에 대하여 분획에서 회수 된 B 세포를 N 결합. 동일한 수의 셀이 분획 A에는 분획 D에 있었던 이후 하나 직접 수율 (분획 항원 결합 B 세포 분획 D에서 항원 - 결합 B 셀 ÷ 번호 중 #)를 결정할 수있다. 접어 농축 (E)는 &quot;양&quot;풍부한 분획 원적외선 형광 염료 + B 세포의 비율이 값에 의해 달성 항원 특이 적 B 세포의 비례 증가를 나타내는 분획 D.있는 것과 대하여 반사되고 나노 입자 농축. 이 값은 다음 식을 이용하여 구할 수있다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55382/55382eq1.jpg" /> 이 기술을 보여주기 위해, 우리는 모델로 파상풍 톡소이드 (테트 - 독극물)을 사용하여 얻은 대표적인 결과를 보여항원을 감지하고 변화하는 시점에서 파상풍 예방 접종을 한 환자의 말초 혈액에서 테트 - 독극물 반응 B 세포에 대한 풍부합니다. 도 1에있어서, 상기 항원 흡착제의 개략도이다. 도 2a는 10 년 전보다 더 파상풍 예방 접종을 마지막으로 개인의 테트 - 독극물 반응 B 세포의 빈도를 보여줍니다. 도시 우리가 주위에서 결합 세포를 풍부하게 할 수있는이 예에서, 분수 A 및 따라서 분수 D.에서 테트 - 독극물 특정 B 세포의 기본 주파수에서 인구 ( &quot;음&quot;)이 풍부 ( &quot;긍정적&quot;) 및 고갈 7 배와는 농축 비율 4 %의 순도를 달성했다. 그림 2B 3 년 전 ~ 예방 접종을했다 주제의 혈액을 사용하여 반응의 특이성을 보여줍니다. 우리는 되어온 전에 셀에 레이블이없는 파상풍 톡소이드의 50 배 초과 (50 μM)를 추가 할 때비오틴 항원 (분수 B)의 이온은 우리가 결합 항원의 특이성을 보여, 83 %가 결합 차단할 수 있습니다. 우리는 절차 (분수 C)에서 바이오틴 항원, B 세포 여전히 바인딩의 작은 숫자 (~ 0.2 %)을 생략하는 경우; B 세포의 작은 부분이 아마도 예컨대 스트렙 타비 딘 원적외선 형광 염료, 항 원적외선 형광 염료 항체 또는 자성 비드, 흡착제에 일부 비 - 항원 결합 반영한다. 부스터 후 우리는 그림 3 순진, 메모리 테트 - 독극물 특정 B 세포의 주파수에 표시 항원 결합 세포 표현형 다음과 같은 예방 접종의 변화, 그리고 전에 그린 혈액 plasmablast 인구 7 일을 분석하는 방법의 사용을 설명하기 위해 건강한 환자의 예방 접종. 총 테트 - 톡스 바인딩 B 세포 중에서 나이브 B 세포의 비율은 과급 후 64 %로 84 %로 감소하는 동안의 비율 memor총 구정 독극물 반응 세포 사이에 y를 plasmablast 인구는 각각 40 % 36 % 0 % 16 % 증가. 도 3b는 7 일 후 부스트 건강한 대상에서 말초 혈액 대표 ELISPOT 데이터를 보여줍니다. 테트 - 독극물 결합 B 세포의 분리는 파상풍 톡소이드 항체를 분비하는 세포 주파수의 4 배 농축되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55382/55382fig1.jpg" /> 그림 1 : 탐지 및 B 세포 - 결합 파상풍 톡소이드 (구정 독극물)의 농축을위한 방법. 테트 - 독극물 결합 B 세포의 농축 및 분리를위한 (A) 프로토콜. 테트 - 톡스 바인딩 B 세포를 식별하고 풍부하게 사용될 흡착제 (B) 다이어그램. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55382/55382fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> N-페이지 = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55382/55382fig2.jpg" /> 그림 2 : 구정 인간의 말초 혈액에서 B 세포를 독극물이 결합의 농축을 보여주는 대표적인 cytograms. 농축의 (A) Cytograms 및 분수 A와 마지막 예방 접종&gt; 십년 이전에 정상적인 주제에서 분수 D에서 총 테트 - 독극물 반응 B 세포로부터 고갈 구정 독극물 반응 B 세포. 50 μM의 초과와 미리 배양 한 후 A (분수 A) 3 년 전 ~ 예방 접종과 같은 풍부한 주제에서 &quot;긍정적 인&quot;인구에서 PBMC를의 (B) Cytograms는 구정-TOX (분수 B)를 레이블이 지정되지 않은, 또는 농축 절차 (분수 C) 동안 생략 테트 - 독극물 비오틴과 함께. 모든 분석은 CD19 + 림프구에 문이 있었다. 백분율은 마지막 부분에있는 모든 B 세포 (CD19 +)의 테트 - 독극물이 결합 세포의 비율을 나타냅니다.ANK &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55382/55382fig3.jpg" /> 그림 3 : 항원 결합 세포의 후 농축 분석의 예. 테트 - 톡스 바인딩 B 세포 농축 다음 세포 표현형 (A) 주제 유세포 분석. 메모리 (CD27의 +)와 B 세포 전에 피사체의 소집단 및 파상풍에 대한 부스터 접종 후 7 일 plasmablasts (CD27 + CD38 ++) - Cytograms은 (CD27) 테트 - 독극물 반응 순진한의 식별 및 분석을 묘사한다. 모든 세포는 풍부한 &quot;긍정적 인&quot;인구에서 CD19 + 림프구에 문이 있었다. (B) 칠일 보 후의 건강한 환자의 말초 혈액으로부터 농축 고갈, 총 농축되지 않은 B 세포 분획의 세포 분비 된 항체의 대표적인 ELISPOT 분석OST. ELISPOT 분석을 위해, 96- 웰 플레이트의 웰 제 파상풍 톡소이드로 10 μg의 / ㎖의 용액으로 코팅 하였다. 세포 현탁액의 두 배 연속 희석는, 농축 고갈, 총 농축되지 않은 분수에서 동일 농도에서 세포로 시작 (접시에서) 우물에서 만들어졌다. 항 파상풍 항체를 분비하는 세포는 스트렙 타비 딘-AP 다음 바이오틴 안티 - 인간 IgG (H &amp; L)로 검출되었다. 플레이트를 ELISPOT 개발 완충액으로 개발되었으며 반응물 O. 선형 범위의 셀 희석 스폿의 수가 결정되었다 이중 증류 H 2 플레이트를 세 번 세척하여 정지시키고,의 ASC의 수를 계산 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55382/55382fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

detection-enrichment-rare-antigen-specific-b-cells-for-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K 조회수.  University of Colorado School of Medicine.  기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다. 

비디오: Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

연구

면역학 및 감염병학

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...