이 연구는 대만 (사역의 과학 및 기술, 가장 100-2923-B-002-002-MY3 하 고 H.J.L.를 106-2313-B-002-011-MY3)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 체코 공화국 (부여 기관 남쪽 보 헤 미아 대학 GAJU 부여 065/2017/P Y.H.L), 및 스페인 ( 스페인 경제와 경쟁력, CGL2012-36251 및 CGL2015-64727-P X.B., 그리고 카탈루냐어 정부에 부여 부여 2014 SGR 619 X.B.); 그것은 또한 경제 및 지역 개발 (X.B. 페더 자금)에 대 한 유럽 기금에서의 재정 지원을 받았다.

1. 합성 및 dsRNA의 준비
<ol><li>대상 유전자의 3' 되지 않은 지역에 dsRNA 대상 사이트를 식별 합니다. Α-tubulin (욕조) 유전자를 대상으로 사용 되는 dsTub (은행 승인 번호: KX228233), 그리고 dsEGFP의 순서에서 부정적인 dsRNA 제어 설계 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP; 은행 승인 번호: LC311024).</li>
	<li>T7 발기인 순서를 포함 하는 유전자 특정 뇌관으로 dsRNA 템플릿 합성 표준 PCR 증폭을 수행 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). 린 외PCR 증폭 조건 및 사용 되는 뇌관 정보 그 보고 있습니다. (2017) 12 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>DsRNA 준비 T7 전사를 사용 하 여 계속 키트 ( 재료의 표참조), 제조업체의 지침에 따라. 참고: 높은 수량 dsRNA를, (총 40 µ L)에서 1 개의 관에 2 개의 반응을 혼합 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>2 µ L DNase의 추가 ( 재료의 표참조) 다이제스트 DNA 템플릿에 37 ° C에서 15 분 동안 dsRNA 샘플으로.</li>
	<li>추가 200 µ L 추출 시 약 ( 재료의 표참조) 40 µ L 클로 프롬, 그리고 소용돌이.</li>
	<li>4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 동안 centrifuge 다음 새로운 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 (150 µ L)를 수집 합니다.</li>
	<li>150 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 얼음에 15 분 동안 잠복기 여 dsRNA를 침전.</li>
	<li>4 ° C에서 13000 x g에서 15 분 동안 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>DsRNA 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>에탄올을 제거 하 고 에탄올 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>에탄올과 3 분 동안 원심 진공 집중 하 여 펠 렛 건조 dsRNA 다음 RNase 무료 물 dsRNA를 resuspend.</li>
	<li>마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 순화 dsRNA의 수량을 결정 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라 고 원하는 농도 (예를 들면,의 준비를 위해 µ 0.25 µ g/L dsRNA lipoplexes)입니다.</li>
	<li>최대 3 개월 동안-20 ° C에서 dsRNA 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>2입니다. dsRNA Lipoplexes의 준비
<ol><li>Transfection 시 약의 4 µ L를 희석 ( 재료의 표참조) 5% 포도 당 솔루션의 4 µ L을 추가 하 여. 5% 포도 당 솔루션의 4 µ L을 추가 하 여 (1 µ g) dsRNA의 4 µ L를 희석.</li>
	<li>추가 희석된 liposome 시 약 해결책 즉시 희석된 dsRNA 솔루션으로 한 번에. 짧게 그들을 혼합 하 25 ° c.에 15 분 동안 품 어 소용돌이 참고: 역순으로 솔루션을 혼합 하지 마십시오.</li>
	<li>DsRNA lipoplexes 사용 하기 위해 준비가 되었습니다. 준비, 1 시간 이내 사용 하 고 1 시간 후 삭제. 참고: 제조업체의 지침에 따라 lipoplexes는 가능한 빨리 사용 되어야 한다.</li>
</ol>3. Hemolymph Midgut 주스에서 세포 외 효소의 수집
<ol><li>
곤충 염 분 버퍼 (10 x 주식)
	<ol>
<li>두 배 증류수 109.3 g NaCl, KCl 15.7 g, 6.3 g CaCl2와 8.3 g MgCl2·6H2o. 900 mL를 혼합</li>
		<li>PH 6.8를 조정 하 고 최대 1000 mL를 채우기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hemolymph 컬렉션
	<ol>
<li>그들은 3 분 동안 이동 하지 않습니다 때까지 얼음에 바퀴벌레를 anesthetize.</li>
		<li>바퀴벌레 (엄지와 검지 손가락), 두 손가락으로 누른 바퀴벌레의 복 부 측을 올려.</li>
		<li>해가 위를 사용 하 여 뒷 다리의 고관절의 끝을 잘라. 참고: 고관절 및 trochanter 사이의 연결된 교차로 잘라. 고관절의 다른 부분의 절단 hemolymph를 수집 하는 비효율적 이었다.</li>
		<li>부드럽게 가운데 손가락으로 복 부를 짜 내 고 10 µ L micropipette 절 개에서 출혈 하는 hemolymph를 수집 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브에 여러 바퀴벌레 (5 개인)에서 hemolymph를 풀. 참고: Microcentrifuge 튜브 melanization를 방지 하기 위해 얼음에 계속. 남성 바퀴벌레에서 얻은 hemolymph의 평균 볼륨 2-3 µ L 이다.</li>
		<li>10 대 벤치탑 분리기와 짧게는 hemolymph 아래로 회전 s.</li>
		<li>원하는 볼륨 (즉, 10 µ L), hemolymph의 전송 및 1 x 곤충 염 분 버퍼의 50 µ L을 혼합.</li>
		<li>Hemocytes 아래로 회전 하 4 ° C에서 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.</li>
		<li>A28015를 측정 하 여 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 총 단백질 농도 계량.</li>
		<li>동일한 단백질 농도 (6 mg / µ L의 총 단백질)을 각 샘플을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Midgut 주스 컬렉션
	<ol>
<li>얼음에 바퀴벌레 anesthetize 바퀴벌레 복 부 측을 수정 해 부 접시에 찬 1 x 곤충 염 분 버퍼 곤충 핀을 사용 하 여 합니다.</li>
		<li>고급 핀셋으로 복 부를 해 부. 전체 소화 관 (앞, 중간, 그리고 뒷 창 자 포함) 곤충 염 분 버퍼 x 1 신선한 요리를 제거 합니다.</li>
		<li>전면 및 뒷 창 자 제거 하 고 신속 하 게 100 µ L 곤충 염 분 버퍼를 포함 하는 microcentrifuge 튜브는 midgut 전송.</li>
		<li>수영장 6 바퀴벌레 같은 튜브 및 10에 대 한 소용돌이에서 midguts s.</li>
		<li>Hemocytes 및 창 자 조직 회전 하 4 ° C에서 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.</li>
		<li>A28015를 측정 하 여 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 총 단백질 농도 계량.</li>
		<li>동일한 단백질 농도 (6 mg / µ L의 총 단백질)을 각 샘플을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. dsRNA 저하 분석 결과
<ol><li>갓 벗은 dsRNA의 dsRNA lipoplexes (1 µ g) 4 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>믹스 hemolymph, 또는 midgut dsRNA 솔루션 곤충 염 분 버퍼 (제어)의 10 µ L 추출 효소 주스.</li>
	<li>EGTA (20mm) 또는 RNase 무료 물 효소 활동의 저해에 대 한 컨트롤 샘플을 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1 시간 또는 더 많은 (6, 12, 또는 24 시간) 25 ° c.에 품 어</li>
	<li>200 µ L 추출 시 약 및 40 µ L 클로 프롬, 소용돌이 다음을 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 동안 centrifuge 다음 새로운 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 (150 µ L)를 수집 합니다.</li>
	<li>150 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 얼음에 15 분 동안 잠복기 여 dsRNA를 침전.</li>
	<li>4 ° C에서 13000 x g에서 15 분 동안 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>DsRNA 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>에탄올을 제거 하 고 에탄올 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>에탄올과 10 µ L RNase 무료 물으로 3 분 Resuspend dsRNA에 대 한 원심 진공 집중 하 여 펠 렛 건조 dsRNA 제거 합니다.</li>
	<li>1.5 %agarose 젤에 젤 전기 이동 법을 통해 치료 dsRNA의 무결성을 확인 하십시오.</li>
</ol>5. 구강 관리 dsRNA의
<ol><li>건조 식품 (차 개)의 광고 libitum 다이어트 바퀴벌레를 유지 합니다. 바퀴벌레에서 물 공급을 하루 dsRNA 섭취 실험 전에 박탈.</li>
	<li>유연한 집게 (그림 1, 5 단계)와 함께 그것의 날개를 잡아 하 여 바퀴벌레를 잡아. 참고: 바퀴벌레의 신체 부위를 잡아 하지 마십시오.</li>
	<li>준비는 dsRNA lipoplexes, 뿐만 아니라 벌 거 벗은 dsRNA, 먹이, 단원 2에서에서 설명한 대로. 참고: DsRNA lipoplexes 먹이 기 전에 갓 준비 되어야 한다.</li>
	<li>DsRNA lipoplexes 또는 벌 거 벗은 dsRNA의 4 µ L를 피드 (250 ng)는 micropipette와.</li>
	<li>천천히 피펫으로 dsRNA 솔루션의 방울, 바퀴벌레의 mouthparts에 가까운 고 바퀴벌레는 물방울을 완전히 섭취.</li>
	<li>8 일 또는 16 일 지속적으로 섭취 실험을 하루에 두 번 (1 시간 후에 빛 고을 조명 하기 전에 1 시간)을 수행 합니다. 참고: 모든 바퀴벌레는 물만 섭취 실험 동안 dsRNA 해결책 또는 제어 시 약 (예를 들어, nuclease 무료 물, 포도 당 솔루션 및 liposome 시 약)와 수동 먹이 통해 인수.</li>
	<li>DsRNA 실험의 섭취의 16 일 후 바퀴벌레에 물병을 제공 합니다.</li>
</ol>6. 최저 평가
<ol><li>선택한 시간에 포인트 (2, 9, 17 일 dsRNA 섭취 분석 결과 후), dsEGFP 및 dsTub 처리 곤충을 수집 하 고 (예를 들어, midgut) 선택한 조직 해 부.</li>
	<li>실시간 양이 많은 PCR (qRT-PCR)을 수행 합니다. QRT-PCR 증폭 조건 및 뇌관 정보 린 외에서 보고. (2017) 12.</li>
	<li>평가 dsRNA 치료 곤충 매일 사망률을 확인 하 고는 더 이상 바퀴벌레를 제거 하 고 제어 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicing+and+slicing:+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway.">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li><li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+permethrin+susceptibility+by+glutathione+S-transferase+(BgGSTD1)+in+the+German+cockroach+(Blattella+germanica).">Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica).</a> J. 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저자는 공개 없다.

이 프로토콜은 독일 바퀴벌레의 midgut 주스에서 ribonuclease 소화에 대 한 보호를 포함 하는 dsRNA lipoplexes의 구두 배달을 통해 효과적인 RNAi에는 메서드를 제공 합니다. 다양 한 곤충 종에 다른 연구에서와 같이, 구두 전달의 dsRNA 통해 가난한 RNAi 효과 대부분 차지 dsRNA8,,910의 저하에 의해. 이 프로토콜은 구두 전달의 dsRNA에에서 저하에 대 한 보호 차량으로 봉사 하는 리를 생성 합니다. 또한, dsRNA lipoplexes의 준비는 간단 하 고 쉽게 구강 RNAi로 적용 특히 곤충에에서 강한 ribonuclease 활동에 대 한.
다른 곤충10,,1819에 상대적으로 많은 양의 알몸 dsRNA 피드 다른 연구에 비해,이 프로토콜 사용 하면 dsRNA (하루 0.5 µ g), 상대적으로 낮은 금액의 구강 관리는 B. germanica의 midgut에 대상 유전자 발현의 상당한 고갈. 프로토콜의 중요 한 측면에는 정확한 수 유 방법 및 적은 양의 dsRNA의 축적 된 섭취 포함 됩니다. 첫째, 먹이 기술은 지속적인 섭취 분석 결과 적합 하 고 개별 곤충 당 섭취 dsRNA 수량 변화를 최소화 합니다. 둘째, 욕조 는 midgut 식의 고갈 효과 하루 17 dsTub lipoplexes (그림 3A)의 지속적인 구강 관리에 하루 9 ~ 60%에서 40%에서 증가를 표시 했다. 16 일에 대 한 벌 거 벗은 dsRNA의 지속적인 젖 통 식의 중요 한 소모 또한 결과 알몸 dsRNA midgut 주스 1 h그림 2(A) 내에서 부 화 ex vivo와 급속 하 게 타락 했다, 비록 midgut(그림 3)에서. 또한, 16 일에 대 한 dsRNA lipoplexes의 지속적인 먹이의 더 긴 기간 RNAi에 의해 눈에 띄는 치명적인 효과 일으킬 수 있는 요건 이다.
Liposome 사업자 ( 재료의 표참조)을 사용 하지만 여기 원래 생체 외에서 transfection DNA의 곤충 세포에 대 한, 아무 문제가 우리의 곤충 모델에서 구두 전달의 dsRNA 차량으로이 liposome 시 약을 적용 했다. 많은 연구 결과 또한 성공적으로 RNAi는 DNA 또는 RNA 분자17,,2021를 위한 다른 liposome 약을 사용 하 여 다른 곤충 종에서 입을의 개선을 설명 했다. 그럼에도 불구 하 고, 곤충에 dsRNA 통풍 관의 메커니즘은 아직 공부 하지 않은 완전히, 그리고 liposome 배달 시스템 셀, 인지질 구조22의 생체 적합성 때문에 dsRNA의 통풍 관을 강화 수 있습니다. 따라서, dsRNA는 리에의 구두 전달 RNases (그림 2)에 의해 저하의 지체 때문에 효율적인 RNAi를 달성 하기 위해 적절 한 전략을 수 있습니다.
이 프로토콜의 1 개의 불리 liposome 캐리어에서 dsRNA의 작은 금액을 될 수 있으며 따라서 지속적인 먹이의 긴 기간을 요구할 수 있습니다. Liposome (0.25 µg:1 µ L)를 dsRNA 사이 같은 특정 비율의 제한은 제조 업체의 제안에 따라 상업 liposome 시 약의 디자인입니다. 더 큰 직경 크기, 나노 입자 liposome의 준비에서 공식 및 lipoplexes 표면에 다른 충전 siRNA와 RNAi 입을 효율23,24의 캡슐화를 증가 보고 있다. 따라서, 다른 liposome 나노 입자 또한 먹이 절차를 개선 하기 위해 사용할 수 있습니다.

RNAi 많은 진핵생물1dsRNA 분자에 의해 트리거되는 post-transcriptional 입을 통로의 메커니즘을 통해 최저의 유전자 발현을 효과적인 방법으로 입증 되었습니다. 연구의 지난 10 년간, RNAi 주사를 통해 특정 유전자의 표현이 없애고 또는 곤충2,3의 다양 한 taxa에 dsRNA의 먹이로 동작을 개발에서 유전자의 기능 연구를 유용한 도구가 되고있다. 특이성 및 고갈 시키는 효과의 견고성, RNAi의 응용 프로그램은 현재 해충 제어 관리4,5에 대 한 잠재적인 전략으로 간주 되고있다. 그러나, RNAi의 효율 대상 다른 유전자 전달 방법에 따라 곤충 종 사이 널리 다릅니다. 증거의 성장 몸은 ribonucleases에 의해 타락은 dsRNA의 불안정 RNAi5,6의 제한 된 효능에 중요 한 요소는 나왔다. 예를 들어, Manduca sexta 에 낮은 RNAi 감도 사실 hemolymph 섞인 dsRNA 신속 하 게 저하 1 시간7에 의해 설명 되어 있다. 유사 하 게, 효율적으로 섭취 dsRNA 저하, midgut에서 알칼리 nucleases의 존재 다른 곤충 순서8,,910낮은 RNAi 효율성과 강하게 상관 된다.
DsRNA의 구두 전달 특히 해충 제어 전략에 RNAi의 응용 프로그램에 대 한 흥미 롭 지만 midgut에 nucleases에 의해 dsRNA의 저하를 지체 하는 방법을 하지 아직 개발 되었습니다, 어떤 효과적인 보장을 했합니다 먹이 통해 RNAi입니다. 그러나, 구두 전달의 dsRNA에 RNAi의 응답 다량 dsRNA, 누에나방에 예를 들어 50 µ g의 먹이 또는 지속적으로 8 일 (총에서 8 µ g dsRNA) 메뚜기 종에서 먹이 보고 되었습니다. 독일 바퀴벌레, Blattella germinica, dsRNA11,12,,1314의 주입에 의해 RNAi에 매우 민감 하지만 먹이 통해 dsRNA에 응답 하지 않습니다. 최근, 린 외. 그는 dsRNA liposome 사업자 결과 최저에 성공적인 RNAi에 α-tubulin 유전자 발현에에서 캡슐화 독일 바퀴벌레15midgut 및 트리거 상당한 사망률 (2017) 증명. DsRNA는 midgut에의 저하는 구두 RNAi에 대 한 제한 요소, liposome 사업자 저하, 쉽게 다른 곤충에 적용 가능한 용기에 강한 nuclease 활동에서 dsRNA를 보호 하기 위해 차량으로 서브. 메모, 특정 transfection 시 약을 선택 하기 위한 이유의 현재 프로토콜에서 liposome 캐리어는 그것 테스트 되었습니다 곤충 세포 선 transfection에 대 한 더 적은 독성으로 사용 ( 재료의 표참조)에 따라에 제조 업체의 지침입니다. Gharavi 외 에 다른 liposome transfection 시스템의 비교에 따르면 (2013) 16, transfecting 작은 간섭 RNA (siRNA)의 효율은 약이 고 다른 곤충17,18 dsRNA 전달 시스템에 사용 된 다른 상용 시스템 사이의 동일 . 또한, 우리의 먹이 방법은 충분히 신중 하 게 각 바퀴벌레에 의해 dsRNA의 적절 한 양을 섭취 하 고 결과 강력 하 고 확인 합니다. 요약 하자면, 현재 프로토콜 및 결과 dsRNA 안정성 향상 dsRNA lipoplexes를 사용 하 여 하는 해충에 대 한 유망한 접근 미래에 RNAi의 전략 구두 납품의 디자인에 문을 열어 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1124px;" width="1123">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent</td>
			<td style="width:133px;">SignaGen</td>
			<td style="width:157px;">SL100499</td>
			<td style="width:481px;">for lipoplexes preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blend Taq plus</td>
			<td style="width:133px;">TOYOBO&#160;</td>
			<td style="width:157px;">BTQ-201</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">4385612</td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">FirstChoice RLM-RACE Kit</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AM1700</td>
			<td>for 3&#39; UTR identification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AMB13345</td>
			<td>for dsRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO DNase</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AM2239</td>
			<td>remove DNA template from dsRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIzol</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">15596018</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RQ1 RNase-Free Dnase</td>
			<td style="width:133px;">Promega</td>
			<td style="width:157px;">M6101</td>
			<td>remove DNA template from total RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C2432</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">I9516</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24102</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">D5758</td>
			<td>for RNase free water preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">glucose solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">G3285</td>
			<td>for lipoplexes preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7653</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P9333</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:352px;">Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M2670</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">EGTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">E3889</td>
			<td>enzyme inhibitor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting scissor</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fine tweezers</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">flexible tweezer</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach holding&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipetman</td>
			<td style="width:133px;">RAININ</td>
			<td style="width:157px;">P10</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:133px;">Axygen</td>
			<td>MCT175C, PCR02C</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">pipette tip&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Axygen</td>
			<td></td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">vortexter</td>
			<td style="width:133px;">Digisystem</td>
			<td style="width:157px;">vm1000</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Minispin centrifuge</td>
			<td style="width:133px;">The Gruffin Group</td>
			<td style="width:157px;">GMC 206</td>
			<td>for liquid spin down&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:133px;">ALC</td>
			<td style="width:157px;">PK121R</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">JENCO</td>
			<td style="width:157px;">6071</td>
			<td>for pH adjust</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">micro-volume spectrophotometer</td>
			<td style="width:133px;">Quawell</td>
			<td style="width:157px;">Q3000</td>
			<td>nucleic acid quantitative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">PCR Thermal cycler</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">2720</td>
			<td>for template PCR or&#160; dsRNA synthesis incubation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quantitative real-time PCR</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">StepOne plus</td>
			<td>gene expression quantitative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:133px;">eppendorf</td>
			<td style="width:157px;">5301</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multipette&#160;</td>
			<td style="width:133px;">eppendorf</td>
			<td style="width:157px;">xstream</td>
			<td>for real-time PCR sample loading&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose I</td>
			<td style="width:133px;">amresco</td>
			<td style="width:157px;">0710</td>
			<td>for nucleic acid electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub gene specfifc forward preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub gene specfifc reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsTub template forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsTub template reverse primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsEGFP template forward preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsEGFP template reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub qPCR forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub qPCR reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">ef1 qPCR forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">ef1 qPCRreverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical use of rna interference: oral delivery of double-stranded rna in liposome carriers for cockroaches

RNA 간섭 (RNAi) 수많은 유전자의 생물 학적 기능을 잠복 근무에 대 한 광범위 하 게 적용 하 고 필수 유전자 발현의 중단에 의해 해충 제어 도구 운영으로 envisaged 되었습니다. 다른 메서드를 주입, 먹이, 및 몸을 담글, 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 배달에 대 한 보고 되었습니다, 비록 구두 전달의 dsRNA 통해 RNAi의 효율은 매우 다른 곤충 집단 변수. 이전에 게시 하는 많은 연구에 의해 표시 된 독일 바퀴벌레, Blattella germanica, dsRNA 주입에 매우 민감한입니다. 현재 연구는 dsRNA liposome 사업자와 캡슐화 midgut 주스 dsRNA의 저하를 지체 시키는 충분 한지 설명 하는 방법을 설명 합니다. 특히, dsRNA 리 크게 캡슐화의 지속적인 먹이 midgut tubulin 식 감소 하 고 바퀴벌레의 죽음에 지도. 결론적으로, 수립 및 활용 dsRNA nucleases에 대 한 보호, dsRNA lipoplexes 수 곤충 해충에 대 한 RNAi의 실제적인 사용을 미래에 있습니다.

DsRNA의 구두 전달 프로토콜의 단순화 된 구조는 그림 1, dsRNA lipoplexes의 준비에 대 한 주요 단계 표시 됩니다에 표시 됩니다.
B. germanica, 비보 전 분석 결과 dsTub lipoplexes midgut 주스 incubated 했다 실시 됐다는 dsRNA의 무결성의 midgut 주스에서 dsRNA 저하 시 liposome 사업자에 의해 주어진 보호를 조사 하기 위하여 이후에 1.5 %agarose 젤에 분석 했다. 그림 2 는 반면 liposome 사업자 비보 전 에서 1 시간 이상 저하에 대 한 dsRNA를 보호 하기 위해 수 있었다 강한 RNA nuclease 활동 midgut 주스의 B. germanica (그림 2A)에 존재 했다 부 화 (그림 2A, B). 그 결과, dsRNA lipoplexes의 구강 섭취 다음 실험에 RNAi midgut 조직의 민감도 증가 하루에 두 번 적용 했다.
DsRNA의 구두 배달을 통해 RNAi 응답의 유효성 검사는 dsRNA (그림 3A)의 지속적인 섭취 후에 다른 시간 지점에서 midgut 욕조 mRNA 식의 소모 효과 측정 하 여 평가 되었다. Midgut는 욕조 식 했다 8 일 동안 dsTub lipoplexes의 지속적인 섭취 후 크게 고갈 된다. DsRNA의 지속적인 먹이 16 일 지속, 하는 동안은 midgut에 욕조 식 했다 크게 고갈 알몸 dsTub 및 dsTub lipoplexes 그룹 (약 24로 60%, 각각) 컨트롤 달리. 그림 3 B 16 일 dsTub lipoplexes의 구강 관리 후 사망률의 일관성, 상당한 증가 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57385/57385fig1.jpg"> 그림 1 : 바퀴벌레에 대 한 dsRNA lipoplexes의 구두 전달의 단순화 된 구조. DsRNA lipoplexes의 준비를 위한 중요 한 단계는 1 단계 4에 대 한 표시 됩니다. 먹이 기법 (5 단계)는 사진에 표시 됩니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57385/57385fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57385/57385fig2.jpg"> 그림 2: 비보 전 여 dsRNA의 B. germanica hemolymph (Hemo) 또는 midgut 주스. (A) 1 벌 거 벗은 또는 liposome cojugated dsTub의 µ g 1 h 염 분 버퍼 및 hemolymph (hemo) 또는 midgut 주스에서 추출 된 효소에 대 한 각각 incubated 했다. 벌 거 벗은 dsTub, 하지만 하지 liposome 활용 된 dsTub은 저하 완전히 midgut 주스 x 1 알을 품을 때. 원래 midgut 주스 (1 x)의 다른 희석 요인 표시 됩니다. 저하는 이온 킬레이트 컨트롤로 EGTA 처리 때문에 의해 저해 되었다. (B) 시간에 따른 보호 liposome 캡슐화 (1 µ g) dsTub 저하 ex vivo hemolymph 또는 midgut 주스에 대 한의. 노트, liposome 활용 된 dsTub는 저하 완전히 24 시간 후 midgut 주스와 함께 알을 품을 때. Hemolymph midgut 주스 외피의 다른 기간에 대 한 원래 농도에서 사용 되었다. 결과 린 외에서 적응. (2017) 12. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57385/57385fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57385/57385fig3.jpg"> 그림 3 : B. germanica에 RNAi 응답 dsRNA의 섭취에 의해의 효과. (A) 양적 실시간 PCR (qRT-PCR) 상대 욕조 식은 midgut 독일 바퀴벌레의 다른 먹이 치료 후 결정. 다른 트리 트 먼 트 식 레벨 주 2에서 포도 당 그룹에 정상화 했다. 값은 3 개의 독립적인 실험에서 평균 ± SE (n = 3), 각각 3-5 생물 복제. 막대에 다른 편지 p 에 큰 차이가 표시 < 0.05 (ANOVA Tukey의 HSD 게시물 특별 테스트에 따라) 다른 치료 그룹 중. 벌 거 벗은 dsTub 또는 dsTub lipoplexes 또는 16 일 (16 d) 8 일 (8 일) 동안 섭취 하는 바퀴벌레의 (B) Survivorship (12 월 15 일 개인의 각 코 호트; n = 3 독립적인 실험). 값은 평균 ± SE 다른 치료 그룹에 편지 p 에 큰 차이가 표시 < 고 survivorship 0.05 (Kruskal-월리스 테스트). 결과 린 외에서 적응. (2017) 12. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57385/57385fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

practical-use-rna-interference-oral-delivery-double-stranded-rna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K 조회수.  National Taiwan University. 이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.

비디오: Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

연구

생물학

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

모기 내장 Metagenomic RNA-seq에 대한 Ribosomal RNA의 고갈

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully annotated genome sequence, transposon-based transgenesis, and effective RNA interference (RNAi). Among these advantages, RNAi-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. T. castaneum show a robust systemic RNAi response, making it possible to perform RNAi at any life stage by simply injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the beetle&#8217;s body cavity.
In this report, we provide an overview of our larval RNAi technique in T. castaneum. The protocol includes (i) isolation of the proper stage of T. castaneum larvae for injection, (ii) preparation for the injection setting, and (iii) dsRNA injection. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides us with quick access to loss-of-function phenotypes, including multiple gene knockdown phenotypes as well as a series of hypomorphic phenotypes. Since virtually all T. castaneum tissues are susceptible to extracellular dsRNA, the larval RNAi technique allows researchers to study a wide variety of tissues in diverse contexts, including the genetic basis of organismal responses to the outside environment. In addition, the simplicity of this technique stimulates more student involvement in research, making T. castaneum an ideal genetic system for use in a classroom setting.

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA interference (RNAi)-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. Here, we provide an overview of our larval RNAi technique in Tribolium castaneum. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides quick access to loss-of-function phenotypes, allowing researchers to study gene functions in diverse contexts.

레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 RNA 간섭,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Production of Double-stranded DNA Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ministrings possess a heightened safety profile and also efficiently deliver DNA cargo to targeted cells. Conventional DNA vectors carry undesirable prokaryotic sequences, including antibiotic resistance genes, CpG motifs, and bacterial origins of replication, which may lead to the stimulation of host immunological responses. The bioavailability of conventional DNA vectors is also compromised due to their larger molecular size. Their circular nature may also impart chromosomal integration, leading to insertional mutagenesis.
Bacterial sequences are excised from DNA minivectors, leaving only the gene of interest (GOI) and necessary eukaryotic expression elements. Our LCC DNA minivectors, or DNA ministrings, are devoid of immunogenic bacterial sequences; therefore improving their bioavailability and GOI expression. In the event of vector integration into the chromosome, the LCC DNA ministring will lethally disrupt the host chromosome, thereby removing the potentially dangerous mutant from the proliferating cell population. Consequently, DNA ministrings offer the benefits of &#39;minicircle&#39; DNA while eliminating the potential for undesirable vector integration events. In comparison to conventional plasmids and their isogenic circular covalently closed (CCC) counterparts, DNA ministrings demonstrate superior bioavailability, transfection efficiency, and cytoplasmic kinetics - they thus require lower amounts of cationic surfactants for effective transfection of target cells.
We have constructed a one-step inducible in vivo system for the production of DNA ministrings in Escherichia coli that is simple to use, rapid, and scalable.

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

이중 가닥 DNA Ministrings의 생산

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA 결합 단백질의 검출에 의해<em&gt; 체외</em지방 세포 문화&gt; RNA 풀다운

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...